用于igf-ⅰ化学发光免疫检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种用于IGF- I (胰岛素样生长 因子I )化学发光免疫检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 胰岛素样生长因子-I (IGF- I )是由70个氨基酸组成的具有内分泌、自分泌及 旁分泌特性的单链多肽，分子量约为7. 5KU，主要由肝细胞合成和分泌，对机体生长发育起 着重要调节作用。人体内多个组织和脏器都表达IGF- I基因，局部组织IGF- I以自分泌 或旁分泌形式产生。它与胰岛素样生长因子-II和胰岛素具有结构同源性。血液循环中的 胰岛素样生长因子-I与胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)和酸性不稳定亚基相结 合，主要以高分子三体聚合物的形式存在。
[0003] 在人体内，生长激素（GH)和营养物的摄入对胰岛素样生长因子-I的合成起刺激 作用。刚出生时血浆中几乎检测不到胰岛素样生长因子-I，儿童期逐步增加，青春期达到 峰值，直到40岁左右开始逐渐下降。女性在怀孕时血浆胰岛素样生长因子-I水平也有所 升高。在诊断生长紊乱时，胰岛素样生长因子-I可作为生长激素分泌的标志物。血浆或 血清胰岛素样生长因子_ I浓度正常，可以作为排除生长激素缺乏的有力证据。胰岛素样 生长因子-I水平偏低提示生长激素缺乏，需作其他检查来明确是否存在生长激素分泌异 常。胰岛素样生长因子_I测量也可用作营养状况的改变。因为酸性不稳定组分和结合蛋 白的存在，使得样本胰岛素样生长因子_ I测量变得复杂。酸处理对于释放胰岛素样生长 因子-I是必需的，以保证准确定量。
[0004] 胰岛素样生长因子-I在临床检测中已逐渐被广泛应用。目前市场上主要的检 测方法有：放射免疫分析法（RIA)、酶联免疫吸附试验法（ELISA)、化学发光免疫分析法 (CLIA)〇
[0005] 其中，放射免疫分析法（RIA)是利用放射性核素的测量方法与免疫反应的基本原 理相结合的一种放射性核素体外检测法。主要原理为加入定量的 1251标记IGF-I(*Ag)与 样本中的未标记IGF- I (即待测抗原）竞争性结合定量的IGF- I抗体（Ab)。如果实验结 果所计量到的结合物（*Ag-Ab)放射活性越高，表示待测物的IGF- I浓度越低。如果所计 量到的结合物放射活性越低，则表示待测物的浓度越高。藉由标准曲线图的分析，可以推算 出待测物的浓度。
[0006] 酶联免疫吸附试验法（ELISA)是指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固 相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。主要原理为 让IGF- I抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。主要方法为用纯化的人胰岛素样 生长因子_ I (IGF- I )抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 胰岛素样生长因子-I (IGF- I )，再与辣根过氧化物酶（HRP)标记的胰岛素样生长因 子-I (IGF- I )抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺（TMB)显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用 下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的胰岛素样生长因子_ I (IGF- I )呈正相关。 用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（0D值），通过标准曲线计算样本中人胰岛素样生长因 子-I (IGF- I )浓度。
[0007] 化学发光免疫分析法（CLIA)是利用化学或生物发光系统作为抗原抗体反应的指 示系统，借以定量检测抗原或抗体的方法，发光物质可直接作为抗原抗体的标记物，也可以 游离形式用于催化剂（酶）和辅助剂标记的抗原或抗体的发光反应中。主要原理为采用针 对IGF- I的一株单克隆抗体标记上标记示踪物，另一株单克隆抗体包被微球。标本、校准 品与发光物标记的抗IGF- I单克隆抗体2,微球包被的抗IGF- I抗体1混匀，形成免疫复 合物，外加磁场沉淀，去掉上清液，用洗液清洗沉淀复合物3次，直接进入标本测量室，仪器 自动泵入化学发光激发物1和2,自动监测3秒钟内发出的相对光强度（RLU)。IGF- I浓度 与RLU成一定的比例关系，测定仪自动拟合计算IGF- I浓度。
[0008] 以上方法中，目前临床上使用最多也最简单快捷的是化学发光免疫分析法。市场 流通的主要生产厂家有西门子和Liasion。两厂家在方法学设置上基本一致，均为一株针对 IGF- I的单克隆抗体标记发光物，另一株针对IGF- I的单克隆抗体包被固相载体。在检测 时，需要将样本加入一定比例酸性处理剂进行自动预稀释处理后，方可上机检测（其中，西 门子的检测试剂盒中自动预稀释比例为1:10, Liasion的检测试剂盒中自动预稀释比例为 1:20)〇
[0009] 但是，此种方法存在多种问题：首先，由于样本在检测前均要进行预稀释，结果计 算时又将结果乘以稀释倍数得到最终的IGF- I浓度，所以少数低值样本无法检测到其确 切值，并且，稀释可能会对一些样本的检测准确性和重复性带来不良影响。其次，在上述试 剂盒中样本预处理中并未进行温育，可能存在部分样本中IGF-I释放不充分的风险。
【发明内容】
[0010] 基于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种酸性处理剂，采用该酸 性处理剂，无需在检测时对样本进行预稀释，能够准确和可靠的检测低浓度范围的样本。
[0011] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
[0012] 一种酸性处理剂，主要由浓度为0. l-o. 5mol/L的有机酸溶液和浓度为 0. 01-0. lmol/L的无机酸溶液混合而成，或为浓度为0. 3-2mol/L的有机酸溶液，该酸性处 理剂的pH值为1. 5-3. 5。
[0013] 本发明人通过大量研宄实验考察后发现，常规技术中需要将样本进行稀释，是因 为在样本中，游离的胰岛素样生长因子I (IGF- I )很少，大部分IGF- I是与胰岛素样生 长因子结合蛋白（IGFBP)紧密结合，必须通过酸性溶液处理才可使二者分离。为了将所有 的IGF- I释放出来，需要加入过量的酸剂处理，而由于受到加入盐酸的量所限制，只能将 样本稀释，使加入的盐酸足以将所有IGF- I释放，才能满足检测要求。
[0014] 并且，也不能简单通过提高盐酸含量来达到避免稀释样本的目的，一方面是由于 当盐酸浓度过高时，其挥发性也相应较大，对仪器有较高要求，且可能会对检测准确性造成 一定影响；另一方面来说，当盐酸浓度过高时，过强的酸性会对样本造成不良影响，从而降 低了检测的准确性。
[0015] 而本发明的酸性处理剂，是高摩尔浓度有机酸和低摩尔浓度无机酸的混合酸溶 液，使有机酸和无机酸相配合，或单独使用高摩尔浓度有机酸溶液；利用有机酸的生物性， 及更容易与一些有机物接触的性质，使有机酸缓和地将IGF- I从IGFBP上释放，也可以加 入少量的无机酸提供必需的氢离子，以补充酸度。二者相互配合或单独使用高摩尔浓度的 有机酸溶液都可以很好的分离样本中的IGF- I与IGFBP，无需将样本稀释，就可完全释放 其中的IGF- I，达到检测要求。从而能够准确和可靠的检测各浓度范围、特别是低浓度范 围的样本。样本可以为以下类型中的任何一种：分离胶（含促凝剂）采血管、普通含促凝剂 采血管、空白无添加剂采血管等采血后分离的血清，肝素抗凝管、EDTA抗凝管、柠檬酸钠抗 凝管等采血后分离的血浆。
[0016] 在其中一个实施例中，所述有机酸溶液：所述有机酸和一元无机酸的摩尔比为 5-20:1 ;或所述有机酸和二元无机酸的摩尔比为2. 5-10:1 ;或所述有机酸和三元无机酸的 摩尔比为1. 6-6. 6:1。所述一元无机酸指盐酸、氯酸等一个分子能电离出一个氢离子的无机 酸，所述二元无机酸指硫酸等一个分子能电离出两个氢离子的无机酸，所述三元无机酸指 磷酸等一个分子能电离出三个氢离子的无机酸。将有机酸和无机酸按照上述比例配合，具 有更好的IGF- I释放效果。可以准确检测出低、中浓度样本值。
[0017] 在其中一个实施例中，所述有机酸和一元无机酸的摩尔比为7-13:1;或所述 有机酸和二元无机酸的摩尔比为3. 5-6. 5:1;或所述有机酸和三元无机酸的摩尔比为 2. 3-4. 3:1。可以准确检测出低、中、高浓度样本值。
[0018] 在其中一个实施例中，所述有机酸为甲酸、乙酸、苯甲酸、乙二酸、丁二酸、苹果酸、 柠檬酸、水杨酸中的至少一种。
[0019] 在其中一个实施例中，所述无机酸为硫酸、盐酸、硝酸、氢氟酸、氯酸、亚硫酸、亚硝 酸中的至少一种。
[0020] 本发明还公开了一种待测样本的预处理方法，采用上述的酸性处理剂，将样本 与所述酸性处理剂按照0. 2-2:1的体积比混合，得到待测溶液，该待测溶液的pH值为 2. 0~4, 0〇
[0021] 在其中一个实施例中，将样本与所述酸性处理剂混合后，还将待测溶液在30-40°C 下温育3-7分钟。通过温育的方式，可以更好更快的将IGF- I从IGFBP上释放，得到游离 IGF- I，提高了在较短时间内对高浓度范围样本的检测准确性。
[0022] 本发明还公开了一种IGF- I化学发光免疫检测试剂盒，包括以下组分：
[0023] 1)酸性处理剂：上述的酸性处理剂；
[0024] 2)磁性微球体系：包括直接连接或间接连接抗胰岛素样生长因子I抗体1的磁性 微球；
[0025] 3)标记物体系：包括直接连接或间接连接标记示踪物的抗胰岛素样生长因子I 抗体2 ;
[0026] 所述抗胰岛素样生长因子I抗体1和抗胰岛素样生长因子I抗体2的针对位点互 不相同。
[0027] 上述"直接连接"为直接结合的连接，上述"间接连接"为通过生物素和链霉亲和 素，或异硫氰酸荧光素和抗异硫氰酸荧光素抗体等能够相互结合的搭桥物以间接结合的方 式连接。其中抗体1和抗体2既可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体，也可以互换标记 示踪物进行使用，均不影响其在双抗夹心法中的检测效果。
[0028] 适用于本发明的磁性微球也称为磁珠或磁球，可以是本领域中常用的磁性微球。 优选的是，本发明使用的磁球，是将纳米级的Fe 203或Fe 304磁性粒子和有机高分子材料进行 复合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作 用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为