用于hiv检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种用于HIV(人类免疫缺陷病 毒）检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] HIV病毒（人类免疫缺陷病毒）侵入人体后，其表面糖蛋白gpl20与细胞表面受 体蛋白CD4以高亲和力结合，吸附到宿主细胞上；gpl20再与宿主细胞表面辅助受体相互作 用，使病毒与宿主细胞膜更接近；gp41产生一系列构象变化，其N端的融合肽片段插入宿主 细胞膜，导致病毒包膜与细胞膜的最终融合，病毒RNA进入细胞。在HIV感染后，最先能够 监测到病毒RNA、然后是病毒的p24抗原，最后是抗体。根据HIV基因结构、免疫学和流行病 学的特征，HIV被划分为HIV-1和HIV-2两大类。HIV-1的感染力较强，是当今世界HIV流 行的主要病毒株。
[0003] 目前检测HIV的方法有100多种，总体来说可以分为抗体检测和病毒检测两大类。 病毒检测包括细胞培养（病毒分离）、p24抗原检测和病毒核酸检测。早期对HIV的诊断主 要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体，间接地诊断HIV感染。抗体通常是在感染后3~ 8周能够被检测出来。超过70%的HIV感染者在感染6个月后才能检测出抗体，在同性恋 群体中，这个数字超过80 % ;另外，新生儿产生抗HIV抗体一般在出生1年后，来自母体的 抗HIV抗体易造成新生儿假阳性；单纯检测抗体方法增加了 HIV "窗口期"传播的危险性。 抗原能够在个体感染后先于血清转化2~18d被检测到。因此，在血清转化期通过检测p24 抗原有着很大的优势，可以作为早期辅助诊断HIV感染的一种方法。
[0004] 但是，常规使用的p24抗原检测存在灵敏度较低的问题。如单独P24抗原检测试 剂的检出水平大约是10pg/mL，联合检测的p24抗原检出水平更是达不到单独检测水平。但 既使在病毒活跃复制的时候，血清中的抗原量也很少达到这个水平。并且，常规使用化学发 光免疫法检测HIV时，常出现假阴性和假阳性，致使HIV诊断结果的不准确性，出现漏诊或 误诊，后果十分严重。
【发明内容】
[0005] 基于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种用于HIV检测的酸性 处理剂，采用该酸性处理剂对样本进行预处理，能够提高HIV的检测灵敏度。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
[0007] -种用于HIV检测的酸性处理剂，主要由浓度为0. 1-1.Omol/L的有机酸溶液和浓 度为0.01-0.lmol/L的无机酸溶液混合而成，或为浓度为0.1-1. 2mol/L的有机酸溶液，该 酸性处理剂的pH值为2. 5-4. 5。
[0008] 本发明人通过大量研宄实验考察后发现，常规技术中p24抗原检测灵敏度低的原 因，是HIV感染者血清中的p24抗原一般都与抗p24抗体结合成为复合物，而检测方法本身 是不能检测抗原抗体复合物的，需要将复合物解离才能够被检测。但是，在复合物解离的时 候，需要通过酸性溶液处理才可使P24抗原和抗p24抗体解离，为了将所有的p24抗原释放 出来，需要加入过量的酸剂处理或高温加热样本，而如只加入盐酸等无机酸，由于受到加入 盐酸的量所限制，只能将样本稀释，使加入的盐酸足以将所有P24抗原释放，才能满足检测 要求。但是，样本被稀释后就极大的降低检测灵敏度。而高温加热样本来释放P24抗原，又 可能对生物样本产生不良影响。
[0009] 并且，也不能简单通过提高盐酸含量来达到避免稀释样本的目的，一方面是由于 当盐酸浓度过高时，其挥发性也相应较大，对仪器有较高要求，且可能会影响抗原或抗体的 活性，对检测准确性造成一定影响；另一方面来说，当盐酸浓度过高时，过强的酸性会对样 本造成不良影响，从而降低了检测的准确性。
[0010] 而本发明的酸性处理剂，是高摩尔浓度有机酸和低摩尔浓度无机酸的混合酸溶 液，使有机酸和无机酸相配合，或单独使用高摩尔浓度有机酸溶液；利用有机酸的生物性， 及更容易与一些有机物接触的性质，使有机酸缓和地将P24抗原释放，也可以加入少量的 无机酸提供必需的氢离子，以补充酸度。二者相互配合或单独使用高摩尔浓度的有机酸溶 液都可以很好的分离样本中的P24抗原与抗p24抗体，无需将样本稀释，就可完全释放其中 的P24抗原，达到检测要求。从而能够提高检测灵敏度。
[0011] 在其中一个实施例中，所述有机酸和一元无机酸的摩尔比为1-20:1 ;或所述 有机酸和二元无机酸的摩尔比为0.5-10:1 ;或所述有机酸和三元无机酸的摩尔比为 0. 3-6. 6:1。所述一元无机酸指盐酸等一个分子能电离出一个氢离子的无机酸，所述二元无 机酸指硫酸等一个分子能电离出两个氢离子的无机酸，所述三元无机酸指磷酸等一个分子 能电离出三个氢离子的无机酸。将有机酸和无机酸按照上述比例配合，具有更好的P24抗 原释放效果。
[0012] 在其中一个实施例中，所述有机酸和一元无机酸的摩尔比为7-13:1 ;或所述 有机酸和二元无机酸的摩尔比为3. 5-6. 5:1 ;或所述有机酸和三元无机酸的摩尔比为 2. 3~4, 3:1 〇
[0013] 在其中一个实施例中，所述有机酸为乙酸、苯甲酸、乙二酸、丁二酸、苹果酸、柠檬 酸、水杨酸中的至少一种。
[0014] 在其中一个实施例中，所述无机酸为硫酸、盐酸、硝酸、氢氟酸、亚硫酸、亚硝酸中 的至少一种。
[0015] 在其中一个实施例中，该酸性处理剂还包括缓冲液，所述缓冲液为甲酸盐缓冲液、 醋酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硫酸盐缓冲液、硝酸盐 缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液中的至少一种。使用缓冲液，能够减少 试剂组份和样本中的待测物受酸的冲击的能力。
[0016] 本发明还公开了一种HIV待测样本的预处理方法，采用上述的酸性处理剂，将待 测样本与所述酸性处理剂按照〇. 5-5:1的体积比混合，得到待测溶液。
[0017] 在其中一个实施例中，将待测样本与所述酸性处理剂混合后，还将待测溶液在 20-60°C下温育1-30分钟，优选20-40°C下温育1-10分钟，更优选在30-40°C下温育3-7分 钟。通过温育的方式，可以更好更快的将P24抗原和抗p24抗体分离，得到游离p24抗原。
[0018] 本发明还公开了一种HIV检测试剂盒，包括以下组分：
[0019] 1)酸性处理剂：上述的酸性处理剂；
[0020] 2)磁性微球体系：包括直接连接或间接连接HIV重组抗原1的磁性微球，和/或 直接连接或间接连接抗HIV抗体A的磁性微球；
[0021] 3)标记物体系：包括相应的直接连接或间接连接标记示踪物的HIV重组抗原2,和 /或直接连接或间接连接标记示踪物的抗HIV抗体B ;
[0022] 所述HIV重组抗原1和HIV重组抗原2与待测抗体结合的位点互不相同，所述抗 HIV抗体A和抗HIV抗体B与待测抗原结合的位点互不相同。
[0023] 上述"直接连接"为直接结合的连接，上述"间接连接"为通过生物素和链霉亲和 素，或异硫氰酸荧光素和抗异硫氰酸荧光素抗体等能够相互结合的搭桥物以间接结合的方 式连接。其中抗体A和抗体B既可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体，均不影响其检测 效果。
[0024] 上述检测试剂盒中，既可以使用HIV重组抗原系统来检测HIV抗体，或使用抗HIV 抗体系统来检测HIV抗原，也可以同时使用HIV重组抗原系统和抗HIV抗体系统来同时检 测HIV抗体和HIV抗原（如HIV p24抗原），可以提高检测灵敏度。
[0025] 并且，上述磁性微球体系中，所述连接标记示踪物的HIV重组抗原2中，HIV重组 抗原1的工作浓度优选1-20 y g/mL，磁性微球的工作浓度优选0. 1-5. 0 % ;所述连接抗HIV 抗体A的磁性微球中，抗HIV抗体A的工作浓度优选1-20 y g/mL，磁性微球的工作浓度优选 0. 1-5. 0%。上述标记物体系中，所述连接标记示踪物的HIV重组抗原2中，HIV重组抗原 2的工作浓度优选2-20 y g/mL，标记示踪物的工作浓度优选0. 1-lmg/L ;所述连接标记示踪 物的抗HIV抗体B中，抗HIV抗体B的工作浓度优选2-20 y g/mL，标记示踪物的工作浓度优 选 0? 1-lmg/L。
[0026] 适用于本发明的磁性微球也称为磁珠或磁球，可以是本领域中常用的磁性微球。 优选的是，本发明使用的磁球，是将纳米级的Fe 203或Fe 304磁性粒子和有机高分子材料进行 复合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作 用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中，所述有机