低过敏原的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用作低过敏原的突变体多肽。更具体地，本发明提供了突变体Bet?v1蛋白以及此类多肽用作用于使桦树花粉过敏脱敏的低过敏原的用途。此外，本发明提供了包含此类多肽的疫苗制剂；此类制剂的用途；以及抵抗桦树花粉过敏而进行免疫接种的方法。
【专利说明】低过敏原
发明领域
[0001]本发明涉及用作低过敏原的突变体多肽。更具体地，本发明涉及突变体Bet Vl蛋白以及此类多肽作为用于使桦树花粉过敏脱敏的低过敏原的用途。此外，本发明还涉及包含此类多肽的疫苗制剂；此类制剂在免疫接种中的用途；以及抵抗桦树花粉过敏而进行免疫接种的方法。
[0002]发明背景
[0003]过敏由对通常无害的蛋白质、过敏原的免疫反应引起。过敏性病在世界范围内正在达到流行病的比例。工业化国家超过25%的人口患有I型过敏并且数量正在稳定增加。 桦树花粉过敏是I型过敏的非常常见的形式。Bet Vl是桦树花粉的主要过敏原。更多关于 Bet vl过敏原、其异构过敏原和变体的信息,见于WHO网站www.allergen, org。
[0004]I型过敏基于免疫球蛋白E(IgE)抗体的形成，当过敏原分子结合两个结合至肥大细胞或嗜碱细胞表面上的受体的IgE抗体并且诱导IgE-Fc e RI复合物的交联时，症状发生。这触发了生物介质(例如组胺和引起炎症反应和症状(例如过敏性哮喘、鼻炎、食物和皮肤过敏以及甚至过敏性反应)的脂质介质)的脱粒。
[0005]IgE是由两个相同轻链和重链组成的大分子。在IgE的重链中存在5个结构域:VH、C e 1、C e 2、C e 3和C e 4。完整IgE分子的大小为约200kDa。结合至其 Fe e RI受体的C e 2-C e 4片段以及C e 2-C e 4片段的晶体结构已被测定(Garman等人，Nature2000 (406): 259-266，和 Wan 等人，Nature Immunology, 2002 (3): 681-686)。
[0006]最近几年，已测定了大量不同过敏原的三维结构。在结构上，这些过敏原变化相当大，并且还未鉴定出可解释过敏原引起IgE抗体产生的共同结构基序。然而，有研究表明过敏原性仅限于少数蛋白质家族，从而提出蛋白质的结构特征也可在过敏原性方面起作用的证据(Rouvinen 等人，PloS 0NE2010 (5): e9037 ;Raudauer 等人，J Allergy Clin Immunol.2008(121):847-852)。
[0007]Niemi等人最近的出版物，Structure2007 (15): 1413-21公开了与P -乳球蛋白 (BLG)复合的IgE Fab片段的晶体结构。其还显示了两个IgE/Fab分子是如何结合二聚体 BLG的以及当与已知IgG表位结构相比较时IgE表位是不同的，为位于P折叠区中的“扁
平”表面。
[0008]今天所有过敏性症状的治疗的趋势是向着使用过敏原-特异性脱敏作用而非避免过敏原进行耐受性的主动诱导，所述避免过敏原通常是不可能的或仅仅治疗症状。目前的脱敏疗法基于从天然来源纯化的过敏原，其中批次间变化可导致与发现和维持治疗的正确剂量和功效相关的问题。这些问题可导致过敏性副作用和对新过敏原的致敏作用的潜在风险。
[0009]重组过敏原用于脱敏的用途将消除与批次间变化相关的不利方面，并且最早的重组过敏原处于临床试验中(Valenta等人，Annu Rev Immunol2010 (28): 211-41)。这样的过敏原在临床中的效率从而仍待观察。一些修饰重组过敏原已被报导。
[0010]国际专利公布W002/40676和W003/096869公开了桦树花粉过敏原Bet vl的许多突变体形式。这些突变体通过在基于Bet vl多肽的保守表面结构的序列分析的假定的IgE结合位点引入随机突变来产生。WO 03/096869公开了过敏原表面上的不同“小簇(group)”上的4个主要突变的用途。
[0011]国际专利公布W02007/073907公开了在氨基酸位置54、115或123上包含3个氨基酸置换或缺失的Bet vl多肽。没有证据表明这些突变体具有减小的组胺释放能力。
[0012]国际专利公布WO 2009/024208公开了在氨基酸100-125的区域中具有至少4个突变的Bet vl突变体。然而，由于所述突变，多肽的三维结构丧失了，并且无报导的活性。
[0013]国际专利公布WO 2008/092992公开了通过修饰非连续致敏性表位(即致敏性物质上具有600-900人的区域的扁平表面)上的氨基酸残基来阻断致敏性物质的I型表面相互作用的方法，并且提示可相应地制备低过敏原性桦树花粉蛋白。
[0014]存在对安全高效的疫苗和治疗产品的公认和巨大的需要，以应对日益增加的过敏医疗问题。目前，对过敏的安全高效的疗法的市场开发不足。
[0015]发明概述[公开内容]
[0016]本发明涉及基于SEQ ID NO: 4中所示的野生型氨基酸序列或其任何其它Bet vl野生型同种型的重组桦树花粉Bet vl多肽，所述多肽在选自氨基酸残基101、137、99、80、82、84、117、119、7、9、133、141和145的位置上包含至少一个氨基酸置换。
[0017]在优选的实施方案中，至少一个氨基酸置换位于选自氨基酸残基E101、K137、S99、K80、N82、S84、S117、K119、T7、T9、V133、E141 和 R145 的位置。
[0018]在具体实施方案中，`根据本发明的多肽由选自SEQ ID NO:4-39的氨基酸序列表
/Jn ο
[0019]在一个实施方案中，根据本发明的多肽具有位于氨基酸位置101、137或99(优选E101、K137或S99)处的氨基酸置换。
[0020]在本发明的一个实施方案中，所述置换是S99被酪氨酸替代，在另一个实施方案中，所述置换是K137被酪氨酸替代。在其它实施方案中，所述置换是ElOl被赖氨酸替代。
[0021]根据本发明的低过敏原性多肽具有当与Bet vl野生型的组胺释放能力相比较时降低至少20倍的组胺释放能力。在一个实施方案中，多肽的组胺释放能力降低至少100倍。
[0022]本发明还涉及包含至少一种根据本发明的低过敏原性多肽的疫苗。
[0023]在本发明的一个实施方案中，所述疫苗用于舌下施用。
[0024]本发明还涉及基于SEQ ID NO:4中所示的野生型氨基酸序列或其任何Bet vl野生型变体的重组桦树花粉Bet vl多肽作为疫苗的用途(单独地或与至少一种药学上可接受的佐剂组合)，所述多肽在选自氨基酸残基E101、K137、S99、K80、N82、S84、S117、K119、T7、T9、V133、E141和R145的位置上包含至少一个氨基酸置换。
[0025]本发明还涉及抵抗桦树花粉过敏而进行免疫接种的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用包含至少一种根据本发明的低过敏原性多肽和至少一种药学上可接受的佐剂的组合物。
[0026]本发明还涉及基于SEQ ID NO:4所示的野生型氨基酸序列或任何其它Bet vl野生型同种型的重组桦树花粉Bet vl多肽用作疫苗，所述多肽在选自氨基酸残基101、137、99、80、82、84、117、119、7、9、133、141和145的位置上包含至少一个氨基酸置换。
[0027]附图概述[0028]在下文中，参考附图通过优选实施方案将更详细地描述本发明，其中
[0029]图1举例说明实施例1中衍生的Bet vl的第一假定表位；
[0030]图2举例说明实施例1中衍生的Bet vl的第二假定表位；
[0031]图3是Bet vl的36个同种型的氨基酸序列比对；
[0032]图4是用于产生重组过敏原的细菌表达单位的示意图,其中Ptac是启动子，PelB SS是连接于重组过敏原的编码区的信号序列，星号显示氨基酸置换位置；
[0033]图5显示实施例2中使用的Bet vl野生型多肽(A)、S99Y多肽⑶、K137多肽(C) 和ElOlK多肽的核酸序列(SEQ ID N01-3)；
[0034]图6显示重组Bet vl、Bet vlS99Y和ElOlK多肽对血清IgE与Bet vl结合的竞争性抑制；
[0035]图7显示利用重组Bet vUBet vlS99Y和K137Y多肽的组胺释放实验的结果；和
[0036]图8显示浓度为3 ii M的重组Bet vl野生型和重组Bet vl突变体ElOlK的天然 ESI FT-1CR 质谱。
[0037]发明详述
[0038]在下列描述、实施例和权利要求中，三字母和单字母代码用于氨基酸。为了命名根据本发明的多肽中的氨基酸位置，使用下列代码:S99表示位置99上的丝氨酸，然而S99Y 表示位置99上的丝氨酸被酪氨酸替代。
[0039]桦树花粉过敏是过敏的非常常见的形式，白桦树(抚皮桦(Betula verrucosa)) 的花粉是欧洲和北美的I型过敏反应的主要原因之一。据估计约10-15%的人口可患有桦树花粉过敏。此外，其它过敏原例如苹果过敏原与桦树花粉特异性IgE交叉反应，从而即使当受试者未接触`花粉时亦引起过敏反应。
[0040]Bet vl是桦树花粉的主要过敏原,其在超过95%的桦树花粉过敏性受试者中负责 IgE结合。Bet vl是具有17kD的分子量的蛋白质。野生型Bet vl的氨基酸序列示于SEQ ID NO:4中。WHO过敏原网站(www.allergen, org)列出了 Bet vl的三十六个(36)同种型，图3显示了所述同种型的序列比对。比对显示Bet vl是高度保守的。在本发明中用作野生型Bet vl的同种型是同种型Bet via (Bet vl.0101),但这些异构过敏原的任一种均可用于提供根据本发明的低过敏原性变体。野生型序列(SEQ ID NO:4)意欲包括全部Bet vl同种型序列。
[0041]全部36个Bet vl同种型的氨基酸序列如下分别地公开于序列表中:1.0101 (SEQ ID NO:4)、1.0102 (SEQ ID NO: 5)、1.0103 (SEQ ID NO:6)、1.2501 (SEQ ID NO:7),1.1501 (SEQ ID N0:8)、1.1502 (SEQ ID NO:9)、1.2801 (SEQ ID NO:10)、1.3001 (SEQ ID NO:11), 1.2901 (SEQ ID NO: 12)、1.2301 (SEQ ID NO:13)、1.0501 (SEQ ID NO:14)、1.0601 (SEQ ID NO:15)、1.0602(SEQ ID NO:16)、1.0801 (SEQ ID NO:17)、1.1701 (SEQ ID NO:18), 1.0401 (SEQ ID NO:19),1.04020801 (SEQ ID NO:20)、1.07010801 (SEQ ID N0:21)、 1.10010801 (SEQ ID NO:22)、1.24010801(SEQ ID NO:23)、1.26010801 (SEQ ID NO:24)、 1.27010801(SEQ ID NO:25)、1.22010801(SEQ ID NO:26)、1.02010801(SEQ ID NO:27)、 1.09010801(SEQ ID NO:28)、1.03010801 (SEQ ID NO:29)、1.14010801(SEQ ID NO:30)、 1.14020801(SEQ ID NO:31)、1.19010801(SEQ ID NO:32)、1.20010801 (SEQ ID NO:33)、 1.18010801(SEQ ID NO:34)、1.11010801(SEQ ID NO:35)、1.12010801(SEQ ID NO:36)、1.16010801(SEQ ID NO:37)、1.21010801(SEQ ID NO:38)和 1.13010801(SEQ ID NO:39)。
[0042]Bet vl的同种型包括具有不同的致敏性潜能的变体。Bet vl的同种型与SEQ IDN0:4的Bet vl野生型氨基酸序列具有至少94%的同一性。例如，与Bet vl.0101具有96%的氨基酸残基同一性的同种型Bet vl.0401和与Bet vl.0101具有至少94%的残基同一性的Bet vl.1001已被鉴定为天然低过敏原，因为它们是介质释放的弱诱导物。
[0043]本发明提供了 Bet Vl的突变的低过敏原性变体，其用作疫苗用于免疫接种有此需要的受试者，从而预防和/或减轻过敏和使患有桦树花粉过敏的受试者脱敏。根据本发明的重组桦树花粉Bet vl多肽具有突变的野生型氨基酸序列从而在选自氨基酸残基E101、K137、S99、K80、N82、S84、S117、K119、T7、T9、V133、E141 和 R145 的位置上包含至少一个氨基酸置换。根据本发明的多肽是低过敏原性的，并且当与未突变的Bet vl野生型的组胺释放能力相比较时显示降低至少20倍，优选100倍的组胺释放能力。
[0044]根据本发明的低过敏原性多肽可用作抗过敏特别是桦树花粉过敏的疫苗。按照本领域技术人员已知的标准制药方案配制包含根据本发明的多肽的疫苗。根据本发明的疫苗特别适合于舌下施用。优选地，本发明的疫苗组合物包含至少一种本发明的重组低过敏原性Bet vl多肽和至少一种药学上可接受的稀释剂或佐剂例如盐水、缓冲液、氢氧化铝等。
[0045]根据本发明的低过敏原性变体通过突变位于Bet vl的表位表面上的一些(1-5)特定氨基酸残基(例如具有大侧链的残基)而获得。选择的氨基酸残基是其侧链向外指向溶剂的那些氨基酸残基。突变此类残基导致过敏原的基本三维结构的最小改变。优选地，然而，诱变修饰表位表面的程度使得肥大细胞表面上的IgE抗体的结合和交联被阻止或强烈减少，然而变体的总体结构仍然与野生型过敏原的总体结构十分相似。这样的突变有利于IgG和具有结合野生型过敏原和突变体变体过敏原的能力的其它保护性抗体的诱导。突变的作用被确定为过敏原特异性IgE抗体对经修饰的Bet vl过敏原的更低亲和力。优选地，突变使特异性IgE抗体的亲和力减小至少20倍，更优选20-100倍，最优选超过100倍。所产生的经修饰的Bet vl过敏原`可用于诱发过敏性患者对桦树花粉的耐受性。
[0046]可用于过敏原特异性脱敏的根据本发明的低过敏原性变体多肽具有两个特征:1)强力减弱IgE介导的反应的能力；和2)保持的野生型3D折叠，从而保持诱导能够结合wt过敏原的IgG抗体的产生的能力。
[0047]IgE结合表位的结构的知识将极大地简化低过敏原性变体的设计。然而，与IgE抗体复合的Bet vl的结构不幸地是不可获得的。在表位扫描中使用肽也是不可靠的并且实际上仅当扫描线性表位时才有用(Niemi等人，Structure2007 (15): 1413-21)。单个肽的构象以及物理性质例如溶解度可与形成天然蛋白质结构的多肽链的对应部分的构象以及物理性质显著不同。因此，突变体Bet vl过敏原的设计是基于使用分子图形学程序例如PyMOL的分子表面分析，以通过制备和测试突变体来阐明表位的结构和测试潜在命中。
[0048]Bet vl(蛋白质数据库代码1BV1)的晶体结构用于定义Bet vl的四级结构。TOBePISA互联网服务器用于建立Bet vl的对称二聚体的坐标。据估计肥大细胞表面上的簇中的IgE抗体之间的距离为约5nm(KnoI, EF ;Mol.Nutr.Res.50 (2006):620)。通过研究距离对称轴2.5nm内的围绕二重对称轴的Bet vl 二聚体的分子表面，在Bet vl的分子表面上鉴定了两个假定的表位(图1和图2)。
[0049]假定的表位I 由氨基酸残基 V2-E6 ；R70-D75 ;N78_S84 ;E96_K103 和 K115-H121 构成，而假定的表位2由氨基酸残基F3-V12 ；A130-L152和T107-D109构成。
[0050]仔细分析这些假定的表位，以鉴定可作为突变点的氨基酸残基。优选的突变点应当具有减小过敏原对IgE抗体的结合但仍然维持野生型过敏原的三维结构的能力。第一假定表位包括氨基酸残基K80、N82、S84、S99、E101、S117和K119。第二假定表位包括残基17、 T9、V133、K137、E141和R145。残基S99、ElOlK和K137被认为是最有趣的突变点，因为它们位于两个假定表位的中心。
[0051]这3个残基在Bet vl的全部36个同种型中是高度保守的，唯一的变化是残基99， 其存在为丝氨酸(在24个同种型中)或半胱氨酸(在12个同种型中)。残基80、84、119、 141和145是保守的，然而残基82、117、7、9、133略微变化，如图3中显示的。
[0052]下一步骤是选择每一个残基的适当突变。作为实例，S99 (在表位I中)是小的亲水性和中性氨基酸残基。将干扰IgE结合的突变从而具有“相反的”性质，即大的和/或带电荷的，例如Phe、Asp、Glu、Lys、Arg、Tyr、His或Trp。类似地,表位I中的ElOl可被带相反电荷的残基(Lys，Arg)或疏水性残基(Tyr，Trp，Phe，Val，Ile或Leu)替代。作为第二实例，K137(表位2中的)的侧链是长的，柔性和带正电荷的。至更小的残基的突变不可能是有帮助的，因为其由于自由空间的原因不会阻止对抗体的结合。K137从而被带负电荷的残基Asp、Glu或刚性大的残基例如Trp、Tyr、Phe、Ile或Met置换。
[0053]可相应地分别设计残基1(80、胳2、5843101、5117和K119以及残基17、T9、V133、 E141和R145上的置换。表1列出了潜在的置换，所述置换可产生根据本发明的Bet vl低过敏原性突变体。
[0054]表1
[0055]
【权利要求】
1.一种基于SEQ ID NO:4中所示的野生型氨基酸序列或任何其它Bet vl野生型同种型的重组桦树花粉Bet vl多肽，所述多肽在选自氨基酸残基101、137、99、80、82、84、117、119、7、9、133、141和145的位置上包含至少一个氨基酸置换。
2.权利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列选自SEQID N0:4至39。
3.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽包含选自SEQID N0:41-53的氨基酸序列或其同种型。
4.权利要求1-3的任一项的多肽，其中所述多肽包含选自如下序列的氨基酸序列: SEQ ID N0:41，其中氨基酸101是K， SEQ ID NO:42，其中氨基酸137是K， SEQ ID NO:43，其中氨基酸99是K， SEQ ID NO:44，其中氨基酸80是Y， SEQ ID NO:45，其中氨基酸82是K， SEQ ID NO:46，其中氨基酸84是K， SEQ ID NO:47，其中氨基酸117是K， SEQ ID N0:48，其中氨基酸119是E， SEQ ID N0:49，其中氨基酸7是E， SEQ ID NO: 50，其中氨基酸9是E， SEQ ID NO:51，其中氨基酸133是Y， SEQ ID NO: 52，其中氨基酸141是K，和 SEQ ID NO: 53，其中氨基酸145是Y， 或它们的同种型。
5.权利要求1-4的任一项的多肽，其中所述氨基酸置换位于氨基酸位置101、137或99上。
6.权利要求5的多肽，其中S99被酪氨酸替代。
7.权利要求5的多肽，其中K137被酪氨酸替代。
8.权利要求5的多肽，其中ElOl被赖氨酸替代。
9.权利要求1-8的任一项的多肽，其具有当与野生型Betvl的组胺释放能力相比较时降低至少20倍的组胺释放能力。
10.权利要求9的多肽，其中组胺释放能力的降低为至少100倍。
11.前述权利要求的任一项的多肽，其中总共存在至少2、3或4个氨基酸置换。
12.一种包含至少一种权利要求1-11的任一项的低过敏原性多肽的疫苗。
13.根据权利要求12的疫苗，其特征在于所述疫苗用于舌下施用。
14.基于SEQID NO:4中所示的野生型氨基酸序列或其任何Bet vl野生型变体的重组桦树花粉Bet vl多肽的作为疫苗的用途，所述多肽在选自氨基酸残基ElOl、K137、S99、K80、N82、S84、S117、K119、T7、T9、V133、E141和R145的位置上包含至少一个氨基酸置换。
15.一种抵抗桦树花粉过敏而进行免疫接种的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用组合物，所述组合物包含根据权利要求1-11的任一项的至少一种低过敏原性多肽和至少一种药学上可接受的 佐剂。
16.一种基于SEQ ID NO: 4中所示的野生型氨基酸序列或任何其它Bet vl野生型同种型的重组桦树花粉Bet vl多肽，所述多肽在选自氨基酸残基101、137、99、80、82、84、117、`119、7、9、133、141和145的位置上包含至少一个氨基酸置换，所述多肽用作疫苗。
【文档编号】C12N15/29GK103562388SQ201280023847
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年4月18日 优先权日:2011年4月18日
【发明者】K·塔基宁, M·L·劳卡宁, H·瑟德隆德, S·于尔海, H·霍尔克里, M·尼米, J·罗威宁 申请人:国家技术研究中心Vtt