裂殖壶菌诱变方法及其产生的变异株的制作方法
【专利摘要】本申请提供了新的裂殖壶菌变异株。具体而言，本申请提供了具有DHA含量提高和/或生长速度加快的性质的新的裂殖壶菌变异株，以及利用该菌株生产DHA的方法。此外，本申请提供了产生本申请的新的裂殖壶菌变异株的方法，包括使裂殖壶菌菌株暴露于紫外线辐射从而诱导菌株的诱变，以及在脂肪合成关键酶乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂(例如喹禾灵)的选择压力下，筛选通过紫外线诱变获得的菌株中比天然裂殖壶菌菌株生长速度加快和DHA含量提高的株系。
【专利说明】裂殖壶菌诱变方法及其产生的变异株
【技术领域】
[0001]本申请涉及微生物遗传育种技术和生物发酵【技术领域】，尤其涉及用于生产DHA(二十二碳六烯酸)的微藻的变异株或突变株。
【背景技术】
[0002]DHA(二十二碳六烯酸，C22:6, ω-3)是一种必需脂肪酸，即人体不能自身合成且具有重要生理功能的长链脂肪酸。DHA是人的大脑和视网膜的主要组成成分。总DHA中的20%存在于大脑皮层中，总DHA中的高达50%存在于视网膜中。因此，DHA对神经系统和视觉系统的发育和维持正常智力和视力功能中起重要作用。DHA还在预防心血管疾病、癌症、炎症等中具有重要的生理功能。另外，DHA还是多种海水鱼类生长发育所需的必需脂肪酸，并且可以提高鱼苗的成活率以及降低白化病发病率。传统上DHA从鱼油中获得，但从鱼油中提取多不饱和脂肪酸(PUFA)存在一些问题，例如产量不稳定、得率低、成本高及存在其它《-6PUFA的污染，且随着渔业资源的日益紧张，传统的DHA资源已无法满足DHA日益增长的市场需求。因此，开发DHA的新资源已成为新的研究热点。
[0003]裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)是一种海洋微藻(或真菌样微生物)，其已经开发为生产DHA和其他多不饱和脂肪酸(PUFA)的商业资源。裂殖壶菌的生物安全性已被证实。Hammond等人在大鼠和兔子上对其进行了一系列检测，没有发现副作用。
[0004]但是，在发酵过程中，裂殖壶菌难免发生菌株种质退化，从而导致DHA产率下降。因此，继续改进菌株种质(主要包括生长速度，尤其是DHA含量)对于促进裂殖壶菌产业的可持续性发展是重要的。
[0005]乙酰辅A羧化酶(`ACC，EC6.4.1.2)是一种脂肪酸合成的关键酶，而除草剂喹禾灵{2-[4-(6-氯-2-喹恶啉氧基)-苯氧基]丙酸乙酯}是该酶的抑制剂。在喹禾灵的存在下，细胞会因脂肪酸生物合成受阻而生长缓慢甚至死亡。
[0006]近年来，一些研究表明，喹禾灵能够用于筛选诱变的微藻中EPA含量提高的株系。
[0007]Chaturvedi 等(2004)用 MNNG 对微绿球藻(Nannochloropsis oculata)进行诱变，再筛选抗喹禾灵的株系。从筛选得到的株系获得的结果表明EPA含量显著提高。
[0008]此外，Chaturvedi等(2006)用EMS对微绿球藻进行诱变，再筛选抗浅蓝菌素及红霉素的株系。得到的株系的EPA产率分别提高了 29%和12%。
[0009]Cao Xiaohong等(2007)用DMSO和喹禾灵处理娃藻平滑菱形藻(NitzschiaIaevis)，导致藻的EPA含量从3.00%提高到3.58%。
[0010]到目前为止，还没有报道抗喹禾灵的裂殖壶菌突变株。即使存在这样的裂殖壶菌突变株，也不清楚经喹禾灵筛选后的突变株的EPA或DHA的含量是否得到提高。此外，到目前为止，并不清楚经紫外线辐射诱导的裂殖壶菌突变株是否能够在喹禾灵筛选中存活。
[0011]发明概述
[0012]本申请的发明人惊奇地发现，通过向裂殖壶菌实施紫外线辐射诱变、然后利用脂肪酸合成中的关键酶(例如乙酰辅酶A羧化酶)的抑制剂(包括但不限于喹禾灵(Quizalofop))进行定向筛选，能够得到DHA含量增加的裂殖壶菌变异株或突变株。此外，与天然裂殖壶菌菌株相比，所获得的变异株或突变株具有高DHA含量以及提高的生长速度。
[0013]因此，第一方面，本申请提供产生与天然裂殖壶菌菌株相比具有增加的DHA含量的裂殖壶菌变异株的方法，包括利用紫外线(UV)照射诱导裂殖壶菌突变从而产生突变株；使所述突变株与乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂接触；以及选择与天然裂殖壶菌菌株相比具有增加的DHA含量的裂殖壶菌突变株。
[0014]在本文公开的一个实施方案中，乙酰辅酶A羧化酶抑制剂是喹禾灵。在具体实施方案中，与天然裂殖壶菌菌株相比，所选择到的DHA含量增加的变异株还具有加快的生长速度，从而使得DHA的生产效率较天然裂殖壶菌菌株得以提高。
[0015]在本文公开的另一实施方案中，相比于裂殖壶菌突变株的起始菌株或天然裂殖壶菌菌株，所述裂殖壶菌突变株的DHA含量提高。通常，相比于经过UV辐射诱导的诱变、进行或不进行乙酰辅酶A羧化酶抑制剂筛选的裂殖壶菌突变株的起始菌株或天然裂殖壶菌菌株，所述裂殖壶菌突变株的DHA含量提高。
[0016]在第二方面，本申请提供裂殖壶菌变异株，例如于2011年I月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、保藏号为CCTCC M2011024的裂殖壶菌菌株2010-0321。
[0017]在一个实施方案中，与天然裂殖壶菌菌株相比，本文提供的变异株具有增加的DHA含量。在另一实施方案中，本文提供的变异株是通过本文公开的方法获得的，该方法包括利用紫外线(UV)照射诱导裂殖壶菌突变从而产生突变株；使所述突变株与乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂接触；以及选择与天然裂殖壶菌菌株相比具有增加的DHA含量和/或加快的生长速度的裂殖壶菌变异株。
[0018]在第三方面，本申 请提供生产DHA的方法，包括在培养基中培养本文公开的裂殖壶菌变异株，以及任选地包括从培养的裂殖壶菌变异株或其培养基的生物质中收集DHA。在一个实施方案中，还涉及由此方法产生的生物质。
[0019]在另一方面，本申请提供食品。具体而言，所述食品含有根据本文公开的方法生产的生物质(即，与天然裂殖壶菌菌株相比，具有增加的DHA浓度)或DHA。
[0020]附图简要说明
[0021]图1显示紫外线辐射对裂殖壶菌的致死作用。
[0022]图2显示喹禾灵浓度与裂殖壶菌的相应致死率的关系。
[0023]图3显示对照菌株(或天然菌株)和一些变异株的生长速度和DHA含量。
[0024]图4显示对照菌株和3个变异株在50L发酵实验中的生长速度和DHA含量。
[0025]图5显示对照菌株与变异株2010-0321的18S rRNA序列的比对结果。
[0026]发明详细描述
[0027]本文所使用的术语“菌株”指从单一细胞或分离菌落获得的微生物的任何培养物，通常为纯的培养物，微生物例如是藻或微藻，包括裂殖壶菌。
[0028]本文所使用的术语参照菌株X的“变异株”或“突变株”指从参照菌株X得到的任何菌株。在本申请的语境中，术语“变异株”更特别地指主要通过对参照菌株X进行突变和选择而得到的菌株，而术语“突变株”更特别的指通过将随机或定向诱变技术应用于参照菌株X而得到的菌株。[0029]一旦突变株或变异株具有本文公开的各个方面的特征，尤其是与天然藻类或微藻类(特别是裂殖壶菌)相比具有更高的或增加的DHA含量时，其落入本申请请求保护的保护范围中。
[0030]本文所使用的术语“食品”指用于向人类或动物提供营养的任何产品。具体而言，食品包括用于喂养婴儿、儿童、青少年和成人的产品。本文公开的食品的全部或部分可以含有通过本文公开的方法获得的至少一种生物质或DHA。本文公开的食品也可以含有通常用于农业或食品工业的其他成分，如添加剂、防腐剂、果类或果类提取物、调味剂、着色剂、增稠剂、谷类、巧克力等。
[0031]在具体的实施方案中，食品是乳制品。
[0032]本文所用术语“乳制品”，除了奶之外，还包括源自奶的任何产品，如奶粉、乳酪、冰淇淋、黄油、乳酪、酸奶、发酵奶；或源自奶的副产物，如抗乳血清和酪蛋白以及各种含有奶或奶组分作为主要成分的制备食品。奶通常来自奶牛，但是也可以来自其他哺乳动物，如山羊、母绵羊、母马、骆驼或水牛。这些乳制品合并了通过本文公开的方法生产的DHA或生物质。
[0033]适于作为本文公开的突变/诱变和/或筛选的起始菌株或天然/对照菌株包括异养的微藻类，包括裂殖壶菌属的成员。裂殖壶菌属的一个具体成员是Schizochytrium limacinum。可从许多公开可利用的来源获得合适的生物，包括通过从自然环境收集。例如，可用于本申请的裂殖壶菌的包括Schizochytrium limacinumSR21、裂殖壶菌(S8) (ATCC20889)、裂殖壶菌(LC-RM) (ATCC18915)和 Schizochytriumlimacinum IF032693 (Honda et Yokochi,日本大阪微生物研究所(Institute forFermentation (IFO).0saka, Japan), 优选 Schizochytrium limacinum SR21 或Schizochytrium limacinum IF032693。
[0034]本文所用的任何微生物或生物体的任何具体类型包括野生型菌株、突变株或重组株。
`[0035]本文所用的术语“生物质”指藻类或微藻类(例如本文公开的裂殖壶菌或裂殖壶菌变异株等)的培养基中的培养物或细胞。或者，术语“生物质”指至少部分脱水的藻类或微藻类培养物、或脱水的培养物。
[0036]本文所用的术语“约”或“大致”，当与数值一同使用时，指相比于参照数值变化1、5或10%以内的任何数值。
[0037]本文所用的动词“包含”及其变形词以非限制性含义使用，表示后面的事项是包括在内的，但是并不排除其他未具体提到的事项。
[0038]此外，使用不定冠词“a”或“an”描述元件时，并不排除存在多个元件的可能性，除非上下文明确指示或暗示相反的情况。因此，不定冠词“a”或“an”表示“至少一个”。
[0039]在裂殖壶菌突变的实施方案中，将裂殖壶菌菌株暴露于紫外线辐射约10秒-140秒(S)，优选约20秒-120秒，更优选约30秒至100秒，最优选约70秒至90秒。在具体实施方案中，将裂殖壶菌菌株暴露于紫外线辐射的时间选自约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和90秒。收集活存的菌落并用于乙酰辅酶A羧化酶抑制剂(例如喹禾灵)的定向筛选。
[0040]在一个实施方案中，将喹禾灵以一定浓度加入到培养基中来筛选喹禾灵抗性株。在筛选中使用的培养基中喹禾灵的浓度为约5 μ mol/L至约100 μ mol/L,或约10 μ mol/L至90 μ mol/L,或约50 μ mol/L至80 μ mol/L。在一个具体的实施方案中，培养基中喹禾灵的浓度选自约 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79和80 μ mol/L培养基。在一个具体实施方案中，喹禾灵的分子式为喹禾灵-p {(R)-2-[4-(6-氯-2-喹嚼啉)氧基]苯氧基]丙烯酸酯},例如精喹禾灵(Quizalofopethyl)。
[0041]在一个具体实施方案中，喹禾灵抗性裂殖壶菌菌落的筛选在含有喹禾灵的固体培养基中实施，然后从该固体培养基中挑选存活的菌落，并将其进一步培养在含有喹禾灵的液体或半固体培养基中，以验证该菌落具有喹禾灵抗性。
[0042]按照与天然菌株(例如裂殖壶菌菌株)相比具有加快的生长速度和增高的DHA含量，进一步筛选所选择的抗喹禾灵的菌落。
[0043]由此，通过包括UV暴露和喹禾灵筛选的本文公开的方法获得的裂殖壶菌变异株与天然裂殖壶菌菌株或起始裂殖壶菌菌株相比，可以产生的DHA的量较高或增加。在具体实施方案中，在3-7天或5天的培养物或生物质中，裂殖壶菌变异株产生DHA的量高于天然菌株或起始菌株至少约 10、20、25、30、35、40%，或至少约 20、25、30、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70%ο在一个实施方案中，基于裂殖壶菌变异株的生物质干重，裂殖壶菌变异株产生DHA的量为至少 1.0% (w/w)，2.0% (w/w)，3.0% (w/w)，3.5% (w/w)，4.0% (w/w)，4.5% (w/w)，5.0% (w/w)，5.5% (w/w)，6.0% (w/w)或 6.5% (w/w)。
[0044]在另一实施方案中，优选在3-7天的培养、更优选在5天的培养中，所筛选的裂殖壶菌变异株的生长速度高于天然菌株或起始菌株至少约3、4、5、6、7、8、9、10%。
`[0045]在本申请的其他实施方案中，与天然菌株或起始菌株相比，所筛选的裂殖壶菌变异株在不同的培养条件下(例如不同的葡萄糖浓度、不同的氮源以及不同的PH值)具有稳定的生长速度和大量产生DHA的能力。
[0046]在任选的实施方案中，可以对裂殖壶菌变异株的18S RNA进行分析，以鉴定相对于天然菌株或起始菌株的遗传变异。
[0047]在一个实施方案中，裂殖壶菌变异株的例子包括但不限于菌株321-1、2010_0321和303-11，特别是菌株2010-0321。
[0048]在一个实施方案中，为了生产具有较大量DHA的生物质，将本文公开的裂殖壶菌变异株在适合裂殖壶菌培养的条件下进行培养，特别是选自菌株321-1、2010-0321、303-11的菌株，或它们的任意组合，或者菌株2010-0321。
[0049]在本文公开的实施方案中，培养条件可由本领域公知的培养方法来制定，包括在美国专利5，130，242和美国专利7，022，512公开的方法(将其全部以引用的方式并入本文)，而且本领域技术人员可容易地确定最佳培养条件。在其它实施方案中，可以在任何适合的发酵罐(例如提供氧来源的搅拌釜发酵罐或气升式发酵罐)中进行培养。可以以一定的水平搅拌微生物，使得溶解氧的浓度足够支持培养物生长和DHA产生，同时，搅拌不剪切或以其它方式损害微生物。溶解氧的合适的水平为至少10%的空气饱和水平。更特别地，将溶解氧水平保持在大约10%至约50%的空气饱和水平。本文公开的方法中所用的示例性的发酵罐可以提供IVVM通气比率，转速为70-100rpm。[0050]在一个实施方案中，发酵罐的容量为至少10至60升，例如10、20、30、40、50或60
升。也可以使用容量高至100或150升的发酵罐。
[0051]可以在任何适于维持微生物存活的温度下进行培养。具体而言，可在约15°C至约34°C温度下培养微生物。优选地，将培养温度保持在约20°C至约28°C，更优选约22°C至约27 V。
[0052]在一个实施方案中，发酵过程中的培养基的pH可以为4-10,例如5-8,优选6-7。
[0053]通常，发酵持续10天或更少，或9天或更少，或8天或更少。在一些实施方案中，发酵持续时间可以是4、5、6或7天或至少4、5、6或7天。
[0054]任选地，发酵持续时间可以为150-200小时，例如，160-190小时，或170-180小时。
[0055]在一些实施方案中，本文公开的培养裂殖壶菌变异株的方法中使用的培养基为液体培养基，其可以包含在商业操作规模上能促进生长和DHA产生的组分，包括美国专利5，130, 242和美国专利7，022，512中列出的组分，通过引用的方式将上述文献整体并入本文。
[0056]具体而言,本文公开的用于培养裂殖壶菌变异株以生产DHA的培养基包含碳源和有机或无机氮源。
[0057]在一实施方案中，碳源包括葡萄糖、各种淀粉、糖蜜、粉碎的玉米或其组合。在一实施方案中，氮源可以包括但不限于硝酸盐、尿素、铵盐、氨基酸、酵母浸膏等。培养基中还可以提供可同化的磷源(例如，磷酸盐)和/或硫源(例如，硫酸盐)。
[0058]培养基还可以含有其它的辅助发酵的物质，例如螯合剂(例如柠檬酸)，抗发泡剂(例如大豆油)，维生素(例如硫胺和/或核黄素)，以及必需的催化金属(例如碱土金属，例如镁或钙，或锌或铁和/或诸如铜`和钴的其他金属)。
[0059]在另一实施方案中，培养基还可以含有微生物生长因子，其是未规定的或规定的能增强单细胞微生物的异养生长的化合物。
[0060]用于培养裂殖壶菌的不例性培养基可以参见Jiang and Chen, Process Biochemistry35 (2000) 1205-1209;Jiang and Chen, Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology, (1999)Vol.23, 508-513;Vazhappilly and Chen,Journal of the American OilChemists Society, (1998)Vol.75，N0.3p393_397。
[0061]作为一个例子,本文公开的方法中使用的培养基包含:葡萄糖40_60g/L ;酵母浸膏 10-15g/L ;谷氨酸 4-8g/L ;氯化钠 2.4-4.0g/L ;硫酸镁 3.0-6.0g/L ;硫酸铵 3.0-6.0g/L0在一实施方案中，本文公开的方法中使用的培养基由以下组成:葡萄糖40-60g/L ;酵母浸膏10-15g/L ;谷氨酸钠4-8g/L ;氯化钠2.4-4.0g/L ;硫酸镁3.0-6.0g/L ；以及硫酸铵
3.0-6.0g/Lo本文中使用的培养基的一个实例由以下组成:葡萄糖60g/L ;酵母浸膏15g/L ；谷氨酸钠4g/L ;氯化钠3g/L ;硫酸镁5g/L ;以及硫酸铵5g/L。
[0062]可以通过例如离心、絮凝或过滤的手段来收获生物体或生物质，并可立即处理或干燥用于以后处理。任选地，可以提取脂质。本文中使用的术语“脂质”包括磷脂、游离脂肪酸、脂肪酸的酯、三酰甘油、二酰基甘油酯、单酰基甘油酯、溶血磷脂、脂肪酸盐、磷脂、固醇和固醇酯、类胡萝卡素、叶黄素(例如，氧合类胡萝素)、碳氢化合物、以及本领域的普通技术人员已知的其他脂质。如本领域技术人员充分理解的，本文公开的DHA可为这些不同脂质的形式，并且不限于游离的脂肪酸，其可以是本文公开的食品中的形式。根据使用的提取技术，可提取脂质的不同形式或组分。
[0063]可用有效量的溶剂提取脂质。在提取中所用的合适的溶剂中，通常用极性溶剂(例如，氯仿/甲醇)提取极性脂质(例如，磷脂)，通常用非极性溶剂(例如，己烷)提取中性脂质(例如，三酰甘油)。具体的溶剂可以为纯己烷。己烷与干生物质的合适的比例为大约4升己烷/千克干生物质。在具体实施方案中，将己烷与生物质在搅拌反应容器中、在大约50°C的温度下、混合大约2小时。混合后，将生物质过滤并与含油的己烷分离。通过蒸馏技术从油中移除己烷。常规的含油种子加工设备适合用于实施过滤、分离和蒸馏。如果需要或适合于具体应用，可进行额外的加工步骤。脂质回收的可选方法描述在下列文献中，将这些文献通过引用整体并入本文:发明名称为“Method for the Fractionation of Oil andPolar Lipid-Containing Native Raw Materials” 的 PCT 国际申请公开 WO 01/76715 ;发明名称为“Method For The Fractionation Of Oil And Polar Lipid-Containing NativeRaw Materials Using Alcohol And Centrifugation” 的 PCT 国际申请公开 W001/76385 ;发明名称为 “Solventless Extraction Process” 的 PCT 国际申请公开 W000/153512。
[0064]虽然利用具体的生物和方法描述了本申请，但是意图包括根据本文的教导可获得的所有生物和方法。本领域技术人员在不脱离本发明的范围和实质的情况下，能够任何替换、修改和优化。而且，本文所涉及的诸如步骤、条件以及菌株等要素可根据需要任意组合，从而实现本发明的目的。
[0065]提供以下实施例仅仅出于示例性说明的目的，并不意图限制所要求保护的主题的范围。
实施例
[0066]实施例1紫外线辐射对裂殖壶菌的突变作用
[0067]Schizochytrium limacinum SR21在以下实施例中被用作对照或天然菌株。将Schizochytrium limacinum SR21接种于培养皿上,分别暴露于紫外线福射O秒(对照)、30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒、90秒和100秒(实验组)。辐射后，将培养皿避光放置24h，对每个培养皿上的菌落数进行计数。对照组的菌落数定义为100%，相应地计算各实验组的致死率(图1)。从图1可以看出，随着辐射时间的延长，裂殖壶菌的致死率随之增高，显示出剂量依赖效应。具体地，选用70秒-90秒的辐射时间(裂殖壶菌的致死率为60%-80%)在裂殖壶菌中进行诱变。
[0068]所用培养条件为:
[0069]A培养基组成如下:
[0070]葡萄糖55g/L
[0071]酵母浸膏10g/L
[0072]谷氨酸钠5g/L
[0073]氯化钠2.4g/L
[0074]硫酸镁4.0g/L
[0075]硫酸铵4.0g/L
[0076]余量为水。
[0077]B培养温度:22-27°C ；以及[0078]C 初始 pH:5.0-7.0。
[0079]实施例2对裂殖壶菌的喹禾灵筛选
[0080]在裂殖壶菌培养基中加入精喹禾灵，添加浓度分别为O μ mol/L、10 μ mol/L、30 μ mol/L、50 μ mol/L、70 μ mol/L、80 μ mol/L 和 90 μ mol/L。将对照组(O μ mol/L)的菌落数定义为100%。对各组菌落数进行计数，基于对照组中的菌落数计算致死率(图2)。从图2可以看出，在实验范围内，裂殖壶菌的致死率与喹禾灵的浓度呈正相关关系。选用50 μ mol/L到80 μ mol/L的喹禾灵浓度进行抗性菌株筛选。
[0081]为方便操作，在培养基中添加喹禾灵，接种在紫外线辐射中存活的菌株以进行进一步定向筛选。
[0082]所筛选出的菌株可在含有喹禾灵的液体或半固体培养基中进行培养以确认其具有喹禾灵抗性。
[0083]培养条件为:
[0084]A培养基组成如下:
[0085]葡萄糖60g/L
[0086]酵母浸膏15g/L
[0087]谷氨酸钠4g/L
[0088]氯化钠3g/L
[0089]硫酸镁5.0g/L
[0090]硫酸铵5.0g/L
[0091]余量为水。
[0092]B培养温度:22-27°C ；以及
[0093]C 初始 pH:5.0-7.0。
[0094]实施例3天然菌株和变异株在生长速度和DHA含量上的差异
[0095]按照实施例2筛选和确认后，获得超过200株喹禾灵抗性裂殖壶菌菌株。然后，以生长速度加快和DHA含量提高为指标，进一步对这些喹禾灵抗性裂殖壶菌菌株筛选两轮。第一轮后筛选出20-50株,第二轮后筛选出3株。筛选出的三个菌株中的每一个在生长速度和DHA含量上都高与对照(天然)菌株大于10%。
[0096]所用培养条件为:
[0097]A培养基组成如下:
[0098]葡萄糖60g/L
[0099]酵母浸膏15g/L
[0100]谷氨酸钠4g/L
[0101]氯化钠3g/L
[0102]硫酸镁5.0g/L
[0103]硫酸铵5.0g/L
[0104]余量为水。
[0105]B培养温度:22-27°C ；以及
[0106]C 初始 pH:5.0-7.0。
[0107]图3显示出对照菌株(最左侧)和经过紫外辐射诱变和随后的喹禾灵筛选的部分变异株的生物质和DHA含量。从图3中看出，某些突变株在生长速度和DHA含量上都低于对照菌株，如321-6、321-7和321-8 ;某些突变株在生长速度和DHA含量上与对照菌株无显著差异，如321-4、321-5、321-19。在多个突变株中，DHA含量提高，如321-1、2010_0321、321-12、321-13、321-14、321-15、321-16、321-17 和 321-18。321-1 和 2010-0321 表现突出，比对照菌株的生长速度分别提高了 10.5%和31.5%，DHA含量分别提高了 64.5%和66.4%。
[0108]除这两个突变株之外，突变株303-11也表现出良好的生长速度和DHA含量。
[0109]挑选321-1、2010-0321和303-11这3个变异株进行实施例4_7中的测试，以验证通过本申请的方法获得的变异株具有DHA含量高、生长速度快的性质，并能够在不同的培养条件下稳定保持上述性质。
[0110]实施例4-7的实验中所用的通用培养条件为:
[0111]A培养基组成如下:
[0112]葡萄糖60g/L
[0113]酵母浸膏15g/L
[0114]谷氨酸钠4g/L
[0115]氯化钠3g/L
[0116]硫酸镁5.0g/L
[0117]硫酸铵5.0g/L
[0118]余量为水。
`[0119]B培养温度:22-27°C ;以及
[0120]C 初始 pH:5.0-7.0。
[0121 ] D50L发酵罐，通气比率为1VVM，转速为70~100RPM，
[0122]E培养周期4-7天。
[0123]实施例4对照菌株与321-1、2010-0321及303-11在不同葡萄糖浓度下培养的生长速度和DHA含量
[0124]除了葡萄糖浓度之外，培养条件与上文所述的通用培养条件相同。
[0125]为了比较对照(天然)菌株和突变菌株321-1、2010-0321和303-11对不同培养条件的反应并进一步证实筛选出的菌株超过对照菌株的优势，进行了一系列测试和比较。在本实施例中，比较了在不同碳源浓度下培养的对照菌株和突变菌株的生长速度和DHA含量，其中用不同测试浓度
[0126]的碳源替换原始培养基中的碳源。从表1可以看出，在不同的葡萄糖浓
[0127]度(50g/L、60g/L和70g/L)条件下，3个突变株中观察到的结果优于对照
[0128]菌株，其中结果最好的是2010-0321，其次是321-1和303-11。
[0129]表1对照菌株和3个突变菌株在不同葡萄糖浓度条件下的生长速度和
[0130]DHA 含量
[0131]
【权利要求】
1.裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)变异株,其被指定为2010-0321并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2011024。
2.如权利要求1所述的裂殖壶菌变异株，其中与天然裂殖壶菌菌株相比，所述裂殖壶菌变异株具有DHA含量提高和/或生长速度加快的性质。
3.如权利要求1或2所述的裂殖壶菌变异株，其中与天然裂殖壶菌菌株相比，所述裂殖壶菌变异株具有不同的蛋白质含量、蛋白质的氨基酸组成和/或脂肪酸的组成。
4.产生裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)变异株的方法,所述方法包括: 通过将裂殖壶菌菌株暴露于紫外线辐射，在该裂殖壶菌菌株中进行诱变，从而产生突变株； 使所述突变株与乙酰辅酶A羧化酶抑制剂接触；以及 选取与天然裂殖壶菌菌株相比，具有提高的DHA含量和/或加快的生长速度的裂殖壶菌变异株。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述乙酰辅酶A羧化酶抑制剂为喹禾灵。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述变异株具有提高的DHA含量和加快的生长速度。
7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述变异株具有不同的蛋白质含量、蛋白质的氨基酸组成和/或脂肪酸的组成。
8.如权利要求4-7中任一项所述的方法，其中将裂殖壶菌菌株暴露于紫外线辐射的时间为约30秒-约100秒，或约70秒-约90秒。
9.如权利要求4-8中任一项所述的方法，其中喹禾灵的使用浓度为约ΙΟμπιοΙ/L-约90 μ mol/L,或约 50 μ mol/L-约 80 μ mol/L。
10.如权利要求4-9中任一项所述的方法，其中所述裂殖壶菌变异株被指定为2010-0321并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2011024。
11.生产DHA的方法，包括: 将权利要求1_3中任一项所述的裂殖壶菌变异株或通过权利要求4-10中任一项所述的方法产生的裂殖壶菌变异株在适合培养裂殖壶菌菌株以产生DHA的条件下进行培养；以及任选地 从培养的裂殖壶菌变异株或其培养基的生物质中收集DHA。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述条件包括 含有约50-70g/L的碳源和10-20g/L氮源的培养基； 约20-约28°C或约22-约27°C的培养温度；和/或 3-10的pH值，例如4-8或5-7。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述培养基包含以下组分，单位为g/L: 葡萄糖 50-70， 酵母浸膏10-30， 谷氨酸钠10-20，
氯化钠 2.4-4.0， 硫酸镁 3.0-6.0， 硫酸铵 3.0-6.0。
14.通过权利要求11-13中任一项所述方法产生的生物质。
15.包含权利要求14所述的生物质或从所述生物质中提取的DHA的食品，其中所述食品包括用于喂养婴儿、儿童、青少年和成人的产品，或所述食品是乳制品。
16.如权利要求1-3中任一项所述的裂殖壶菌变异株或权利要求4-13中任一项所述的方法，其中在3-7天的培养期或5天的培养期中，所述裂殖壶菌变异株产生的DHA的量高于天然裂殖壶菌菌株至少约 10、20、25、30、35、40%，或约 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70%。
17.如权利要求1-3和16中任一项所述的裂殖壶菌变异株或权利要求4-13和16中任一项所述的方法，其中在3-7天的培养期或5天的培养期中，所述裂殖壶菌变异株的生长速度高于天然裂殖 壶菌菌株至少约3、4、5、6、7、8、9、10%。
【文档编号】C12R1/645GK103827289SQ201280029881
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年6月21日 优先权日:2011年6月23日
【发明者】伯翰, 周洁 申请人:法国罗凯特兄弟公司