用于酶促合成罗汉果苷化合物的方法和材料的制作方法
【专利摘要】描述了用于酶促合成罗汉果苷化合物的方法和材料。
【专利说明】用于酶促合成罗汉果苷化合物的方法和材料
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2011年11月23日提交的美国序列号61/563，303的优先权，其公开内容通过引用以其整体并入。
【技术领域】
[0003]本发明涉及酶促合成罗汉果苷(mogroside)化合物的方法和材料，并且更具体地涉及使用尿苷-5’-二磷酸(Uridine-5’-diphospho，UDP)依赖的葡糖基转移酶(UGT)糖基化罗汉果醇(mogrol)以生产各种罗汉果苷化合物。
【背景技术】
[0004]罗汉果苷是从罗汉果(Siraitia grosvenorii (Swingle)),也称作罗汉果(Momordica grosvenori (Swingle))的果实分离的一类三職糖苷。所述果实的提取物商业上用作天然的增甜剂。已经从罗汉果的果实鉴别出四种主要的化合物(罗汉果苷V、罗汉果苷IV、赛门苷I (Siamenoside I)和11_氧代罗汉果苷V)，其负责这些水果的甜味。参见图1。罗汉果苷V是这四种化合物中最丰富的，占干果实的大约0.57% (重量/重量)，随后是罗汉果苷IV和赛门苷I，各自含有四个葡萄糖部分(moiety)。11_氧代罗汉果苷V在C-11位具有酮基而不是羟基。参见例如Takemoto等,Yakugaku Zasshi, 103，1151-1154 ;1155-1166 ;1167-1173，(1983) ；Kasai 等，Agric.Biol.Chem.53，3347-3349 (1989)；Matsumoto, Chem.Pharm.Bull.38,2030-2032(1990)；和 Prakash,等，J.CarbohydrateChem.30,16-26(2011)。
[0005]所有的罗汉果苷共享相同的三萜核心，称罗汉果醇。用不同数目的葡萄糖部分糖基化糖苷配基罗汉果醇以形成各种罗汉果苷化合物。罗汉果苷被认为通过以下方式合成:从常见的三職前体角S烯合成葫芦二烯醇(cucurbitadienol) ;P450氧化葫芦二烯醇以产生糖苷配基罗汉果醇；以及使罗汉果醇糖基化以依次添加5个葡糖糖从而产生罗汉果苷V。参见Tang等，BMC Genomics，12，343 (2011)。中间体葫芦二烯醇和罗汉果醇二者都存在于果实中，因为它们已经作为次要产物被分离。参见Ukiya等，J.Agric.Food Chem.50,6710-6715(2002)。糖苷中间体存在于11_羟基和11_氧代系列二者中，并且由于果实成熟逐渐从罗汉果苷I变成罗汉果苷V，这表明三萜核心在随后的糖基化之前被P450酶完全氧化。然而，仍未鉴别到负责产生罗汉果苷的酶。
【发明内容】
[0006]在一个方面，本文特载(feature) 了生产罗汉果苷化合物的方法。所述方法包括将罗汉果醇与尿苷-5’ -磷酸(UDP)依赖的葡糖基转移酶(UGT)孵育以生产罗汉果苷化合物(例如，罗汉果苷la、汉果苷Ib或在C25-OH糖基化的罗汉果苷化合物)。所述UGT可选自73C3、73C6、85C2、73C5和73E1。该UGT可重组生产或可处于重组体宿主的细胞裂解物中。[0007]本文还特载了生产罗汉果苷化合物的方法。所述方法包括将罗汉果醇与从表达UGT的重组体宿主制备的细胞裂解物接触以生产罗汉果苷化合物(例如，罗汉果苷la、罗汉果苷Ib或在C25-OH糖基化的罗汉果苷化合物)。所述UGT可选自73C3、73C6、85C2、73C5和 73E1。
[0008]除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属之领域的普通技术人员通常理解相同的含义。虽然以下描述了合适的方法和材料，但类似或等同于本文所述的那些方法和材料可用于实施本发明。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其整体并入。在存在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅用于举例说明的目的并且不旨在成为限制。本发明的其他特性和益处将从以下的详细描述而明显。根据专利法中的标准实践， 申请人:保留
使用过渡性短语“包含”、“基本由......组成”或“由......组成”替代地保护任意公开
发明的权利。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1含有罗汉果苷V、罗汉果苷IV、赛门苷I和11-氧代罗汉果苷V的化学结构。
[0010]图2是使用UGT从罗汉果醇生物合成罗汉果苷Ia和罗汉果苷Ib的描述。
[0011]图3 含有以下 UGT 的氨基酸序列:UGT73C3、UGT73C5、UGT73C6、UGT73E1 和UGT85C2(分别为 SEQ I D NO:1_5)。
[0012]图4是用果胶酶和/或纤维素酶孵育后从罗汉果苷V获得的产物的示意图。
[0013]发明详述
[0014]本文提供了使用一种或更多种尿苷-5’-二磷酸(UDP)依赖的葡糖基转移酶(UGT)糖基化罗汉果醇的方法和材料。如下指出的，至少已经鉴别了 5种使糖苷配基罗汉果醇糖基化的UGT。参见图2。本文所鉴别的各个UGT都在糖基转移酶家族I中。UGT73C3、73C6、85C2和73E1在C24-OH位点糖基化(图2中UGT#2)，而UGT73C5在C3-OH位(图2中UGT#1)和 C24-OH位(UGT#2) 二者糖基化。UGT73C3、73C5 和 73C6 来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)。UGT73E1 和 85C2 来自甜叶菊(Stevia rebaudiana)。UGT73C3、73C5、73C6、73E1和85C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1_5)在图3中示出。
[0015]可使用任何合适的方法生产本文所述的UGT多肽。例如，可通过化学合成生产UGT多肽。或者，可通过标准重组技术使用编码UGT多肽的异源表达载体生产本文所述的UGT多肽。表达载体可被引入宿主细胞(例如通过转化或转染)以表达所编码多肽，其然后可被纯化。可用于小规模或大规模生产UGT多肽的表达系统包括但不限于用含有本文所述核酸分子的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转化的微生物，例如细菌(例如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))。有用的表达系统还包括用含有本文所述核酸分子的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统，以及用含有本文所述核酸分子的重组病毒表达载体(例如烟草花叶病毒)感染的或用含有本文所述核酸分子的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统。还可使用持有重组表达构建体的哺乳动物表达系统生产UGT多肽，所述重组表达构建体含有源自哺乳动物细胞基因组之启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒之启动子(例如腺病毒晚期启动子和巨细胞病毒启动子)以及本文所述的核酸。UGT多肽可以具有如下讨论的N末端或C末立而标签。
[0016] 本文还提供了编码UGT多肽的分离核酸。“分离核酸”指与存在于基因组中的其他核酸分子分离开的核酸，所述其他核酸分子包括通常侧面连接(flank)基因组中所述核酸之一侧或两侧的核酸。本文所用的关于核酸的术语“分离的”还包括任何非天然存在的核酸序列，因为这样的非天然存在的序列未在自然界中发现并且不具有在天然存在的基因组中的直接邻近序列(immediately contiguous sequences)。
[0017]分离的核酸可为例如DNA分子，条件是在天然存在的基因组中在该DNA分子直接侧翼通常发现的核酸序列之一被移除或不存在。因此，经分离的核酸包括但不限于作为独立于其他序列的分离分子存在的DNA分子(例如化学合成的核酸或者通过PCR或限制性内切酶处理生产的cDNA或基因组DNA片段)，以及并入载体、自主复制质粒、病毒(例如任何副粘病毒属、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒)或并入原核生物或真核生物之基因组DNA的DNA。此外，经分离的核酸可包括改造的核酸，例如作为杂交或融合核酸之部分的DNA分子。存在于几百至几百万个另外的核酸分子(例如cDNA文库或基因组文库或者含有基因组DNA限制性消化的凝胶切片)内的核酸不被认为是经分离的核酸。
[0018]在一些实施方案中，编码UGT多肽的核酸序列可包括标签序列，其编码设计为利于随后操作(例如利于纯化或检测)、分泌或定位所编码之多肽的“标签”。标签序列可插入到编码UGT多肽的核酸序列中使得所编码的标签位于UGT多肽的羧基末端或氨基末端。编码标签的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、HIS标签和Flag?标签(Kodak, New Haven, CT)。标签的另外实例包括叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或分泌标签。
[0019]功能同源物
[0020]上述多肽的功能同源物也适合用于本文所述的方法和重组体宿主。功能同源物是具有类似于参考多肽之序列的多肽，并且其具有参考多肽的一种或更多种生物化学或生理学功能。功能同源物和参考多肽可以为天然存在的多肽，并且序列相似性可以归因于趋同或趋异进化事件。因此，功能同源物有时在文献中被称为同源物(homolog)或直系同源物(ortholog)或旁系同源物(paralog)。天然存在的功能同源物的变体,例如由野生型编码序列之突变体编码的多肽，它们自身可以是功能同源物。功能同源物还可经所述多肽之编码序列的位点定向诱变或者通过组合来自不同的天然存在多肽之编码序列的结构域(“结构域交换(domain swapping)”)创造。用于修饰编码本文所述功能UGT多肽之基因的技术是已知的并且尤其包括定向进化技术、位点定向诱变技术和随机诱变技术，并且可用于以期望的方式增加多肽之比活性、改变底物特异性、改变表达水平、改变亚细胞定位或修饰多肽:多肽相互作用。这样的经修饰多肽被认为是功能同源物。术语“功能同源物”有时应用于编码功能性同源多肽的核酸。
[0021]功能同源物可以通过核苷酸和多肽序列比对的分析来鉴定。例如，在核苷酸或多肽序列的数据库上进行查询可鉴别UGT多肽的同源物。序列分析可包括使用UGT氨基酸序列作为参考序列的非冗余数据库的BLAST、交互BLAST或PS1-BLAST分析。在一些情况下，氨基酸序列是从核苷酸序列推断的。数据库中具有大于40%序列同一性的那些多肽是候选物(candidate)，用于进一步评估作为UGT多肽的适用性。氨基酸序列相似性允许保守的氨基酸替换，例如一个疏水残基替换为另一个或一个极性残基替换为另一个。如果需要，可以进行这些候选物的手动检查以缩小需进一步评估的候选物的数目。可通过选择那些表现出具有存在于UGT多肽之结构域(例如保守的功能结构域)的候选物进行手动检查。
[0022]可通过在多肽的一级氨基酸序列中进行区域定位来鉴别保守区，所述区域是重复序列，形成一些二级结构(例如螺旋或β折叠)，建立带正电荷或负电荷的结构域，或者代表蛋白质模体或结构域。参见例如Pfam网站在万维网(World Wide Web)上(sanger.ac.uk/Software/Pfam/和pfam.janeIia.0rg/)描述的多种蛋白质模体和结构域的一致序列。Pfam 数据库包括的信息描述于 Sonnhammer 等,Nucl.Acids Res., 26:320-322 (1998)；Sonnhammer 等，Proteins, 28:405-420 (1997)；和 Bateman 等，Nucl.Acids Res.,27:260-262(1999)。还可通过比对来自近亲物种的相同或相关多肽的序列确定保守区。近亲的物种优选来自相同的科。在一些实施方案中，来自两个不同物种之序列的比对是足够的。
[0023]通常，表现出至少约40%氨基酸序列同一性的多肽可用于鉴别保守区。相关多肽的保守区表现出至少45%氨基酸序列同一性(例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%氨基酸序列同一性)。在一些实施方案中，保守区表现出至少92%、94%、96%、98%或99%氨基酸序列同一性。序列同一性可如以上所示确定。
[0024]生产罗汉果苷化合物的方法
[0025]可通过将罗汉果醇底物与本文所述的一种或更多种UGT多肽孵育来生产罗汉果苷化合物，从而导致罗汉果苷产物的产生。在一些实施方案中，反应混合物含有多种UGT多肽使得在反应容器中发生多种糖基化。在另一些实施方案中，反应混合物含有单一 UGT多肽并且发生由所述多肽催化的一种或更多种糖基化。例如，第一反应容器可包含底物和一种或更多种UGT多肽用于产生中间体，其可被引入含有一种或更多种另外的UGT多肽的第二反应容器以产生随后的中间体或罗汉果苷产物。然后可回收在第二反应容器中产生的产物。
[0026]各个UGT多肽可为经纯化的多肽，例如可作为含有按重量计80%、90%、95%或大于99%期望UGT的溶液添加至反应混合物。或者，UGT多肽可存在于从表达UGT之重组体宿主制备的细胞裂解物中，并且可作为用于细胞裂解物添加至反应混合物与罗汉果醇底物孵育。
[0027]可通过从反应容器提取样品用于根据已经公开之方法的分析来确定产物、底物和中间体的水平。
[0028]可使用本领域已知的各种技术从反应容器回收罗汉果苷化合物。
[0029]本发明还将在以下实施例中描述，其不限制权利要求书中所述的本发明之范围。
实施例
[0030]实施例1-罗汉果苷V的纯化
[0031]按照以下方式从市售罗汉果(monk fruit)提取物(PureLo來，Swanson)纯化罗汉果苷V。将3瓶PureLo? (240克)溶解在水(900mL)中，然后加载到HP-20树脂的柱上(400克树脂)。该柱用水(2.5升)洗涤，然后还用20%甲醇-水洗涤。产物用甲醇洗脱。在高真空下蒸发溶剂并干燥后，获得罗汉果苷V(2.5克，约80%纯度，11-氧代罗汉果苷V是主要杂质)。
[0032]实施例2-从罗汉果苷V酶促合成罗汉果醇[0033]将罗汉果苷V(300mg)溶解在0.1M乙酸钠缓冲液(pH4.5，IOOmL)中，并添加来自黑曲霉(Aspergillus niger)的粗制果胶酶(25mL，SigmaP2736)。将混合物在50°C搅拌48小时。将反应混合物用乙酸乙酯(2X100ml)萃取。有机萃取物在真空下干燥然后用制备型HPLC纯化。获得了纯罗汉果醇(40mg)并通过NMR和质谱确认其结构。参见图4。
[0034]实施例3-从罗汉果苷V酶促合成罗汉果醇3-0-葡糖苷(罗汉果苷Ia)和罗汉果醇24-0-葡糖苷(罗汉果苷Ib)
[0035]将罗汉果苷V(300mg)溶解在0.1M乙酸钠缓冲液(pH4.5，100ml)中，并添加来自黑曲霉(Aspergillus niger)的粗制果胶酶(25mL, Sigma P2736)。将混合物在50°C搅拌
6.5小时。将所述反应混合物用乙酸乙酯(2X 100ml)萃取。有机萃取物在真空下干燥然后用制备型HPLC纯化。获得了纯罗汉果苷Ia(ll.0mg)和罗汉果苷Ib (8.0mg)。其结构通过NMR和质谱确认。参见图4。
[0036]实施例4-体外UGT筛选和反应
[0037]进行罗汉果醇与一组230种UGT酶的体外反应并且用LC-MS分析产物。体外UGT反应混合物包括4X Tris缓冲液、罗汉果醇(250 μ Μ) ,UDP-葡萄糖(750 μ Μ)和1%碱性磷酸酶。向反应物添加5 μ I的各种经部分纯化的UGT酶或粗制酶提取物，并且用水将反应体积补足50 μ I。将反应在灭菌的96孔板中进行并在30°C孵育过夜。孵育后，向各个反应添加25 μ L的DMSO并且将反应板离心5分钟。从每个孔取出40 μ L样品并过滤，并用于LC-MS分析。
[0038]发现UGT73C3、73C6和85C2将所有的罗汉果醇底物转化成罗汉果苷lb。UGT73C5制造罗汉果苷Ia和Ib 二者。在与UGT73E1的反应中，虽然该反应未完全，但发现罗汉果苷Ib是主要产物，伴随一种新的糖基化罗汉果醇(既不是罗汉果苷Ia也不是Ib ;准确的质量显示为罗汉果苷I，推测由在C25-OH上的糖基化事件导致)。
[0039]其他实施方案
[0040] 应当理解，虽然本发明已经结合其详细的描述进行描述，但前述描述旨在举例说明并不限制本发明的范围，其由所附权利要求书的范围限定。其他方面、益处和修饰在以下权利要求书之范围内。
【权利要求】
1.生产罗汉果苷化合物的方法，所述方法包括将罗汉果醇与尿苷-5’- 二磷酸(UDP)依赖的葡糖基转移酶(UGT)孵育以生产罗汉果苷化合物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述罗汉果苷化合物是罗汉果苷la。
3.权利要求1所述的方法，其中所述罗汉果苷化合物是罗汉果苷lb。
4.权利要求1所述的方法，其中所述罗汉果苷化合物在C25-OH被糖基化。
5.权利要求1所述的方法，其中所述UGT选自:73C3、73C6、85C2、73C5和73E1。
6.生产罗汉果苷 化合物的方法，所述方法包括将罗汉果醇与从表达UGT之重组体宿主制备的细胞裂解物接触以生产罗汉果苷化合物。
7.权利要求6所述的方法，其中所述罗汉果苷化合物是罗汉果苷la。
8.权利要求6所述的方法，其中所述罗汉果苷化合物是罗汉果苷lb。
9.权利要求6所述的方法，其中所述罗汉果苷化合物在C25-OH被糖基化。
10.权利要求6所述的方法，其中所述UGT选自:73C3、73C6、85C2、73C5和73E1。
【文档编号】C12P33/00GK103958693SQ201280057518
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年11月19日 优先权日:2011年11月23日
【发明者】刘耀权, 李正烨, 莫妮卡·哈雷 申请人:埃沃尔瓦公司