源自唾液的端粒丰度的量度和样本收集装置制造方法
【专利摘要】本发明提供了用于样本收集的装置和方法。装置可以包括：(a)容器，所述容器具有开口并且适于经由所述开口接收液体样本；(b)盖子，所述盖子被设置成可逆地密封所述开口；以及(c)捕获装置，所述捕获装置被设置成引入到所述容器中，其中所述捕获装置被设置成选择性地结合第一类型的细胞并且基本上不结合第二细胞类型的细胞。可以分析所述样本以获得端粒丰度的量度并且可以使所述丰度与健康量度相关联。
【专利说明】源自唾液的端粒丰度的量度和样本收集装置
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2011年12月31日提交的美国临时专利申请61/582, 261的优先日权 益，这个临时专利申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
[0003] 关于联邦政府资助研究的声明
[0004] 无。
[0005] 发明背景
[0006] 端粒是染色体末端的结构，其特征为核苷酸序列的重复（TTAGGG)n。人 端粒（染色体末端的保护"帽"）的缩短是细胞老化的自然现象（C.B.Harley等 人，Nature, 1990,345:458-460)。在人中，缩短可以由遗传因素和环境因素来加速，包括 多种形式的应激，如氧化损伤、生化应激物、慢性炎症和病毒感染（Epel，E. S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101 (49) : 17312-5)。端粒长度提供了干细胞和免疫系统衰老的 量度，并且预测寿命、疾病风险以及身体响应某些药物的潜力。
[0007] 端粒在非常短的时候变得功能不良，从而触发DNA损伤反应，这种DNA损伤反应 常常以细胞和组织功能损失而告终，并且最终导致大范围的疾病和早期死亡。短端粒已 经与以下各者联系起来：癌症风险（Willeit，P.等人，JAMA，2010, 304(1) :69-75)、各种 纤维化（Wiemann 等人，FASEB Journal, 2002, 16 (9) : 935-982 ;Cronkhite, J. T.等人，Am. J. Resp. Crit. Care Med.，2008, 178:729-737)、糖尿病（Salpea, Κ·和 Humphries, S. Ε·，Ath erosclerosis，2010, 209(1) :35-38)，以及众多其它病状。在越来越多的研究中，端粒丰度 或端粒酶活性的变化也已经与疾病风险或结果相关联（Bautista, C.V.等人，Colorectal Dis.，2010 年 9 月 27 日；Panossian, L. Α·等人，Neurobiol. Aging, 2003, 24 (1) : 77-84)。
[0008] 端粒的独特之处在于其可以由端粒酶、生活方式和环境因素动态地改变。端 粒缩短用作这些暴露的累积量度，并且继而，短端粒的存在得出了关于疾病风险以 及对某些药物和介入的可能响应这两者的信息。（Steer, S. E.等人，Ann. Rheum. Dis.，2007,66 (4):476-480;Njajou，0.T.等人，了.661"〇1^〇1.八^〇1.5(^.]\^(1· Sci.，2009, 64(8) :860-4 ;Brouilette 等人，2007)。
[0009] 已经开发出多种方法来测量基因组DNA中的端粒长度，包括DNA印 迹（Kimura，M.等人，Nature Protocols, 2010, 5:1596-1607)、Q-FISH(Rufer，N. 等人，Nat.Biotechnol·，1998，16:743-747)、流式 FISH(Baerlocher，G.M·等 人，Cytometry,2002,47:89-99),以及 qPCR (Cawthon，R.Μ·，Nucleic.Acids Res.，2002, 30(10) :e47)。所有这些方法都可以用于临床环境中以监测健康状况并且允许 医师开立适合个别患者需要的预防性或治疗性介入。
[0010] 唾液的特征为含有免疫细胞，如朗格汉斯细胞（Langerhans cell)、淋巴细 胞、嗜中性粒细胞、粒细胞；以及非免疫细胞，如上皮细胞和细菌细胞。（参看例如， Challacombe，S.J.和 Naglik，J.R·，Adv. Dental Res. ,2006，19:29-35 ;Nishita 等 人，BMC Medical Research Methodology，2009,9:71 ;Aps 等人，Clinica Chimica Acta 321，2002, 35-41)。所有这些细胞类型都含有可以测定端粒长度的基因组DNA样本。 toon] 以下参考文献涉及用于唾液收集的装置。
[0012] 美国专利5, 910, 122 (D'Angelo)涉及一种唾液收集器。根据D'Angelo,通过将海 绵构件放到患者的口腔中来收集唾液样本用于体液成分分析。这个海绵构件以类似于橡皮 奶嘴（pacifier nipple)的方式形成。唾液被吸收起来。然后，将唾液从海绵构件排挤到吸 管中。可以将过滤器放置在海绵构件与吸管之间，通过所述过滤器来清洁唾液并且通过仅 使分子量低于截止重量的物质通过而以分子量选择性方式制备唾液。在已经将唾液转移到 收集吸管中之后将整体单元拆卸，并且将收集吸管紧密地封闭起来以供进一步处理。
[0013] 美国专利6, 022, 326 (Tatum等人）涉及一种用于唾液的自动或半自动收集的方法 和装置，其在杆上具有接口管。根据Tatum等人，杆经由软管连接到接口部分。唾液通过抽 吸被运输到装置中。去除主体空气并且在收集室中收集唾液。对于挥发性组分的收集，对空 气流量、真空、管道直径和长度以及收集时间加以控制和限制，以减少挥发性组分的损失。
[0014] 美国专利7, 482, 116(Birnboim)涉及用于从唾液中保存并提取核酸的组合物和 方法。根据Birnboim，组合物包括螯合剂、变性剂、用以将组合物的pH值维持在DNA和/或 RNA所需的范围内的缓冲剂。组合物还可以包括还原剂和/或抗微生物剂。提及使用本发 明的组合物从唾液中保存并分离核酸的方法以及用于本发明的组合物的容器。
[0015] 美国专利8, 221，381 (Muir等人）涉及一种用于可释放地储存物质的容器系统。根 据Muir等人，这种容器系统包括具有样本储存室的小瓶以及用于刺穿盖罩中的膜的刺穿 构件，所述膜密封盖罩中的储集器内的物质直到这个膜被所述刺穿构件刺穿。容器系统任 选地包括漏斗。还提供了一种用于这种容器系统的方法和试剂盒。
[0016] 美国专利申请2004/0082878 (Baldwin等人）涉及一种口液收集和转移装置，其包 括收集装置和测试盒。根据Baldwin等人，收集装置包括框架或底架，以及吸收垫，所述吸 收垫用于吸收口液并且被紧固在框架部分的周围，其中框架部分从所述垫突出。可伸缩盖 子盖住吸收工具并且具有用于口液进入以与吸收垫接触的孔口。帽盖盖住从吸收垫突出的 框架部分。帽盖和盖子闭锁在一起以包围框架和吸收垫。这种装置还包括呈具有LED的电 路形式的液体足量指示器，当吸收工具已经吸收了预定体积的口液时，这个电路处于通路 状态。测试盒具有收集室以允许收集装置插入到测试盒中。使用测试条用于测试口液中分 析物的存在。收集装置相对于测试盒位于收集室内的固定位置处，在所述位置中吸收垫受 到受控程度的压缩，从而将预定体积的口液从吸收垫转移到测试条。
[0017] 美国专利申请2004/0082878 (Curry等人）涉及一种用于可释放地储存物质的样 本接收装置。根据Curry等人，这种样本接收装置包括盖罩，所述盖罩具有用于保留物质的 储集器和密封储集器内的物质的可刺穿屏障；以及b)漏斗，所述漏斗用于接收样本并且被 设置成用于由盖罩封闭。所述漏斗被设置成用于可释放地附接到样本接收器以使得样本可 以被提供给漏斗并且通过漏斗中的通道传送到样本接收器中。此外，漏斗包括一个或多个 用于切割可刺穿屏障的切割肋条以使得在切割可刺穿屏障后物质从储集器中释放，流经漏 斗中的通道并且进入到样本接收器中以与样本混合。提及一种用于收集并储存生物分子的 试剂盒。
[0018] 背景中的陈述不一定意味着认可所引用的参考文献中的特征描述。 发明概要
[0019] 本发明提供了一种样本收集装置，例如唾液收集装置，使用方法，以及测定端粒丰 度的量度的方法和使这些量度与健康量度相关联的方法。
[0020] 在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含：(a)容器，所述容器具有开口并 且适于经由所述开口接收液体样本；(b)盖子，所述盖子被设置成可逆地密封所述开口；以 及（c)捕获装置，所述捕获装置被设置成引入到所述容器中，其中所述捕获装置被设置成 选择性地结合第一类型的细胞并且基本上不结合第二细胞类型的细胞。
[0021] 在一个实施方案中，捕获装置基本上结合至少一种除淋巴样细胞和/或骨髓细胞 以外的细胞。
[0022] 在另一个实施方案中，第一类型的细胞被靶向以供移出并且第二类型的细胞被靶 向以供分析。
[0023] 在另一个实施方案中，第一类型的细胞包括上皮细胞并且第二类型的细胞包括骨 髓细胞和淋巴样细胞中的至少一种。
[0024] 在另一个实施方案中，盖子被设置为螺旋盖或弹扣盖。
[0025] 在另一个实施方案中，盖子可逆地或不可逆地附接到容器。
[0026] 在另一个实施方案中，捕获装置包括杆。
[0027] 在另一个实施方案中，捕获装置结合上皮细胞上的表面分子。
[0028] 在另一个实施方案中，表面分子为Ep-CAM。
[0029] 在另一个实施方案中，捕获装置包括包含捕获部分的粒子，所述捕获部分结合靶 细胞。
[0030] 在另一个实施方案中，容器包括第一区室和第二区室，其中：第一区室和第二区室 由可破裂屏障彼此隔开；第一区室被设置成从容器中的开口接收液体样本；第二区室是封 闭的并且含有细胞裂解溶液；并且其中所述容器被设置成使得破坏可破裂屏障使第一区室 中的样本溶液与第二区室中的裂解溶液混合。
[0031] 在另一个实施方案中，容器包括具有开口端和封闭端的小瓶，其中第一区室被安 置成较接近于开口端并且第二区室被安置成较接近于封闭端，并且其中可破裂屏障包括小 瓶中的隔片。
[0032] 在另一个实施方案中，捕获装置被设置为包括垫圈的杆，其中所述垫圈被设置成 当将杆插入到容器的开口中时防止所述杆的尖端刺穿可破裂屏障。
[0033] 在另一个实施方案中，容器被设置成使得对所述容器的手动挤压破坏可破裂屏 障。
[0034] 在另一个实施方案中，第一区室包含非变性溶液。
[0035] 在另一个实施方案中，试剂盒进一步包含用于捕获装置的容器。
[0036] 在另一个实施方案中，试剂盒进一步包含第二捕获装置，所述第二捕获装置包括 第二结合部分，所述第二结合部分结合除上皮细胞以外的细胞并且基本上不结合骨髓细胞 或淋巴样细胞。
[0037] 在另一个方面，本发明提供了一种方法，其包括：将唾液引入到容器中；以及从容 器中的唾液中移出上皮细胞，其中至少一种选自骨髓细胞和淋巴样细胞的细胞类型被保留 在容器中的唾液中。
[0038] 在一个实施方案中，唾液由受试者通过从口中吐出、流出或滴下而引入到容器中。
[0039] 在另一个实施方案中，移出上皮细胞包括向容器中的唾液中引入被设置成结合上 皮细胞的捕获装置，使上皮细胞结合到捕获装置，以及从容器中移出结合有上皮细胞的捕 获装置。
[0040] 在另一个实施方案中，捕获装置包含结合剂，这种结合剂结合上皮细胞上的表面 分子。
[0041] 在另一个实施方案中，表面分子是Ep-CAM。
[0042] 在另一个实施方案中，这种方法进一步包括：在移出上皮细胞之后，使容器中被保 留的细胞裂解。
[0043] 在另一个实施方案中，容器包括被设置成接收唾液的第一区室和包含裂解溶液的 第二区室，其中第二区室由可破裂屏障与第一区室隔开并且其中使被保留的细胞裂解包括 破坏所述屏障以使裂解溶液与唾液混合。
[0044] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括在使细胞裂解之前密封容器。
[0045] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括：从容器中的唾液中移出细菌细胞。
[0046] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括：将被移出的上皮细胞引入到第二容 器中。
[0047] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括使第二容器中的上皮细胞裂解。
[0048] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括在使上皮细胞裂解之前洗涤被移出的 上皮细胞。
[0049] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括向容器中的唾液中引入被设置成结合 除上皮细胞以外的第二细胞的第二捕获装置，使第二细胞结合到第二捕获装置，以及从容 器中移出结合有上皮细胞的第二捕获装置。
[0050] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括：从容器中的唾液中移出免疫细胞的 子组。
[0051] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括使容器中的唾液与非变性溶液混合。
[0052] 在另一个方面，本发明提供了一种方法，其包括：将唾液引入到容器中；用具有结 合上皮细胞的部分的捕获粒子捕获容器中的唾液中的上皮细胞，其中至少一种选自骨髓细 胞和淋巴样细胞的细胞类型在容器中的唾液中保持呈游离状态。
[0053] 在一个实施方案中，捕获粒子是磁响应粒子并且这种方法进一步包括用磁力隔离 结合到捕获粒子的上皮细胞。
[0054] 在另一个方面，本发明提供了一种方法，其包括测定来自唾液样本的细胞上的端 粒丰度的量度，其中这些细胞基本上不含上皮细胞。
[0055] 在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含：(a)容器，所述容器具有开口 并且适于接收液体样本；(b)盖子，所述盖子被设置成可逆地密封所述开口；以及（c)捕获 粒子，所述捕获粒子具有结合部分，所述结合部分结合上皮细胞，但基本上不结合骨髓细胞 和淋巴样细胞中的至少一种。
[0056] 在另一个方面，本发明提供了一种方法，其包括：测定来自受试者样本的源自唾液 的细胞中的端粒丰度的量度；以及使所述量度与以下各者相关联：（1)健康量度；（2)病理 状态的风险；（3)端粒疾病；或（4)药物响应性。
[0057] 在一个实施方案中，所述方法进一步包括：将唾液引入到容器中；以及用具有结 合上皮细胞的部分的捕获粒子捕获容器中的唾液中的上皮细胞，其中至少一种选自骨髓细 胞和淋巴样细胞的细胞类型在容器中的唾液中以源自唾液的细胞形式保持呈游离状态。
[0058] 在另一个实施方案中，受试者样本包括针对淋巴样细胞和/或骨髓细胞富集的唾 液。
[0059] 在另一个实施方案中，端粒丰度的量度是相对丰度的量度。
[0060] 在另一个实施方案中，相对丰度的量度是相对于总受试者基因组DNA的丰度的端 粒DNA的丰度。
[0061] 在另一个实施方案中，相对丰度的量度是相对于基因组参考序列的丰度的端粒 DNA的丰度。
[0062] 在另一个实施方案中，基因组参考序列是单拷贝参考核苷酸序列（例如，人球 蛋白）或非端粒重复DNA(例如，Alu重复或着丝粒重复）的丰度。
[0063] 在另一个实施方案中，端粒丰度的量度是绝对丰度。
[0064] 在另一个实施方案中，其中绝对丰度是以端粒序列的长度测量的。
[0065] 在另一个实施方案中，测定端粒丰度的量度包括通过qPCR、DNA印迹、核酸测序、 原位杂交或流式FISH测量样本中的平均端粒长度。
[0066] 在另一个实施方案中，测量是以相对荧光单位（RFU)或通过PicoGreen?来检测 的。
[0067] 在另一个实施方案中，源自唾液的细胞主要是来自一个唾液腺。
[0068] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括使所述量度与健康量度相关联。
[0069] 在另一个实施方案中，健康量度是知觉应激的健康状况调查评分。
[0070] 在另一个实施方案中，病理状态的风险是疾病风险。
[0071] 在另一个实施方案中，疾病是老龄化疾病。
[0072] 在另一个实施方案中，老龄化疾病选自由心血管疾病、糖尿病、癌症、肝纤维化和 抑郁组成的组。
[0073] 在另一个实施方案中，老龄化疾病是心血管疾病并且其中低于群体中的平均值的 量度与增加的心血管疾病风险相关联或预测增加的心血管疾病风险。
[0074] 在另一个实施方案中，所述方法包括使群体的两个或三个最低三分位数中的端粒 丰度的量度与相较于这个群体的最高三分位数中的量度显著较高的心血管疾病风险相关 联。
[0075] 在另一个实施方案中，老龄化疾病风险进一步与从血液样本中测定的端粒丰度的 量度相关联。
[0076] 在另一个实施方案中，这个群体与受试者是年龄匹配的。
[0077] 在另一个实施方案中，所述方法包括使所述量度与端粒疾病相关联。
[0078] 在另一个实施方案中，端粒疾病选自由先天性角化不良、肺纤维化、再生障碍性贫 血和间质性肺炎组成的组。
[0079] 在另一个实施方案中，这种方法包括使这个量度与药物响应性相关联。
[0080] 在另一个实施方案中，药物选自他汀类（statin)，其中短端粒长度与药物响应性 相关联；或伊美司他（imetelstat) (GRN163L)，其中长端粒长度与药物响应性相关联。
[0081] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括向受试者报告相关性。
[0082] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括基于相关性向受试者提供诊断或预 后。
[0083] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括基于相关性治疗受试者。
[0084] 在另一个方面，本发明提供了一种用于监测受试者的状况的方法，其包括：从经过 一定时段获取的多个源自唾液的受试者样本中的每个源自唾液的受试者样本中的细胞中 测定端粒丰度的量度；b)测定所述量度的差异；以及c)使所述差异与端粒疾病的进展相关 联，其中所述量度的降低指示所述疾病的进展。
[0085] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括：将唾液引入到容器中；用具有结合 上皮细胞的部分的捕获粒子捕获容器中的唾液中的上皮细胞，其中至少一种选自骨髓细胞 和淋巴样细胞的细胞类型在容器中的唾液中以源自唾液的细胞形式保持呈游离状态。
[0086] 在另一个方面，本发明提供了一种方法，其包括：a)发送包含有包括唾液的受试 者样本的容器；以及b)接收含有信息的电子传输信号，所述信息指示样本中的端粒丰度的 量度的测定结果或端粒丰度的量度与以下各者的相关性：（1)健康量度；(2)病理状态的风 险；(3)端粒疾病；或⑷药物响应性。
[0087] 在另一个方面，本发明提供了一种方法，其包括：测定来自多个受试者样本的源自 唾液的细胞中的端粒丰度的量度的变化速率，每个样本是在不同时间获取的；以及使这个 变化速率与以下各者相关联：（1)健康量度；(2)病理状态的风险；（3)端粒疾病；或（4)药 物响应性。
[0088] 在一个实施方案中，端粒丰度的量度是平均端粒长度或短端粒的百分比。
[0089] 通过引用并入
[0090] 本说明书中所提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文中，程 度如同每个个别的公布、专利或专利申请特定且个别地指示以引用的方式并入一样。
[0091] 附图简述
[0092] 图1示出了本发明的容器，其含有唾液并且具有插入到唾液中的捕获装置。
[0093] 图2示出了本发明的试剂盒。
[0094] 图3列出了可获自Miltenyi Biotec (Auburn, CA)的抗体，其适用于结合唾液中所 发现的细胞。
[0095] 发明详述
[0096] 除非另有规定，否则术语"或"在本文中以包括性的方式使用。
[0097] 1.唾液作为细胞来源
[0098] 用于测定端粒长度以及使端粒丰度与健康状况相关联的本发明方法利用从获自 静脉血抽取或外周血收集的循环白血球中获得的DNA。将基因组DNA小心地从血液样本中 的有核细胞中分离出以避免污染。白血球（白细胞）由来源于脾脏、淋巴结和胸腺的细胞 组成，其中淋巴细胞和嗜中性粒细胞占主导。
[0099] 唾液中所发现的细胞不同于血液中所发现的那些细胞。唾液中的细胞表型尚未得 到良好表征，不过已知唾液是针对非免疫上皮细胞以及朗格汉斯细胞相对富集的，并且针 对淋巴细胞、嗜中性粒细胞或粒细胞相对富集的（Challacombe，S. J.和Naglik，J. R.，Adv. Dental Res.，2006, 19:29-35)。朗格汉斯细胞通常在皮肤或表皮中被发现，并且上皮细胞 可能由唾液腺产生。因此，意想不到的是，从唾液样本中测定的端粒长度将与从血液样本中 测定的端粒长度具有强相关性。
[0100] 在某些实施方案中，唾液中的细胞子组被用于测定端粒长度的量度并且与健康状 态相关联。详细来说，针对骨髓来源的细胞和/或淋巴来源的细胞富集的样本被用于这个 目的。
[0101] 1. 1唾液收集方法
[0102] 唾液是用于端粒测试的样本的一个有吸引力的来源，这是因为唾液可以例如利用 使细胞快速裂解并且稳定DNA核酸的简单喷吐试剂盒而无创地收集，由此大大简化了收集 并且减少了由于受试者样本的分析前处理中的污染和变化而引起的测量结果变化的机率。 唾液样本可以在一天当中的任何时间在家中或在工作中自行收集，从而消除了受试者到医 疗机构就诊的需要。与静脉血样本不同，唾液样本不会带有感染风险，不会引起患者不适， 并且十分便利，尤其是如果想要多个样本的话。与血液测试相比，唾液测试还不太昂贵。
[0103] 在本发明的一个实施方案中，受试者吐唾液到杯子、小瓶或其它适合的收集装置 中。在这个实施方案中，端粒丰度是针对来源于唾液样本中所发现的细胞类型的混合物的 基因组DNA来测定的。用于收集未分化的源自唾液的细胞的装置是可商购的。举例来说， Oragene?Genotek DNA 试剂盒（DNA Genotek Inc.，Kanata, Ontario, Canada)含有储存 缓冲液，这种储存缓冲液使所存在的细胞裂解并且由此稳定样本中的基因组DNA。其它装置 可获自 Norgen Biotek (Ontario, Canada)和 Greiner Bi〇-〇ne (Kremsmunster, Austria) 〇 在本文所描述的本发明的其它实施方案中，收集装置被设置成允许移出或隔离某些细胞类 型并且分析来自所选细胞类型的DNA。
[0104] 在本发明的另一个实施方案中，使用被动流出技术,可以将在口底处汇集的全唾 液收集到适当的杯子中。在口中汇集的唾液可以沿着吸管向下流到适当小瓶或其它收集装 置中。一些个体发现通过将吸收装置放在口中来更容易地并且更美观地收集唾液。这些 装置是可商购的，例如Salimetrics 口腔药签，其由惰性聚合物制成并成形为30X 10mm圆 柱形卷筒（Salimetrics, State College, PA)。将药签插入到口中的舌头下面直到它饱和 为止。然后，将饱和的药签放到保护管中以防止在处理之前受污染。可以通过将储存管以 3000至3500rpm离心15分钟从药签中移出唾液样本以提取唾液用于DNA纯化。
[0105] 可以从口中的不同位置或从单个唾液腺收集唾液。唾液是由位于口中的若干种不 同类型的腺体分泌的。大部分唾液由对称地位于口中任一侧的三对主要腺体分泌：腮腺、 颌下腺和舌下腺。腮腺通过腮腺导管排空，这些腮腺导管通到邻近于上颌第二磨牙的颊中。 每个颌下腺排空到一个长导管，即颌下（或沃顿氏（Wharton'S))导管中，这个导管在舌头 下面的舌下阜开放。来自两个导管的开口被发现正好在系带的任一侧。每个舌下腺的前面 部分排空到主要的舌下导管中。这个导管有时邻近于颌下导管开放，而在其它个体中，其正 好在到达口中之前与颌下导管合并。每个舌下腺的后面部分通过十个至二个次要的舌下导 管排空。这些短导管沿着舌下襞通过口底成一排地直接向上开放，这个舌下襞远离舌下阜 倾斜地延伸到任一侧。
[0106] 唾液腺的分泌单元主要由两种类型的分泌细胞组成：浆液细胞和粘液细胞。这些 细胞形成球状或管状簇，被称为腺泡。腺泡细胞输入来源于血浆的水、盐和各种其它组分， 如淋巴细胞，并且将其组合起来以产生唾液。唾液腺还含有导管细胞，这些导管细胞将唾液 传递到口中并且移动离子进出唾液产物以最终确定其组成。
[0107] 来自所有腺体的唾液含有某些共同组分，但某些其它组分（特别是激素）的浓度 可以在不同类型的腺体之间有显著变化。本发明的一个实施方案采用来源于主要或仅从单 个唾液腺中收集的唾液的DNA。混合的唾液样本不适合于这种用法，并且唾液必须使用如上 文所描述的吸收垫或药签装置来收集。举例来说，腮腺唾液可以通过将装置放在颊与紧靠 上颌第二磨牙的上龈之间来收集，其中腮腺导管通到口中。如果唾液流没有受刺激，或在一 天当中的某个时间以低流量收集，那么唾液的流速可能很缓慢并且装置必须被留在适当的 位置直到其饱和为止以确保收集到足够的样本。婴儿、小孩和精神或身体有损伤的个体可 能需要另一个人的帮助以适当地放置收集装置。因为来自不同唾液腺的导管具有在已知位 置处进入口腔中的出口，所以来自特定腺体的唾液的富集可以通过将如吸收垫或布绳等收 集装置放在这些位置处来实现。
[0108] 在本发明的某些实施方案中，需要在一天当中的指定时间收集唾液。对于经过设 计以建立群体标准的研究来说，最佳地在一天当中的相同时间从所有受试者收集唾液，例 如，在大约上午8:00到大约中午12:00之间的各个小时之间。在固定的时间点收集唾液还 帮助维持个体之间和个体内的唾液组合物的稠度，尤其是在横向和纵向研究中。人的唾液 产生遵循昼夜节律，其中最大流量在大约上午5:00到大约上午6:00时出现并且在大约下 午5:00到大约下午6:00时再次出现。本领域技术人员应了解，受试者的昼夜节律可能受 偏离的睡眠周期和其它生活方式的改变所影响。可以对唾液样本的收集进行定时以与个体 的最大唾液流量相一致，或根据所研究的疾病病况在其它时间进行收集。
[0109] 2.收集装置
[0110] 本发明的某些装置包括：容器，其被设置成接收液体样本，如唾液；和捕获装置， 其被设置成选择性地或特异性地结合第一细胞类型（例如，上皮细胞或细菌细胞）中的至 少一种（例如，一种或多种）。当将捕获装置引入到含有液体样本的容器中时，所述捕获装 置结合第一类型的细胞，但基本上不结合第二类型（"第二细胞类型（例如，骨髓细胞和 /或淋巴样细胞）中的至少一种的细胞。当将捕获装置从容器中移出或在容器内隔离时，第 一类型的细胞与第二类型的细胞隔开，并且液体是针对第二类型的细胞而富集的。在移出 或隔离第一类型的细胞之后，液体样本可以被稳定（例如，用变性剂）和储存，和/或其可 以被分析，或可以类似地稳定、分析或储存第一类型的细胞。如本文中将描述，容器可以进 一步适于制备液体溶液或液体溶液中的细胞以供储存或分析。
[0111] 在一个实施方案中，液体样本包括唾液，有待移出或隔离的第一类型的细胞包括 上皮细胞、免疫细胞的特定子组、肿瘤细胞、非免疫细胞、其它类细胞（例如，干细胞）或细 菌细胞，并且有待富集的第二类型的细胞包括例如剩余（主要）骨髓细胞或淋巴样细胞。 在这些实施方案中，可以选择性地测量第二类型的细胞的特征，而不会污染原先在同一唾 液样本中的第一类型的细胞的测量结果。有待测量的特征可以是（但不限于）端粒丰度 的量度（例如，平均端粒丰度）、特定尺寸范围内的端粒的丰度、端粒长度的变化速率、mRNA 或shRNA的表达水平、受体水平，以及其它特定蛋白质的丰度。本发明的某些方法将容器中 的唾液针对至少一种选自骨髓细胞和淋巴样细胞的细胞类型相对于其它细胞进行富集。因 此，在一个实施方案中，本发明的收集装置允许个人选择性地测量唾液中的骨髓细胞或淋 巴样细胞中的端粒丰度，而不会干扰上皮细胞或细菌细胞的测量结果。
[0112] 本发明的样本收集装置包括：容器，其被设置成接收液体样本；和捕获装置，其被 设置成选择性地或特异性地捕获液体样本中的至少一种第一类型的细胞。在一些实施方案 中，样本收集装置包括用于容器的封闭物。在一些实施方案中，样本收集装置基本上移出样 本中除骨髓细胞和/或淋巴样细胞以外的所有细胞。
[0113] 2. 1 容器
[0114] 本发明的样本收集装置包括容器，所述容器被设置成接收液体样本。所述容器可 以被设置成含有体积介于约50微升与约10毫升之间、体积介于约100微升与约2毫升之 间或体积介于约500微升与约3毫升之间的液体样本。
[0115] 容器可以具有细长的形状，如管子或小瓶的形状。这个容器可以朝着容器的封闭 端方向呈锥形，例如越来越窄。末端可以被磨圆。
[0116] 容器可以包含口或孔，所述口或孔比容纳样本的容器中的孔隙更宽。举例来说，容 器可以具有孔口或开口，所述孔口或开口具有漏斗的形状。容器的孔可以足够宽来直接从 受试者的口中接收唾液样本，或其可以被设置成从独立的收集装置（例如，被唾液浸泡的 海绵或棉花药签，或其它装置，如从口中收集唾液的穿孔刷）中接收样本。
[0117] 容器可以由适合于容纳液体样本的任何材料制成。举例来说，容器可以包含聚合 物、金属或玻璃。适用于本发明的聚合物包括（但不限于）聚乙烯（例如，低密度聚乙烯或 高密度聚乙烯）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PETE)、聚氯乙烯（PVC)和聚丙烯（PP)。在某些实 施方案中，容器包含软的或柔韧的材料。在这些情况下，容器可以是可挤压的，例如，被设置 成通过手动压迫来挤压。适用于本发明的金属必须与唾液样本无反应并且没有腐蚀性，并 且可以任选地涂布有适合的聚合物以实现无反应性。本发明的玻璃容器可以在内部被类似 地涂布以实现无反应性。任选地，玻璃容器可以在外部用如乳胶等材料涂布以增加耐久性 并阻止无意中破坏。
[0118] 在某些实施方案中，容器可以包括液体，所述液体经配制以降低接收到容器中的 样本（如唾液）的粘度。这些液体的实例是缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水（PBS)或Tris-EDTA， 带有或不带有低水平的弱清洁剂（例如，大于约1%或大于约〇. 1%的曲通X_100、N〇nidet P-40、曲通X-114或Bri j-35)，或帮助唾液中除DNA以外的聚合物降解的酶。这类溶液可以 是非变性的，以使得细胞不会被溶液破坏。这允许必要时进行进一步细胞分离。在某些实 施方案中，容器包含多个区室，每个区室适于容纳液体。这些区室可以彼此流体隔离。第一 区室可以与被设置成接收液体样本的容器中的开口连通（例如，对这个开口开放）。第二区 室可以是封闭的。
[0119] 容器可以被设置成使得区室可以彼此流体连通。在一个实施方案中，容器包括可 破裂屏障，如隔片，其将这个容器分成两个区室。隔片可以由某种材料制成，这种材料可以 通过施加机械压力，例如通过挤压容器而施加的手动压迫使其破裂。隔片可以被设置为膜。 材料可以是会裂开的或易碎的。隔片可以沿着容器的内壁密封起来。隔片可以由脆的塑性 材料制成，这种材料比容器壁的材料更脆弱，例如，因为其更薄。
[0120] 在另一个实施方案中，第二区室可以被设置为容器中的自由外壳，如泡状物。
[0121] 在具有多个区室的容器中，开放的区室（即，与容器中的开口连通的区室）可以被 设置成接收液体样本。封闭的区室可以含有用于制备供进一步分析用的样本的试剂。
[0122] 容器可以包括用于使样本中的细胞裂解的裂解缓冲液。裂解缓冲液可以被包含在 第二区室中。裂解缓冲液可以包括例如缓冲剂和清洁剂，或缓冲剂和变性剂，如盐酸胍。举 例来说，裂解缓冲液可以包括壮丨8-!1(：140了446了4、505、脱氧胆酸盐、曲通乂和/或即-40， 或更强的变性剂，如脲或胍盐。
[0123] 容器可以包括例如在封闭的区室中的液体，这种液体含有用来保存液体样本中的 生物分子，例如用来保存核酸（如DNA或RNA)的试剂。用来稳定DNA的材料可以包括使蛋 白质降解的变性酶（例如蛋白酶K)，或变性剂，如胍盐或脲。
[0124] 2. 2封闭物
[0125] 本发明的容器被设置成在接收样本之后被封闭起来。为了这个目的，装置可以包 括顶盖，如帽盖或盖罩。顶盖可以是螺旋盖或弹扣盖，例如通过摩擦配合密封容器的顶盖。 顶盖可以从容器的主体拆开。或者，顶盖可以例如经由铰链或挠性连接器附接到容器。举 例来说，容器和顶盖可以被包含在单件中。为了这个目的，容器还可以具有滑块或拉链锁。
[0126] 2. 3捕获装置
[0127] 本发明的样本收集装置可以包括至少一个捕获装置，每个捕获装置被设置成选择 性地结合所选细胞类型中的至少一种的细胞。这些捕获装置基本上结合至少一种第一细胞 类型的细胞，但基本上不结合至少一种第二类型的细胞。举例来说，选择性地结合上皮细胞 的捕获装置可能基本上不结合骨髓细胞或淋巴样细胞。在一些实施方案中，捕获装置结合 至少60 %的第一类型的细胞和不超过20 %的第二类型的细胞、至少80 %的第一类型的细 胞和不超过10 %的第二类型的细胞，或至少90 %的第一类型的细胞和不超过5 %的第二类 型的细胞。在某些实施方案中，捕获装置具有结合部分，这些结合部分具有足够的亲和力和 足够的结合能力来捕获大部分第一类型的细胞，而不捕获大量第二类型的细胞。亲和力和 结合能力的要求将视捕获实体（例如抗体或适体）的特性和被捕获的实体（例如细胞上的 特定受体或蛋白质）的特性而大大变化。捕获细胞的能力可以随细胞上的结合靶标的密度 而变。就是说，在细胞表面上具有结合伴侣的许多拷贝的细胞可以用相比仅具有几个拷贝 的细胞对这个伴侣具有较小亲和力的结合装置来捕获，而具有结合伴侣的较少拷贝的细胞 可能需要用对那个伴侣具有较大亲和力的结合伴侣来捕获。
[0128] 在一个实施方案中，捕获装置包括至少一个固体载体，这至少一个固体载体上附 接有至少一个结合所关注的细胞的结合部分。除非另有规定，否则结合部分是指单一类型 的化学实体，区别于"不同的"结合部分，其是指不同类型的化学实体。
[0129] 2. 3.1固体载体
[0130] 一般来说，结合部分附接到固体载体上。固体载体可以包含单个物品或物品的集 合。
[0131] 单个物品可以被设置成向容器中引入或从容器中移出，例如用手或通过自动化过 程。举例来说，单个物品可以具有细长的形状，如棒、杆或条。其可以是相对硬性的，例如不 松软。其可以被设置成具有比物品的柄更宽或更平的末端，例如呈叶片或刮刀的形式。物 品可以被设置成具有增大的表面积以供附接结合部分，例如包括刚毛或细孔，或穿孔，如在 多孔垫或海绵中所发现。在一些实施方案中，物品的至少一部分可以类似于洗管器进行设 置。
[0132] 固体载体可以包含（但不限于）塑料、生物相容性聚合物、硝化纤维素、尼龙、木 材、陶瓷或玻璃。适用于本发明的聚合物包括（但不限于）聚乙烯（例如低密度聚乙烯或 高密度聚乙烯）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PETE)、聚氯乙烯（PVC)和聚丙烯（PP)。还可以使 用那些技术人员所知的生物相容性共聚物。
[0133] 在另一个实施方案中，收集装置可以包括多个捕获装置。就是说，捕获装置可以被 设置为集合或多个物品。举例来说，物品的集合可以是细长物品的集合。或者，物品的集合 可以包括多个粒子。细长物品可以具有基本上附接在物品的末端或沿着物品全部附接的捕 获部分。
[0134] 本发明的样本收集装置可以包括附接到捕获装置的不同组合上的结合部分的不 同组合。举例来说，收集装置可以包括附接到至少一个（例如，一个或多个）固体载体上的 一种类型的结合部分。收集装置可以包括附接到同一固体载体上的多个不同类型的结合部 分，并且可以包括多个这些固体载体。收集装置可以包括多个不同结合部分，每个结合部分 附接到不同的固体载体上。收集装置可以具有多个不同结合部分，每个结合部分针对单个 靶分子或针对单一细胞类型。
[0135] 在某些实施方案中，捕获装置被设置为一个或多个粒子，如珠粒，其中结合部分 是使用本领域中已知的技术共价键结到珠粒（例如，美国专利号6, 444, 261 ;Plaskine等 人）。这些粒子可以从液体样本中被隔离开来。举例来说，粒子可以是磁响应粒子，这些粒 子可以通过施加磁力而隔离。如果有待分析的细胞将要在容器中被裂解，那么附接有不想 要的细胞的粒子可以在裂解之前从容器中被移出。
[0136] 本发明涵盖结合部分与固体物品的若干种不同组合。这包括例如单个物品，所述 物品具有针对单个靶标（例如EpCAM)的结合部分或多个不同结合部分，这多个当中的每个 不同结合部分针对不同靶标（例如，针对EpCAM和一个或多个其它上皮细胞表面抗原）。或 者，多个固体载体可以各自具有针对单个靶标的结合部分或多个不同结合部分，这多个当 中的每个不同结合部分针对不同靶标。在一个实施方案中，试剂盒具有多个固体载体，每个 固体载体具有一个或多个针对单一细胞类型的不同结合部分。举例来说，第一固体载体可 以具有针对上皮细胞的结合部分，并且第二固体载体可以具有针对细菌细胞的部分，例如 结合到细菌表面抗原的抗体。
[0137] 结合部分可以通过本领域中已知的任何手段附接到固体载体上，从而留下自由地 执行其捕获功能的部分的结合部。附接手段必须足够稳固以抵抗在捕获过程中结合部分 从固体载体上分裂以及所结合的细胞的后续操作。（参看：Υοοη,Μ.等人，J. Biomed. Sci. Engr.，2011，4:242-247。）通常，远离捕获部分的结合部的化学官能团与固体载体共价偶 联。举例来说，根据Keogh的方法，结合部分上的2-氨基醇官能团可以用高碘酸盐氧化成 醛部分，所述醛部分与固体载体的表面上的胺部分反应形成亚胺部分，并且所述亚胺部分 然后被还原形成胺键，所述胺键固定表面上的结合部分的涂层（美国专利号5, 945, 319)。 或者，可以使用与固体载体的物理吸附、静电吸引或离子键联。举例来说，结合部分的离子 附接可以经由胍基官能团来实现（美国专利号5, 928, 916 ;Keogh)。
[0138] 使结合部分附接到固体载体上的方法将适于所用固体载体的类型。举例来说，如 果采用玻璃或陶瓷，那么其可以根据Sugiura的方法（美国专利号4, 280, 992)进行霜化， 其中载体的表面被机械或化学处理以产生精密不均匀的表面。包括例如烷氧基硅烷基（例 如经甲氧基或乙氧基取代的娃烧基）、齒娃烧基（例如经氣取代的娃烧基）的娃烧偶联剂与 不均匀的玻璃表面反应。与结合部分上的如氨基、羧基和/或硫醇基等官能团反应的交联 剂然后与经活化的玻璃表面反应形成与结合部分的共价键。在这个实施方案中以及在其中 固体载体是聚合物的实施方案中适合于交联的基团包括例如羧基、环氧基、卤烷基（如氯 乙基和氣丙基）、醒基、氣基（伯氣基和仲氣基）、硫醇基、异氛酸醋基、竣酸醋基、亚氣基和 腈基（或氰基），等等。更具体地说，与氨基反应的适合官能团的实例是羧基、环氧基、卤烷 基和醛基；与羧基反应的适合官能团包括例如氨基（伯氨基和仲氨基）和环氧基；并且与 硫醇基反应的适合官能团包括硫醇基、环氧基、齒烧基和醒基，等等。
[0139] 2. 3. 2结合部分
[0140] 结合部分可以是选择性地结合被靶向以供分离的细胞的任何材料。选择性地结合 靶细胞的材料包括例如多肽（例如抗体、受体）或核酸（例如适体）。结合部分可以被选择 为以至少10_ 3]?、10_4]\1、10_5]\1、10_6]\1、10_ 7]\1、10_8]\1、10_9]\1、10_1°]\1、10_ 11]\1或10_12]\1的亲和力结合到 革巴分析物。
[0141] 结合部分可以是选择性地或特异性地结合所关注的靶标的任何蛋白质。因此，结 合域蛋白质可以是例如受体配体、配体受体或其配体结合域（例如，其胞外域（ECD))、抗体 或其抗原结合片段、单链抗体或其抗原结合片段。
[0142] 结合部分可以是抗体。术语"抗体"是指多肽结构，例如免疫球蛋白、缀合物或其保 留抗原结合活性的片段。这个术语包括（但不限于）属于同种型类别IgA、IgD、IgE、IgG和 IgM的多克隆或单克隆抗体，其来源于人或其它哺乳动物细胞，包括天然或经遗传修饰的形 式，例如人源化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂交抗体、突变抗 体、移植抗体以及体外产生的抗体。这个术语涵盖缀合物，包括（但不限于）含有免疫球蛋 白部分的融合蛋白（例如嵌合抗体或双特异性抗体或scFv)，以及片段，例如Fab、F(ab'）2、 Fv、scFv、Fd、dAb和其它组成。
[0143] 2. 3. 3 靶细胞
[0144] 本发明的捕获装置选择性地或特异性地结合被靶向以供分离的细胞。在含有多种 细胞类型的任何样本中，从业者可能想要选择某些细胞类型以供分析，或独立地分析不同 类型的细胞。这种选择可以涉及到从样本中移出某种类型的细胞，以及分析被保留在样本 中的细胞或分析从样本中移出的细胞。举例来说，研究的一个目的可以是分析样本中的骨 髓细胞或淋巴样细胞的特征（例如测量端粒丰度），而且还同时分析其它类型的其它细胞 (如上皮细胞或其它人细胞）的特征。因此，结合部分可以经过选择以仅结合不想要的细胞 类型并将其移出。
[0145] 免疫细胞在端粒丰度的量度方面特别受关注。这些细胞包括淋巴样细胞和骨髓细 胞。在某些实施方案中，淋巴样细胞是分析的对象。在某些实施方案中，粒细胞是所关注的 对象。在另一个实施方案中，初始T细胞（表达cd95的细胞）是分析的对象。
[0146] 样本可以是唾液样本，例如人唾液样本。唾液含有若干种不同的细胞类型，包括非 免疫上皮细胞、淋巴来源的细胞（例如淋巴细胞）和骨髓来源的细胞（例如朗格汉斯细胞、 嗜中性粒细胞或粒细胞）以及细菌细胞。在这种情况下，可能需要将这些细胞类型中的一 种或多种与其它类型分离。在一个实施方案中，结合部分经过选择以允许选择性地捕获上 皮细胞，而基本上不捕获淋巴或骨髓来源的细胞。在其它实施方案中，结合部分经过选择以 选择性地捕获骨髓细胞或淋巴样细胞。某种类型的细胞可以通过使用针对靶细胞表面上的 分子的结合部分而被捕获，这些分子不存在于不同细胞类型的细胞的表面上。
[0147] 上皮细胞具有细胞表面标志物，这些标志物将其与骨髓细胞和淋巴样细胞区分 开来。这些标志物包括（但不限于）上皮细胞粘附分子（EpCAM、CD326)、E-钙粘蛋白 (E-cadherin)、上皮膜抗原（EMA或MUC1)和广谱细胞角蛋白（pan cytokeratin)。具体地 说，上皮细胞展示细胞表面蛋白质，以不同的方式被称作上皮细胞粘附分子（"Ep-CAM"）、 肿瘤相关钙信号转导蛋白1 ( "TACSTD1"）、⑶326和17-1A抗原。提及结合Ep-CAM的分子 (例如抗Ep-CAM抗体）的参考文献包括：美国专利号7, 557, 190 (Barbosa等人）、美国专 利申请2005/0009097 (Better等人）、美国专利申请2007/0274982 (Peters等人）、美国专 利申请 2010/0092491 (Anastasi 等人）以及美国专利申请 2010/0311954(Chamberlain 等 人）。
[0148] 被选为将上皮细胞与不同类别的细胞（如淋巴样细胞或骨髓细胞）分离的结合部 分可以包括针对这些细胞表面标志物的多种抗体。捕获装置可以包括针对一种标志物的 结合部分。捕获装置可以包括结合部分的组合，每个结合部分针对不同的标志物。具有针 对上皮细胞上的标志物的抗体的组合物是可商购的。举例来说，EMD Millipore (在万维网 URL millipore. com ;Billerica, MA, USA)使若干种对上皮细胞表面标志物具特异性的抗体 商品化。这些抗体包括例如抗EpCAM(例如MAB4444)、抗上皮特异性抗原抗体（CBL251)、抗 角蛋白上皮抗体（MAB1611)。Antibodies Online (在万维网 URL antibodies_online.com; Atlanta, GA, USA)出售抗 EpCAM 抗体（例如，A BIN361630)。Thermo Scientific^在万维 网 URL pierce_antibodies.com，Rockford, IL USA)出售抗 EpCAM(7E11)和抗上皮细胞特 异性抗原（323/A3)。针对EpCAM的抗体还描述于美国专利号7, 557, 190 (Barbosa等人）、美 国专利申请2005/0009097 (Better等人）、美国专利申请2007/0274982 (Peters等人）、美 国专利申请2010/0092491 (Anastasi 等人）以及美国专利申请2010/0311954 (Chamberlain 等人）中。
[0149] 在其它实施方案中，捕获装置包括使用对细菌表面抗原具特异性的抗体来针对细 菌细胞的结合部分。
[0150] 3.试剂盒
[0151] 本发明的试剂盒可以被设置成向使用者提供如下项目：其用于收集包括生物流体 (如唾液）的样本，从流体中移出一种或多种类型的细胞，任选地储存被移出的细胞，任选 地使保留在容器中的细胞裂解，以及任选地通过公用事业公司（common carrier)将至少这 个容器和任选地被移出的细胞传送给接受者。
[0152] 因此，本发明的试剂盒可以包括本发明的样本收集装置和至少一个其它物品。试 剂盒可以进一步包含输送容器，这个输送容器适于固持样本收集装置并且被传送给接受 者。试剂盒还可以含有多个捕获装置，每个捕获装置被设置成选择性地捕获不同的细胞类 型。试剂盒还可以包括至少一个固持器，每个固持器被设置成固持至少一个捕获装置。
[0153] 输送容器可以是适合于通过公用事业公司输送给接受者的任何容器。举例来说， 公用事业公司可以是United States Postal Service、FedEx或UPS。输送容器可以是例 如信封、盒子或输送管。输送容器可以包括衬垫，所述衬垫被设置成保护内含物免遭通常与 适于输送容器的输送方法相关的破损风险。
[0154] 在某些实施方案中，个人可能希望不仅分析保留在溶液中的细胞的特征，而且分 析从溶液中移出的细胞的特征。在这种情况下，试剂盒可以设有一个或多个独立的容器，其 被设置成接收一个或多个捕获装置。举例来说，试剂盒可以含有一个或多个套筒或瓶子来 接收细长的物品。在一些实施方案中，细长的物品可以附接到容器的盖子以使得例如通过 将物品插入到容器中并且将盖子弹扣或螺旋到容器上而使这个细长的物品可以被密封在 套筒或瓶子中。
[0155] 试剂盒还可以含有关于如何使用试剂盒的说明书。说明书可以包括例如如何收集 生物样本，如何移出被靶向以供分离的细胞，如何使流体中的细胞裂解，如何制备用于运输 的材料，或如何运输这些材料。
[0156] 4.方法
[0157] 在本发明的方法中，将生物流体（例如唾液）收集到样本收集容器中。所收集的 量可以介于约50uL与约2ML之间，例如介于约100uL与约1ML之间、约50uL、约100uL、约 400uL、约700 μ L、约lmL、约2mL或大于约2mL。然后，使具有捕获部分的捕获装置与流体 接触。捕获装置保持与流体接触持续足以捕获流体中准备要隔离的流体中的大部分或基本 上所有的细胞类型（例如上皮细胞）的时间。捕获可以通过移动捕获装置通过液体以改善 结合部分与所关注的细胞之间的接触来增强。举例来说，可以将唾液与捕获装置一起搅拌。 然后，从液体中移出捕获装置，将被捕获的细胞与液体中所关注的细胞分离。可以通过使捕 获装置在一个或多个独立的容器中涡旋来冲洗这个捕获装置一次或多次，所述一个或多个 独立的容器容纳有助于移出非特异性结合的细胞的缓冲液。所述捕获装置可以被丢弃或被 保存起来以供将来使用。将收集装置用帽盖密封。如果容器还包括在独立的区室中的裂解 缓冲液，那么可以破坏间隔物以使裂解缓冲液与液体中的细胞接触。样本收集容器和任选 的捕获装置可以被封入输送容器内并且传送给接受者（如实验室），以供处理。
[0158] 4. 1 分析
[0159] 可以针对所关注的任何特征来分析使用本发明的装置或试剂盒收集并分离的细 胞。在某些实施方案中，分析来自唾液的骨髓细胞和淋巴样细胞以测定端粒度量值，如端粒 丰度的量度或端粒丰度的量度的变化速率。端粒丰度的量度包括例如平均端粒长度、绝对 端粒长度或端粒长度分布。
[0160] 人细胞中的端粒长度可以从很短（例如长度<500bp)到很长（例如长度>20kbp) 变化。Kimura等人描述了端粒长度分布（Nature Protoc.，2010, 5 (9) : 1596-607)。端粒长 度分布的一个量度是短端粒百分比，例如长度小于lkb、小于2kb或小于3kb的端粒的百分 比。举例来说，可以测试样本以确定短端粒是否占端粒总数的15%以上、20%以上、25%以 上或30%以上。最新研究表明，短端粒的分数可能比平均端粒长度更好地与健康量度相关 联。端粒长度分布可以通过例如下文所描述的DNA印迹来测定。
[0161] 端粒丰度的量度的变化速率也与健康量度相关联。平均起来，端粒每年缩短约50 个碱基。大于平均值（例如至少大10%、至少大25%、至少大50%或至少大100% )的变 化速率与增加的健康风险，例如增加的心血管疾病相关联。比平均值慢（例如比这个速率 小90 %、比这个速率小75 %、比这个速率小50 %，或随着时间增加端粒长度）的变化速率与 更好的健康结果相关联。因此，可以在给定的时间段上测定端粒长度的多个量度以测定端 粒长度的变化速率。下文更详细地论述这些方法。
[0162] 端粒丰度与许多生物状态相关联并且是许多健康量度的预测因子。因此，本发明 提供了针对所关注的特征来分析生物样本中的细胞类型的子组的方法。在某些实施方案 中，本发明提供了一种针对端粒丰度的量度来分析唾液样本中的淋巴样细胞或骨髓细胞的 方法。这种方法可以包括提供唾液样本；使至少一种被靶向以供移出的细胞类型与至少一 种被靶向以供分析的细胞类型分离；以及针对所关注的特征来分析被靶向以供分析的细胞 类型的细胞。举例来说，被靶向以供分离的细胞可以是并非淋巴样细胞或骨髓细胞的细胞 类型，例如上皮细胞或细菌细胞。被靶向以供分析的细胞可以是例如淋巴样细胞或骨髓细 胞。可以通过例如使样本与选择性地结合被靶向以供分离的细胞类型并且基本上不结合被 靶向以供分析的细胞类型的结合部分接触，以及隔离所结合的细胞（例如通过将其从液体 样本中移出）来移出被靶向以供分离的细胞。
[0163] 包含唾液中所发现的细胞子组的样本可以被用于端粒丰度的量度中。样本可以 是针对唾液中所发现的靶细胞富集的唾液样本，这些靶细胞如骨髓细胞（例如朗格汉斯细 胞、嗜中性粒细胞或粒细胞）和/或淋巴样细胞（例如淋巴细胞，如初始T细胞）。端粒丰 度的量度和这些量度的变化速率指示健康、病理状态的风险或存在以及对药物的响应性。 然后，可以使来自这些样本的细胞的端粒丰度的量度或这些量度的变化速率与以下各者相 关联：（1)健康量度；（2)病理状态的风险；(3)端粒疾病；或（4)药物响应性。
[0164] 通过本领域技术人员已知的方式从唾液样本中分离DNA。在一个实施 方案中，可以使用可商购的机器或使用手动DNA纯化试剂盒从经过稳定的唾液样 本中机械地提取DNA，所述手动DNA纯化试剂盒例如Puregene试剂盒（Gentra Systems, Minneapolis, MN), 如 T. Rylander-Rudqvist 等人(Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. ,2006,15:1742-1745)所描述。其它可商购的DNA纯化试剂盒包括 QIAamp DNA微型试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany)和 Norgen 唾液DNA 分离试剂盒（Norgen Biotek, Ontario, Canada)。Norgen试剂盒是基于旋转柱色谱法。简单地说，用蛋白酶K和 纯化添加剂处理，接着用异丙醇处理通过用细胞裂解剂处理而稳定的唾液样本。将结合溶 液添加到样本中，然后使DNA结合到Norgen的BIND柱上，旋转，洗涤以去除杂质，并且用缓 冲液或水洗脱。
[0165] 还可以分析从样本中隔离的其它细胞（例如上皮细胞），并且将其用作独立的诊 断标志物，这些诊断标志物将对那种细胞类型的源器官更具特异性。举例来说，唾液样本中 的上皮细胞由唾液腺上皮或口腔上皮产生，并且因此，预期这些细胞中的端粒长度对头部 和颈部区域中的健康或疾病状况更有预测性。
[0166] 4. 2.测量端粒丰度的方法
[0167] 端粒丰度的量度可以是绝对或相对的。端粒丰度的绝对量度包括例如用例如核苷 酸的数目测量的基因组中端粒序列的总长度。更通常地，端粒丰度是相对于参考来测量的。 端粒序列的检测可以根据试验中所产生的信号强度来测量。可以将这个信号强度与由试验 中的参考序列产生的信号强度相比较。相对信号强度可以起到标准化方法的作用。经过标 准化的方法可以更容易地在试验之间进行比较。举例来说，可以将通过检测端粒序列而产 生的信号与通过测量已知存在于单拷贝的基因组中的序列而产生的信号相比较。用于这些 目的的一个单拷贝参考基因是β_血红蛋白基因。因此，与所使用的试验方法无关，端粒序 列对参考序列的相对信号可以例如用比率表示。这个比率可以被用来比较端粒序列丰度测 量的结果。
[0168] 4. 3 qPCR
[0169] 本领域中已知的多种方法可以在本发明中被用来测定平均端粒长度或端粒丰度。 优选地，如由 Cawthon (Nucleic. Acids Res.，2002, 30 (10) : e47 ;美国专利号 7, 695, 904)特 定地针对端粒长度检测所修改，利用实时动态定量聚合酶链式反应（qPCR)。这种方法是 简单的并且允许快速高通量处理大量的源自唾液的DNA样本。qPCR方法基于由报道分子 产生的荧光的检测，这种荧光随着聚合酶链式反应的进行而增加。这种荧光增加由于每个 扩增周期的PCR产物的积聚而发生。这些荧光报道分子包括结合到双链DNA的染料（例 如，SYBR?绿或溴化乙锭）或序列特异性探针（例如分子信标（Molecular Beacons)或 TaqMan?探针）。
[0170] 在本发明的方法中，使用对重复的端粒序列（TTAGGG)n具特异性的引物探针。引 物的大小可以一般从5个到至500个核苷酸长度变化，介于10个与100个核苷酸之间，介 于12个与75个核苷酸之间，或介于15个到50个核苷酸之间，这取决于用途、所需特异性 和扩增技术。在本发明中，一个实施方案利用与靶端粒序列的第一单链杂交的第一引物， 以及与靶端粒序列的第二单链杂交的第二引物，其中第一链和第二链基本上互补。在这个 实施方案中，举例来说，可以使用由以下组成的成对引物组：tell (5' -GGTTTTTGAGGGTGAGGG TGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3'）[SEQ ID NO:1]和 tel2(5'-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCC CTATCCCTA-3'）[SEQ ID N0:2]。在一个实施方案中，这些引物中的至少一者包含至少一个 改变或突变的核苷酸残基，从而当引物彼此杂交时，在改变的残基与另一个引物的3'末端 核苷酸之间产生错配。在3'末端核苷酸处存在错配会阻碍由聚合酶延伸，由此限制非靶 核酸依赖性延伸反应。在这个实施方案中，举例来说，可以使用由以下组成的成对引物组： tellb5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3'[SEQ.IDNo.:3]dPtel2b 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3' [SEQ.ID No. :4]。本领域技术人员应 了解，在本发明中可以采用其它基本上互补或错配的引物组。这些引物描述于美国专利号 7, 695, 904 (Cawthon 等人）中。
[0171] 在引物与端粒序列杂交中以及在扩增反应中，PCR试验一般在允许在靶核酸存 在下形成杂交体的严格条件下完成。本领域技术人员可以改变温度、盐浓度、pH值、有 机溶剂、离液剂或其它变量的参数以控制杂交的严格度以及还使引物与非特异性靶标的 杂交最小化。在引物与靶端粒序列接触之后，用聚合酶扩增酶处理反应混合物。多种适 合的聚合酶在本领域中是熟知的，尤其包括Taq_?聚合酶（Invitrogen, Carlsbad, CA)、 KlenTaq?(DNA Polymerase Technology, St. Louis, M0)、Tfl 聚合酶（Promega，Madison, WI) 和DynaZyme?(Thermo Scientific, Lafayette, CO)。一般来说，尽管所有聚合酶都适用于本 发明，但聚合酶是缺乏3'到5'核酸外切酶活性的热稳定聚合酶，因为使用具有强的3'到 5'核酸外切酶活性的聚合酶倾向于去除错配的3'末端核苷酸。
[0172] 在本发明的另一个方面，可以将各种试剂添加到反应物中以增加聚合酶的性能， 稳定聚合酶以免失活，减少引物的非特异性杂交，和/或增加复制的效率。这些添加剂包括 (但不限于）二甲亚砜、甲酰胺、乙酰胺、甘油、聚乙二醇或类蛋白质剂，如大肠杆菌单链DNA 结合蛋白质、T4基因蛋白质、牛血清白蛋白和明胶。在另一个方面，本领域技术人员可以使 用各种核苷酸类似物用于扩增特定类型的序列，例如富含GC序列或重复序列。这些类似物 尤其包括c7-dGTP、羟甲基-dUTP、diTP和7-脱氮-dGTP。
[0173] 扩增反应是根据本领域中熟知的程序来进行的。用于PCR的程序被广泛使用和描 述（参看例如美国专利号4, 683, 195和4, 683, 202)。简单地说，双链目标核酸一般是通过 在高到足以使这些链变性的温度下孵育而变性，然后在过量引物存在下孵育，这些引物与 单链靶核酸杂交（退火）。DNA聚合酶延伸经过杂交的引物，从而产生靶核酸的新拷贝。使 所得双链体变性，并且重复杂交和延伸步骤。通过在用于互补靶链的第二引物存在下反复 进行变性、退火和延伸的步骤，被两个引物包围的靶核酸以指数方式扩增。引物延伸步骤的 时间和温度将取决于聚合酶、被扩增的靶核酸的长度以及用于扩增的引物序列。充分扩增 靶核酸所需的反复进行的步骤的数目将取决于扩增的效率。本领域技术人员应了解，本发 明不受扩增过程中所应用的时间、温度、缓冲液条件和扩增周期的变化所限制。
[0174] 通过本领域中熟知的方法来检测和分析扩增的产物。经过扩增的产物可以在分离 和/或纯化产物之后加以分析，或通过直接测量扩增反应中所形成的产物来分析。对于检 测来说，可以用荧光化合物，例如用溴化乙锭或SYBR?绿，或通过与经过标记的核酸探针杂 交来间接地鉴别产物。或者，在扩增反应中使用经过标记的引物或经过标记的核苷酸来标 记扩增产物。标记包含任何可检测的部分，包括荧光标记、放射性标记、电子标记以及间接 标记，如生物素或地高辛（digoxigenin)。
[0175] 适合于进行本发明的qPCR反应的仪器可获自许多商业来源（ABI Prism 7700, Applied Biosystems,Carlsbad, CA ；LightCycler?480, Roche Applied Science, Indianapolis, IN ；Eco Real-Time PCR System, Illumina, Inc. , San Diego,CA ； RoboCycler 40, Stratagene，Cedar Creek,TX)〇
[0176] 当使用实时定量PCR来检测和测量扩增产物时，各种算法被用来计算样本中的靶 标端粒的数目。（举例来说，参看ABI Prism 7700软件版本1.7;Lightcycler软件版本3)。 定量可以涉及到使用具有已知拷贝数的端粒核酸的标准样本以及从标准和阈值周期（C t) 的对数产生标准曲线。一般来说，Ct是PCR周期或部分PCR周期，其中由扩增产物产生的荧 光高于基线荧光若干个偏差。实时定量PCR提供了约7至8个数量级的线性，其允许测量 在宽动态范围上的靶标端粒核酸的拷贝数。靶标核酸拷贝的绝对数目可以由比较标准曲线 与样本的C t值而得出。
[0177] 如上文所描述来定量经过扩增的产物。在一个实施方案中，使用实时定量PCR来 测定靶核酸样本中的端粒重复单元的拷贝数或端粒丰度。用于测定和比较端粒重复单元数 的标准包括使用单拷贝基因（例如，人β-球蛋白或核糖体磷蛋白364)或已知拷贝数的靶 核酸（例如具有已知数目的端粒重复单元的质粒）。另外，可以使用非端粒重复DNA核酸 (例如，Alu重复或着丝粒重复）的丰度。因此，相对端粒丰度的量度是通过端粒DNA的丰 度相对于基因组参考序列的丰度来测定的。通过本文所描述的方法，可以定量大量样本的 重复单元的拷贝数用于测定端粒重复单元的数目并且由此测定端粒平均长度的目的。
[0178] 在用于通过qPCR测定端粒丰度的本发明的一个实施方案中，试验由作比较的两 个独立的PCR反应组成。受试者唾液样本DNA的T (端粒）PCR值与人β-球蛋白的S (单 拷贝基因）长度一起获得。用Τ值除以S值得到一个比率，这个比率确定了相对于如S值 所反映的基因组DNA的丰度的样本端粒的长度。这个比率因此与每个基因组的平均端粒长 度成比例。每个源自唾液的样本中的端粒重复的数量是以任意选择的参考DNA样本的稀释 水平来测量的，这将使得实验样本和参考样本关于在PCR扩增的指数期中产生给定量的端 粒PCR产物所需的PCR周期数是等价的。类似地，每个样本中的单拷贝基因的相对数量是以 参考的DNA样本的稀释水平来表示的，所述稀释水平是将参考的DNA样本与实验样本关于 在PCR指数期中产生给定量的单拷贝基因 PCR产物所需的PCR周期数相匹配所需要的。对 于每个受试者样本来说，这些稀释因子的比率是端粒与单拷贝基因（T/S)的相对比率。因 此，当未知的DNA序列与参考DNA在其端粒重复拷贝数与单拷贝基因拷贝数的比率方面一 致时，T/S= 1。参考DNA样本可以来自单个个体或可以来源于获自多个受试者的经过汇集 的样本。一个个体的T/S比相对于另一个个体的T/S比对应于其DNA的相对端粒长度。
[0179] 4. 4其它方法
[0180] 平均端粒长度可以通过本领域中已知的其它方法来测量。这些方法包括（但不限 于）直接核酸测序、DNA印迹、原位杂交和流式FISH。
[0181] 在本发明中可以采用用于直接测定经过分离的DNA中的核酸序列的常规技术。举 例来说，参看：〃DNA Sequencing"，The Encyclopedia of Molecular Biology, J. Kendrew 编，Blackwell Science Ltd·, Oxford, UK, 1995，第 283-286 页。染料-终止子自动化测序 现在最常被用于核酸测序（〃DNA Sequencing", Lab Manager,在万维网URL labmanager. corn/ ? articles. view/articleNo/3364/article/DNA-Sequencing上）。自动化测序设备 被便利地使用并且可以购自如 Applied Biosystems、Roche Applied Science 和 Illumina Inc.等公司。一旦测定DNA样本的序列，然后即可对任一端的端粒核苷酸序列（TTAGGG)的 拷贝数进行计数。本发明的这种方法通过直接测量端粒序列而提供绝对端粒丰度的量度。
[0182] 在本发明中也可以利用DNA印迹^。!!!：]^!·]!』·]^·，]"·]^]^ Biol.，1975, 98 (3) : 503-517)以通过检测人端粒核苷酸序列（TTAGGG) n的特定存在来 测定端粒丰度。在本发明中，末端限制性片段（TFR)DNA印迹组合了将通过电泳分离的 DNA片段转移到滤膜，接着通过与对（TTAGGG)序列具特异性的探针杂交来检测这些片段 (Allshire，R.C.等人，Nucleic Acids Res. ,1989, 17, 4611-4627)。这些探针具有与端粒 序列互补的序列。为便于检测，将探针作放射性标记或用荧光染料或显色染料加标签。然 后，可以定量所存在的放射性或荧光的量以得到样本中的端粒丰度。M. Kimura等人（Nature Protocols, 2010, 5:1596-1607)描述了一种用于测定端粒长度的适当DNA印迹程序。
[0183] 在本发明中可以使用原位杂交。利用原位杂交来检测和定位组织中或染色体上的 (TTAGGG) n序列。将用放射性或荧光标签作标记的探针施加到固定的组织或染色体制剂上， 在此所述探针与所存在的任何互补序列杂交。在洗掉未杂交的探针之后，经过标记的探针 显露出端粒序列的位置。然后，可以定量所存在的放射性或荧光的量，并且使其与端粒长度 相关联。
[0184] 在本发明的上述实施方案中，荧光可以用相对荧光单位（RFU)来测量。当在毛细 管内通过使用电泳而分离的经过标记的片段受激光激励并且穿过检测窗口时，使用电荷耦 合装置（CCD)阵列来检测荧光。计算机程序测量结果，从而在每个数据点，由荧光强度水平 ("相对突光单位（RFU) "，DNA. gov:Glossary, 2011 年4月，万维网URL dna. gov/glossary/) 来确定含端粒的片段的数量或大小。含有较高数量的经过扩增的DNA的样本将具有较高的 相应 RFU 值（Gertsch J.等人，Pharm Res.，2002, 19:1236-1243)。"RFU 峰值"是沿着所分 析的数据的曲线图的相对最大值点。在本发明中，重要的是将所得数据针对实验室标准进 行标准化以使得在所想要的临床相关性中使用充分定量的结果。
[0185] 在被称作流式荧光原位杂交（流式FISH)的技术中可以将荧光原位杂交与流式细 胞术相结合。在本发明中的端粒丰度测定中，流式FISH定量从唾液中分离的基因组DNA中 的（TTAGGG)序列的拷贝数。用于流式FISH和自动化流式FISH的方案已经被标准化并公布 (G. M. Baerlocher 等人，Cytometry, 2002, 47:89-99 ;G. M. Baerlocher 和 Ρ· M. Lansdorp，Cy tometry, 2003, 55:1-6 ;G. M. Baerlocher 等人，Nature Protocols, 2006, 1 (5) :2365-2376)。
[0186] 简单地说，流式 FISH 采用具有例如 3'-CCCTAACCCTAACCCTAA-5' [SEQ ID No. :5] 序列的肽核酸探针，这个序列经荧光探针（例如荧光素）标记以对与所制备的DNA样 本杂交的端粒重复进行染色。适当突光探针是可商购的（eBioscience, San Diego, CA; Applied Bio systems，Carlsbad，CA;Miltenyi Biotech，Auburn，CA)。通过探针染色而 产生的荧光是定量的，因为探针在杂交条件下优先结合到DNA。DNA双链体一旦已经解链 并且与探针退火即无法重新形成，从而允许这个探针使其祀重复序列饱和（因为这个序 列不会通过与互补链上的反义DNA竞争而从靶DNA移位），由此在洗掉未结合的探针之后 得到可靠的并且可定量的探针靶标的频率的读出结果。荧光是使用已经经过适当校准的 流式细胞仪来测量的。流式细胞仪可购自供应商，如Millipore (Billerica, MA)、Applied Biosystems(Carlsbad, CA)和 B D Biosystems(Franklin Lakes, NJ)〇
[0187] 5.与端粒丰度相关联的状态
[0188] 已经显示，由从血液样本中纯化的基因组DNA测定的端粒长度与若干个重要的生 物指标相关联。这些指标包括例如实足年龄、体质指数、臀部/重量比、知觉应激和心血管 风险。端粒长度的一个量度是端粒/单拷贝（"T/S"）比。已经发现，由来源于唾液样本的 基因组DNA测定的T/S比与通过标准方法从血液样本中测定的T/S比高度相关联（皮尔森 相关系数（Pearson correlation coefficient)为0.7)。在给定群体中的这些比率可以被 分成分位数，例如分成三分位数。已经发现，端粒丰度在较低两个三分位数中的个体相比在 端粒长度的最高三分位数中的那些个体处于显著更高的心血管疾病风险下。
[0189] 一般来说，在群体中的端粒丰度的量度（例如T/S)的百分位数值与疾病风险和健 康量度相关联，其中较低百分位数得分与降低的健康量度、增加的疾病风险和端粒疾病的 存在正向相关联。
[0190] 在群体中，端粒长度随着年龄而减小。因此，个体的端粒长度的量度可以与这个群 体（即，年龄匹配的群体）中相同年龄范围内的个人的量度相比较。举例来说，30岁的个人 的端粒丰度的量度可能约等于30岁的群体平均值，或等于20岁或40岁的群体平均值。端 粒丰度的量度与健康量度的相关性与年龄匹配的群体的量度相比较时更加准确。年龄匹配 的群体的范围可以是例如一年、两年、三年、四年、5年、7年或10年。
[0191] 5. 1健康量度
[0192] 通过本发明的方法从受试者的源自唾液的样本中测定的端粒丰度可以与健康量 度相关联。源自唾液的样本可以是选自唾液样本的细胞，例如淋巴样细胞或骨髓细胞。特 别关注的是涉及到知觉应激的健康量度。端粒缩短可以由遗传因素和环境因素来加速，包 括多种形式的应激，如氧化损伤、生化应激物、慢性发炎和病毒感染（Epel，2004,同上）。
[0193] 便利的一般健康状况的量度是由John Ware开发的SF-36?·健康调查（参看例 如万维网URL sf-36. org/tools/SF36. shtml)。SF-36是多用途的简明型健康调查，其中 优选地由经过培训的个体向患者提出仅仅36个问题。这个健康调查提供了功能性健康 和幸福感得分的8等级概况以及基于心理测量学的身心健康综合量度和基于偏好的健康 效用指数。这个调查是一般量度，与靶向特定年龄、疾病或治疗组的调查成对比。因此， SF-36已经证实适用于一般和特定群体的调查中，来比较相对的疾病负担，以及区分由大 范围的不同治疗产生的健康益处。除了标准SF-36调查以外，其它专用的调查版本可获自 Medical Outcomes Trust (Hanover, NH)，包括用于儿童的 SF_36v2? 健康调查、SF-12? 健 康调查、SF-12v2?健康调查、SF-8?健康调查和SF-10?健康调查。SF-36调查被用来估 计疾病负担并且比较疾病特异性基准与一般群体标准。最频繁研究的疾病和病状包括关 节炎、背痛、癌症、心血管疾病、慢性阻塞性肺病、抑郁、糖尿病、胃肠病、偏头痛、HIV/艾滋 病、高血压、肠道易激综合症、肾病、下背痛、多发性硬化、肌肉骨骼病状、神经肌肉病状、骨 关节炎、精神病诊断、类风湿性关节炎、睡眠障碍、脊髓损伤、中风、物质滥用、手术程序、移 植和创伤（Turner-Bowker 等人，Health Survey&〃SF〃Bibliography:第三版 (1988-2000)，QualityMetric Incorporated, Lincoln, RI, 2002)。本领域技术人员应了解， 一般健康状况的其它调查方法，例如RAND-36,可以在本发明中得到应用。
[0194] 在数字量表上评估来自SF-36系列调查的结果。举例来说，可以使用可商购 的软件，例如 QualityMetric Health Outcomes? 评分软件 2. 0(QualityMetric Health Outcomes Solutions, Eden Prairie, MN)来便利地分析来自SF-36调查的数据。
[0195] 在本发明的一个实施方案中，随着时间收集受试者唾液样本，并且从样本中测定 端粒丰度的量度。用于收集多个样本的适当时间段包括（但不限于）1个月、3个月、6个 月、1年、2年、5年和10年（例如，最早的样本与最后的样本之间的时间可以是大约这些时 间段）。这种方法允许监测患者为改善其一般健康状况和/或监测其健康状况和/或疾病 风险所作的努力。因为端粒长度随着年龄而减小，所以TL在个体内随着时间得以维持或增 加的发现指示健康改善，而TL随着时间而损失表示健康减退或恶化。另外，已经显示，TL 在较低一个或两个三分位数内的受试者相对于最高三分位数组（"参考群体"）处于增加的 心血管疾病或癌症风险下（Brouilette等人，2007 ;Willeit等人，2010)。在威尔莱特研 究（Willeit study)中，在最低三分位数中的受试者相比在中间三分位数中的那些受试者 处于更高的疾病风险下。这些一般趋势可以根据所观测到的T/S比来进一步定量。
[0196] 在使用qPCR技术用于T/S测定的若干研究中，已经发现，三分位数边界为约0. 9 和约1. 3,指示T/S小于0. 9或为0. 9-1. 3或大于1. 3的受试者相对来说处于高、中和低疾 病风险下。T/S比值小于约0. 5已经与"端粒疾病"相关，所述端粒疾病是由于端粒酶或端 粒相关蛋白质中的失活性突变加速端粒损失而具有极高疾病风险的病状。端粒疾病常常与 如皮肤、骨髓、肺、肝和肠等高度增生组织中干细胞再生能力的损失相关。这些值可以被应 用到下文所描述的所有疾病风险。医生对具有短端粒但没有临床症状的个体可能进行的适 当医疗介入将通常为使用常规疾病生物标志物进行的更频繁的测试以用于早期诊断特定 疾病，或对具有临床症状的受试者进行更具侵袭性的治疗。另外，因为短端粒已经与药物响 应相关（例如Brouilette等人，2007 ;Rattain等人，2008)，所以医生可能视端粒长度而 选择特定类型的药物或特定剂量。
[0197] 在本发明的某些实施方案中，除了获取样本中的端粒丰度的量度以外，个人还可 以测定细胞中细菌细胞的量。这些细菌细胞将在测试之前从样本中分离。样本中的细菌细 胞可以例如通过qPCR来测量。高水平的细菌DNA通过干扰qPCR而可能导致假的端粒长度 测量结果。因此，如果细菌，例如细菌DNA水平，超过一定阈值（例如>600ng/ul或>700ng/ ul)，那么可以将样本排除出分析。
[0198] 5. 2病理状态的风险
[0199] 5. 2.1 疾病
[0200] 测量端粒的重复单元数在医学诊断（例如关于疾病风险的诊断）、疾病预后和治 疗中具有广泛多种应用。具体来说，端粒长度的测量在评定导致疾病风险的病理状态方面 得到应用。在本发明的一个实施方案中，疾病是与老龄化相关的疾病，例如（但不限于）心 血管疾病、糖尿病、癌症、肝纤维化和抑郁。
[0201] 在一个实施方案中，本发明在评定和监测心血管疾病方面得到应用。已经显示， 如通过血管造影术所测定，在患有严重三支冠状动脉疾病的患者中白血球中的端粒长度 比其在具有正常冠状动脉的个体中更短（Samani，N. J.等人，Lancet, 2001，358:472-73)， 并且在50岁之前经历过早心肌梗塞的患者中的端粒长度与没有这种历史的年龄 和性别匹配的个体相比更短（Brouilette S.等人，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.，2003, 23:842-46)。Brouilette 等人（Lancet, 2007, 369:107-14)已提出，在倾 向于患上冠心病的人中较短的白血球端粒可以指示其它心血管风险因子对端粒长度的 累积影响。增加的氧化应激也造成动脉粥样硬化，并且已经显示，增加的氧化剂应激会 增加体外端粒磨损的速率（Harrison, D.，Can. J. Cardiol.，1998, 14 (增刊 D) : 30D-32D ; von Zglinicki, Τ·，Ann. Ν· Υ· Acad. Sci.，2000, 908:99-110)。在横向研究中，也已经 报告了吸烟、体质指数和1型糖尿病与较短的白细胞端粒长度相关（Valdes, A.等 人，Lancet, 2005, 366:662-64 ;Jeanclos, E.等人，Diabetes, 1998, 47:482-86)。已经显不， 增加的生活应激（一种已知增加冠心病风险的因素）与较短的端粒相关，这可能是增加的 氧化应激的后果（Epel, E. S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 49:17312-15)。因此， 具有高体质指数、糖尿病和/或增加的生活应激的吸烟者和患者将全部得益于根据本发明 的方法对其端粒丰度的测定和连续监测。
[0202] 2 型糖尿病的特征为较短的端粒（Salpea, K.和 Humphries, S. E.，Atheroscleros is，2010, 209(1) :35-38)。较短的端粒在1型糖尿病患者中也已经被观测到（Uziel 0.等 人，Exper. Gerontology, 2007, 42:971-978)。1型糖尿病中的疾病病源学与2型糖尿病 略有不同，不过在这两种情况下，β细胞衰竭是全面爆发的疾病的最终触发因子。端粒 长度因此为糖尿病的适用标志物，因为其与疾病的进展相关。Adaikalakoteswari等人 (Atherosclerosis, 2007, 195:83-89)已经显示，在糖尿病前期葡萄糖耐受不良的患者中 的端粒与对照相比更短。另外，端粒缩短已经与以下各者联系起来：糖尿病并发症，如糖 尿病性肾病（Verzola D.等人，Am. J. Physiol. ,2008, 295:F1563-1573)，微量白蛋白尿 (Tentolouris，N.等人，Diabetes Care, 2007, 30:2909-2915)，和上皮癌（Sampson, M.J.等 人，Diabetologia，2006, 49:1726-1731)，而端粒缩短似乎在糖尿病得到良好控制的患者中 有所减弱（Uziel，2007,同上）。本发明的方法特别适用于监测糖尿病前期和糖尿病患者的 状况以提供这些并发症和其它疾病的预警。
[0203] 本发明适用于测定各种类型的癌细胞的端粒长度，因为端粒酶活性的活化与细 胞的永生化相关。虽然正常人体细胞不表达或仅短暂表达端粒酶并且因此在每次细胞 分裂时缩短其端粒，但大多数人癌细胞通常表达高水平的端粒酶并且显示出不受限制 的细胞增殖。高端粒酶表达使得细胞长期增殖并扩充并且因此支持肿瘤生长（Roth，A. 等人,Small Molecules in Oncology, Recent Results in Cancer Research, U. M.Martens(编），Springer Verlag, 2010,第221-234页）。较短的端粒与癌症风险显著相 关，尤其是膀胱癌和肺癌、与吸烟有关的癌症、消化系统和泌尿生殖系统的癌症。过度的端 粒缩短可能在加速肿瘤发作和进展方面起作用（Ma H.等人，PLoS 0NE，2011，6(6):e20466. doi : 10. 1371/journal. pone. 0020466)。研究已经进一步显示，缩短的端粒对乳癌风险的影 响对于某些群体子组是显著的，例如绝经前女性和具有较差抗氧化能力的女性（Shen J.等 人，Int. J. Cancer, 2009, 124:1637-1643)。除了评定和监测癌症以外，一般来说，本发明特 别适用于监测口腔癌，因为其利用来源于唾液样本的基因组DNA。
[0204] 肝硬化的特征为器官的纤维化增加，其常常与显著的炎性浸润相关。Wiemann等人 (FASEB Journal, 2002, 16(9) :935-982)已经显示，端粒缩短是人肝硬化的与疾病和年龄无 关的征象。端粒缩短存在于由病毒性肝炎（慢性肝炎A和B)、毒性肝损伤（酒精中毒）、自 体免疫和胆汁郁积（PBC和PSC)诱发的硬化中；端粒在与患者年龄无关的硬化中一律很短。 端粒缩短和衰老特异性地影响硬化的肝中的肝细胞，并且这两个参数与硬化期间的纤维化 的进展强烈相关。因此，本发明的方法在诊断和监测肝纤维化方面得到应用。
[0205] 抑郁已经被比作"加速老龄化"的状态，并且抑郁的个体具有各种老龄化疾病的 较高发病率，如心血管和脑血管疾病、代谢综合症和痴呆。患有复发性抑郁的人或暴露于 慢性应激的人展现出白血球中较短的端粒。较短的端粒长度与复发性抑郁和指示暴露于 慢性应激的皮质醇水平这两者相关（Wikgren，M.等人，Biol. Psych. ,2011，DOI :10. 1016/ j. biopsych. 2011. 09. 015)。然而，并不是所有抑郁的个体都显示同等缩短的端粒，因为 在一生中抑郁发作有很大变化。受抑郁困扰很长持续时间的人与对照群体相比具有显著 更短的端粒，这是由于较长时间暴露于氧化应激和由心理应激诱发的炎症（Wolkowitz等 人，PLos One, 2011，6(3):el7837)。因此，本发明的方法可以在监测抑郁方面得到应用。
[0206] 5. 2. 2其它病理状态
[0207] 本发明在诊断与老龄化早发有关的疾病方面也得到应用。举例来说，患有早衰 病（Hutchinson Gilford progeria disease)的个体显示出过早老龄化以及与端粒长 度损失相关的成纤维细胞的增殖潜力下降（Allsopp, R. C.等人，？1"〇〇.似1:1.4〇3(1.5(^· USA，1992, 89:10114-10118)。根据本发明的方法对端粒重复数的扩增和定量适用于确定疾 病风险或预后并且采取如上文所描述的适当介入步骤。
[0208] 5. 3端粒疾病
[0209] 在本发明的一个实施方案中，端粒特异性疾病的存在和进展这两者都可以使用基 于唾液的样本来测定。端粒疾病起源于端粒酶活性的缺陷。端粒酶是真核细胞中端粒DNA 的复制和保护所需的核糖核蛋白复合物。缺乏端粒酶的细胞经历端粒DNA的渐进式损失， 这导致存活力损失并伴随有基因组不稳定性增加。这些疾病可能是遗传的，并且包括某些 形式的先天性再生障碍性贫血，其中骨髓干细胞的细胞分裂不足导致严重贫血。皮肤和肺 的某些遗传疾病也是由端粒酶缺陷引起的。对于端粒疾病来说，T/S〈0. 5的阈值适于一些 病状。此外，常用的度量值是针对年龄调整的百分位数端粒得分相对于正常群体小于〈10 % 或优选地〈1%。
[0210] 先天性角化不良（DKC)，也被称为津-恩-科三氏综合症（Zinsser-Engman-Cole syndrome)，是一种罕见的渐进性骨髓衰竭综合症，其特征为粘膜皮肤异常：网状皮肤 色素沉着过度、甲营养不良和口腔粘膜白斑病（Jyonouchi S.等人，Pediatr.Allergy Immunol.，2011，22 (3) : 313-9 ;Bessler Μ·等人，Haematologica，2007, 92 (8) : 1009-12)。 有证据表明这种病症中的端粒酶功能不良、核糖体缺乏和蛋白质合成功能不良。早期死亡 常常与骨髓衰竭、感染、致命性肺部并发症或恶性肿瘤相关。这种疾病在以下三种类型之一 中是遗传的：常染色体显性、常染色体隐性或最常见形式X连锁隐性（其中负责DC的基因 被携带在X-染色体上）。使用本发明的方法对疾病进展的早期诊断和测量对于具有这些遗 传特征的家族非常有益，从而使得用合成代谢类固醇或骨髓刺激药物进行早期治疗可以帮 助防止骨髓衰竭。本发明的非侵入性的、对患者友好的唾液测试方法特别适用于DKC，因为 婴儿和小孩需要测试和连续监测。
[0211] 特发性间质性肺炎的特征为纤维化和炎症的组合对肺实质的损伤。特发性肺 纤维化（IPF)是这些疾病的一个实例，其引起肺的渐进性疤痕形成。纤维性疤痕组织在 肺中随着时间而积累起来，影响了其向身体提供足够氧的能力。端粒酶基因的编码区 中的杂合子突变TERT和TERC已经在特发性间质性肺炎的家族性和散发性病例中被发 现。带有突变的所有受影响患者都具有短的端粒。一大部分的IPF个体具有短的端粒长 度，这无法由端粒酶中的编码突变来解释（Cronkhite，J. T.等人，Am. J. Resp. Crit. Care Med.，2008, 178:729-737)。因此，端粒缩短可以被用作朝着这种年龄相关疾病的倾向性增 加的标志（Alder, J. K.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105 (35) : 13051-13056)。此 夕卜，IPF的过程因人而异。对于一些人来说，这种疾病可能经过多年缓慢而逐渐地进展，而 对于其它人来说，其可能快速地进展。本发明的方法可以被便利地用来监测肺纤维化的过 程并且采取如上文所描述的适当介入步骤。
[0212] 再生障碍性贫血是骨髓停止为身体制造足够的红血球、白血球和血小板的疾病。 骨髓所制造的任何血细胞是正常的，但其并不足够。再生障碍性贫血可以是中度、严重或 极严重的。患有严重或极严重的再生障碍性贫血的人处于威胁生命的感染或出血的风险 下。患有携带端粒酶突变的再生障碍性贫血的患者发展脊髓发育不良的风险增加。端 粒酶缺乏可能引起造血干细胞中可变程度的端粒缩短并且导致染色体不稳定和恶性转 化（Calado，R.T.和 Young, N.S·，The Hematolo gist, 2010 万维网 URL hematology.org/ Publications/Hematologist/2010/4849. aspx)。具有较短端粒的再生障碍性贫血患者具 有较低生存率，并且在免疫疗法之后相比具有较长端粒的那些患者复发的可能性大得多。 Scheinberg等人（JAMA，2010, 304(12) :1358-1364)发现，复发率随着端粒长度增加而下 降。具有最短端粒的患者组也处于转变成骨髓癌的较高风险下，并且具有最低的总体生存 率。本发明的方法可以被用于再生障碍性贫血患者中以监测发展主要并发症的风险，以使 得可以相应地调整个体的临床管理。
[0213] 5. 4药物响应性
[0214] 在另一个实施方案中，本发明适用于监测治疗剂的有效性或筛选影响端粒长度或 端粒酶活性的候选药物。监测端粒特征的能力可以提供用于检查特定疗法和药理学药剂 的有效性的窗口。个体中疾病病况对特定疗法的药物响应性可以通过本发明的方法来测 定。举例来说，本发明在监测癌症疗法的有效性方面得到应用，因为细胞的增殖潜力与端 粒完整性的维持有关。如上文所描述，虽然正常人体细胞不会表达或仅短暂表达端粒酶并 且因此在每次细胞分裂时缩短其端粒，但大多数人癌细胞通常表达高水平的端粒酶并且 显示出不受限制的细胞增殖。Roth等人（同上，2010)已经提出，在肿瘤中（其中大多数 细胞中的最短端粒接近于端粒功能不良）具有极短端粒并且具有高端粒酶活性的癌症个 体可能最得益于抗癌端粒酶抑制药。因为端粒酶在大多数正常细胞中不会被表达或被短 暂表达并且处于极低水平下，所以端粒酶抑制疗法相比常规的化学疗法可能对正常细胞 的毒性更小。这些药物的一个实例是基于短寡核苷酸的端粒酶抑制剂伊美司他（先前名 为GRN163L)。伊美司他是第一代寡核苷酸GRN163的新型基于脂质的缀合物（Asai，A.等 人，Cancer Res.，2003, 63:3931-3939)。然而，在正常血细胞（特别是其粒细胞）中具有极 短端粒的癌症患者处于伊美司他对增生组织（如骨髓）的不良影响的较高风险下。Rattain 等人（2008)发现，具有短粒细胞TL的这些受试者更可能患有骨髓衰竭综合症，如中性粒细 胞减少症或血小板减少症。在这种情况下，医生可能开立更低剂量的伊美司他、不同的药 物，或更频繁地监测骨髓问题。
[0215] 在其它实施方案中，药物功效在于治疗老龄化疾病，例如（但不限于）心血 管疾病、糖尿病、肺纤维化、肝纤维化、间质性肺炎和抑郁。在心血管疾病的情况下， Brouilette等人报告了，相比对照组具有更短端粒长度的中年男性最得益于使用普伐他 汀（pravastatin)的降脂疗法（Brouilette, S. W.等人，Lancet, 2007, 369:107-114)。 Satoh等人（Clin. Sci.，2009, 116:827-835)指示，当与经温和普伐他汀疗法治疗 的患者相比，经阿托伐他汀（atorvastatin)治疗的患者中受强化降脂疗法保护的 端粒更好地免遭侵蚀。本发明的方法可以被用来监测经过治疗的患者中他汀类的 功效，其中较短的端粒长度与较好的药物功效相关联。因为具有最长端粒的受试者 平均来说不会得益于预防性的他汀类，所以医生可能建议患者尤其顺应良好的生 活方式习惯作为其治疗方案的一部分。反过来，担心长期使用他汀类的副作用的具 有短端粒的患者可能基于其得益于他汀类的较高可能性而被说服服用他汀类。可 以使用的他汀类的实例包括烟酸（niacin) (Advicor?、Simcor?)、洛伐他汀 (lovastatin) (Altoprev?、Mevacor?)、氨氯地平（amolopidine) (Caduet?)、 罗苏伐他汀（rosuvastatin) (Crestor?)、西他列汀/辛伐他汀（sitagliptin/ simvastatin) (Juvisync?)、氟伐他汀（fluvastatin) (Lescol?)、普伐他汀 (Pravachol?)、阿托伐他汀(Lipitor?)、匹伐他汀（pitavastatin) (Livalo?)和依泽替 米贝 / 辛伐他汀（ezetimibe/simvastatin) (Vytorin?)。
[0216] 在其它实施方案中，可以测量治疗端粒疾病中的药物有效性，这些端粒疾病例如 (但不限于）先天性角化不良、肺纤维化和再生障碍性贫血。举例来说，先天性角化不良和 肺纤维化都用高剂量的类固醇治疗，众所周知，这些类固醇具有众多有害副作用。使用最低 可能的类固醇剂量因此是非常可取的，这使得本发明的方法成为用于监测这些患者的有价 值的工具。
[0217] 5. 5候选药物筛选
[0218] 在另一个方面，本发明用作筛选影响调节端粒长度（例如端粒酶活性）的生物途 径的候选药物的一般方法。快速扩增端粒重复的能力提供了一种用于鉴别影响细胞中的端 粒特征的小分子、候选核酸和肽剂的高通量筛选法。对正常细胞具有正向端粒延长作用的 候选药物将优于具有端粒缩短（或端粒酶抑制）作用，而其它方面都等同的那些药物。
[0219] 6.方法
[0220] 6. 1实验室测试
[0221] 本发明的方法可以在参考实验室，例如CLIA认证的实验室中进行。可以将含有来 源于唾液的受试者DNA的样本发送到实验室以供测试。可以将所产生的结果传达给安排这 个测试的个人或实体，或传达给受试者本身。
[0222] 在全球化经济中，在收集用于测试的样本的场所、对这个样本安排测试的个人或 实体所处的场所、进行测试的场所和接收测试结果的场所之间可能存在极少的地理关系。 因此，个人或实体可以从一个场所传送待测试的样本并且从遥远的场所（例如从不同的城 市、州或国家）接收包括测试结果的报告，所述报告是通过用来访问信息的任何方法或手 段传送的。举例来说，结果可以通过电子方式传送。结果可以由例如安排这个测试的个人 在因特网上邮寄以供访问。结果可以向移动和/或手持装置（如智能电话）推送。
[0223] 6. 2体外诊断试剂盒
[0224] 用于端粒长度评定的体外诊断试剂盒可以包括加标签（例如印上条形码）的唾液 收集装置以及用于输送所收集的样本到中心测试机构的预付费信封。或者，在医生办公室 使用的医疗点试剂盒可以含有用于在医生办公室或非实验室环境中的设备上纯化DNA并 运行qPCR端粒试验所必需的试剂和溶液。有关方法将为如下方法：其中试剂和溶液被包含 在密封盒或类似装置中以供插入到封闭的自动化仪器中，这个自动化仪器进行DNA纯化和 qPCR分析。输出结果可以是具有T/S值、受试者的T/S值相对于参考群体的T得分、受试者 的T/S值相对于年龄和性别匹配的正常群体的Z得分以及临床解释的测试报告。 实施例
[0225] 实施例1-用于唾液收集的装置
[0226] 参看图1，本发明的试剂盒包括容器101，这个容器被设置为管子或小瓶。容器101 包含柔韧的材料，这种材料在施加压力，例如手动压迫时可以被压缩。容器101包括开口 103,这个开口被设置成接收含有生物材料的液体样本，如唾液样本。容器101还包括隔片 105,这个隔片将容器分成流体隔离的区室，在这种情况下所述隔离的区室是封闭区室107 和与开口连通的开放区室109。封闭区室107含有裂解缓冲液111，这种裂解缓冲液被设置 成使存放在开放区室109中的唾液样本中的细胞裂解。裂解缓冲液还含有用来保存核酸的 化学品。试剂盒还含有螺旋盖或弹扣帽120,所述螺旋盖或弹扣帽被设置成密封开口 103。
[0227] 试剂盒还包括捕获杆150。捕获杆150具有末端152,所述末端已经附接到选择性 地结合EpCAM的抗体，EpCAM是上皮细胞表面上的分子。捕获杆150不具有结合骨髓细胞 或淋巴样细胞的捕获部分。试剂盒还包括杆容器170,这个杆容器被设置成容纳并储存使用 后的捕获杆150。容器170可以含有与区室111中的溶液类似的稳定/变性溶液。
[0228] 在使用前，受试者可以清洁其口腔，例如通过牙线清洁、洗刷和/或使用嗽口水。
[0229] 在使用中，受试者将唾液吐到或流到开放区室109中，在这个区室中其与封闭区 室107中的裂解缓冲液由隔片105隔开。也可以指示这个受试者将经设计以降低粘度的溶 液添加到区室109中以促进靶细胞结合到结合剂。受试者将捕获杆150插入到所收集的唾 液中并且例如通过涡旋或搅拌将上皮细胞捕获到其上。捕获杆150与唾液样本保持接触约 10秒。然后，从容器101中移出捕获杆150,上皮细胞与其一起移出，并且针对骨髓细胞和 淋巴样细胞富集唾液样本。将捕获杆150插入到杆容器170中以供后续使用。或者，可以 抛弃掉捕获杆150。
[0230] 从容器101中移出捕获杆150之后，受试者用弹扣帽120将容器101封闭起来。受 试者挤压容器101以破坏隔片105并且使唾液样本与裂解缓冲液111接触。受试者例如通 过振荡或涡旋混合唾液样本与裂解缓冲液111。
[0231] 受试者现在可以将封闭容器101和/或杆容器170发送到服务提供商以供分析。
[0232] 实施例2-通过qPCR测定端粒长度
[0233] 这种方法是从Cawthon公布的原始qPCR方法（Nucleic Acid Res.，2002, 30 (10) : e47)与 Blackburn 等人的分析方法（Lin, J.等人，J. Immunol. Methods, 2009)相结合改编而来。试验由两个独立的PCR反应组成：T (端粒）PCR值与S (单 拷贝基因，例如β_球蛋白）值一起获得，并且比较这两个值。用T值除以S值以确定每个 基因组的样本端粒的相对长度。
[0234] 使用本发明的试剂盒或例如Oragene? Genotek DNA试剂盒（DNA Genotek Inc.，Kanata, Ontario, Canada)收集受试者唾液，所述DNA试剂盒含有蛋白酶和变性溶液， 这种溶液使所存在的细胞裂解，抑制可能使核酸降解的酶，并且因此而稳定所存在的基因 组DNA。尽管技术上不需要进一步纯化来产生T/S值，但已经发现，DNA纯度可能影响T/ S比，这可能归因于影响一个或多个qPCR反应步骤的污染物。因此，一种方法包括如上文 所描述的DNA纯化步骤。与每个试验一起包括的是用于测定浓度的DNA参考标准（例如， HeLaDNA或NIST标准）、用来随着时间而调整试验中的偏移的单个或一组正规化对照，以及 用于试验验收的QC对照。
[0235] 使用384孔板对变性的DNA样本进行实时定量PCR以使得受试者样本和对照样本 可以在同一个板上运行。制备PCR试剂的两种主混合物，一种具有端粒（T)引物对，另一种 具有单拷贝基因（S)引物对。T引物对在100nM的最终浓度下使用并且具有以下序列：tel lb 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3' [SEQ.ID No. :3];和tel 2b 5'-GG CTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3' [SEQ.ID No. :4]。来源于人 β-球蛋白的 S 引物对在300nm的最终浓度下使用并且具有以下序列：hbg 15' -GCTTCTGACACAACTGTGTTCA CTAGC-3' [SEQ. ID No. :5];和 hbg 25'-CACCAACTTCATCCACGTTCACC-3' [SEQ. ID No. :6]。这 些引物作为标准纯化的材料获自Integrated DNA Technologies (Coralville, ΙΑ)。
[0236] 将这些板小心地作标记以鉴别受试者样本孔和标准孔。在独立的板上，将7. 5ul T 主混合物或S主混合物添加到每个样本和标准曲线孔中。对于分析T/S比的每个受试者来 说，将DNA样本的三个相同的3. 5ul等分试样添加到适当作标记的孔中。为获得标准曲线， 在 10XPCR 缓冲液（200mM Tris-HCl，pH 8. 4 ;500mM KC1)中连续稀释一个标准HeLa DNA 样 本以产生五种DNA浓度（26、8. 75、2. 9、0. 97、0. 324和0. 108ng)。然后，将PCR试剂添加到每 个孔中以使得每个孔中的最终反应混合物含有20mM Tris-HCl(pH 8. 4) ;50mM KC1 ;200uM 每种 dNTP(Roche Applied Science) ;l%DMS0;0.4x Syber Green I(Invitrogen);以及 每llul反应物0.4个单位的Platinum Taq DNA聚合酶（Invitrogen)。受试者样本和标准 化对照孔另外含有0. 5-10ng基因组DNA。QC负对照孔另外含有22ng大肠杆菌DNA。
[0237] 然后，在 Roche Lightcyler?(Roche Applied Science)仪器上进行 DNA 扩增。在 96°C下使T (端粒）DNA变性1秒，接着在54°C下退火并延伸60秒。在95°C下使S (单拷贝 基因）DNA变性15秒，在58°C下退火1秒，在72°C下延伸20秒（8个循环），在96°C下变性 1秒，在58°C下退火1秒，在72°C下延伸20秒，并且在83°C下保持5秒进行数据收集（35 个周期）。
[0238] 使用LightCycler软件来产生每个板的标准曲线并且分析数据以抛弃掉离群值。 计算每个受试者样本的原始T/S比（T平均浓度/S平均浓度）。通过用五个标准化对照样 本的平均τ/s比除以标准τ/s值来计算调整因子。这五个值的平均百分比差值被用作调整 因子。用每个原始τ/s比除以调整因子以得到每个样本的最终τ/s值，这个值就是端粒长 度。也计算每个低、中和高质量控制的最终τ/s值并且与可接受的范围相比较。
[0239] 实施例3-基于端粒长度测定心血管风险
[0240] 通常，对于处于心血管疾病（"CVD"）的低风险或中度风险下的个体，在规定年龄 范围的大群体中测定Τ/S值。也可能在基线处收集关于可能与端粒长度一起变化的多种标 准风险生物标志物和因子的数据。然后，追踪受试者一定时间段（例如5-15年），并且收 集关于心血管事件（包括死亡）的发生率的数据。这个研究可能被设计成包括治疗组（例 如，如Brouilette等人，2007中的预防性他汀类）作为随机化的安慰剂对照研究的一部 分。将受试者分组，代表具有最长端粒的基线最高三分位数（33%)、中间三分位数和最低 三分位数。其它五分位数（例如四分位数）可能替代三分位数而被使用。在研究结束时， 然后可以通过比较最低或中间三分位数组中的事件数与最高三分位数组（参考组）中的事 件数来计算随着端粒长度而变的事件的优势比。
[0241] 在使用qPCR技术用于Τ/S测定的若干研究中，已经发现，涉及到中年个体的研究 中的三分位数边界为约0. 9和约1. 3,指示Τ/S小于0. 9或为0. 9-1. 3或大于1. 3的受试者 相对来说处于高、中和低疾病风险下。在运行qPCR试验中所使用的确切条件可能影响T/S t匕，因此每个实验室通常报告了特定针对其方法的五分位数之间的边界的阈值。通过包括 对CVD的标准风险因子（例如脂质概况、家族史、hsCRP、血压、葡萄糖和胰岛素等）的评定， 统计员可以使用多变量分析来确定TL是否是疾病的独立风险因子，以及TL对比其它风险 因子的相对效用和重要性。在Brouilette公布和Willeit公布中，TL是CVD的强而独立 的风险因子，甚至对于最具侵袭性的多变量模型也是这样。
[0242] 尽管本文中已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但本领域技术人员将显而 易见，这些实施方案仅作为实例而提供。众多变更、变化和替代在不脱离本发明的情况下现 在将被本领域技术人员所想到。应了解，在实施本发明时可以采用本文所描述的本发明的 实施方案的各种替代方案。打算以下权利要求限定本发明的范围并且在这些权利要求和其 等价物的范围内的方法和结构由此被涵盖在内。
[0001] 序列表 <110> Telome Health, Inc. CALVIN, HARLEY <120〉源自唾液的端粒丰度的量度和样本收集装置 <130> 1010-004. PCT <150> US 61/582261 <151〉 2011-12-31 <160> 4 <170>?^16"111版本3.5 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成引物 <400> 1 ggtttttgag ggtgagggtg agggtgaggg tgagggt 37 <210> 2 <211〉 39 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成引物 <400> 2 tcccgactat ccctatccct atccctatcc ctatcccta 39 <210> 3 <211〉 39 <212> DNA <213〉人工序列
[0002] <220> <223〉合成引物 <400> 3 cggtt.tgttt gggtt.tgggt ttgggtttgg gt.tt.gggtt 39 <210> 4 <211〉 39 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成引物 <400> 4 ggcttgcctt acccttaccc ttacccttac rxttaccct 39
【权利要求】
1. 一种试剂盒，其包含： (a) 容器，所述容器具有开口并且适于经由所述开口接收液体样本； (b) 盖子，所述盖子被设置成可逆地密封所述开口；以及 (c) 捕获装置，所述捕获装置被设置成引入到所述容器中，其中所述捕获装置被设置成 选择性地结合第一类型的细胞并且基本上不结合第二细胞类型的细胞。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其中所述捕获装置基本上结合至少一种除淋巴样细胞 和/或骨髓细胞以外的细胞。
3. 如权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一类型的细胞被靶向以供移出并且所述第 二类型的细胞被靶向以供分析。
4. 如权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一类型的细胞包括上皮细胞并且所述第二 类型的细胞包括骨髓细胞和淋巴样细胞中的至少一种。
5. 如权利要求1所述的试剂盒，其中所述盖子被设置为螺旋盖或弹扣盖。
6. 如权利要求1所述的试剂盒，其中所述盖子可逆地或不可逆地附接到所述容器。
7. 如权利要求1所述的试剂盒，其中所述捕获装置包括杆。
8. 如权利要求1所述的试剂盒，其中所述捕获装置结合上皮细胞上的表面分子。
9. 如权利要求8所述的试剂盒，其中所述表面分子是Ep-CAM。
10. 如权利要求1所述的试剂盒，其中所述捕获装置包括包含捕获部分的粒子，所述捕 获部分结合所述靶细胞。
11. 如权利要求1所述的试剂盒，其中所述容器包括第一区室和第二区室，其中： ?所述第一区室和所述第二区室由可破裂屏障彼此隔开； ?所述第一区室被设置成从所述容器中的所述开口接收液体样本； ?所述第二区室是封闭的并且含有细胞裂解溶液；并且 其中所述容器被设置成使得破坏所述可破裂屏障使所述第一区室中的样本溶液与所 述第二区室中的所述裂解溶液混合。
12. 如权利要求10所述的试剂盒，其中所述容器包括具有开口端和封闭端的小瓶，其 中所述第一区室被安置成较接近于所述开口端并且所述第二区室被安置成较接近于所述 封闭端，并且其中所述可破裂屏障包括所述小瓶中的隔片。
13. 如权利要求11所述的试剂盒，其中所述捕获装置被设置为包括垫圈的杆，其中所 述垫圈被设置成当将所述杆插入到所述容器的所述开口中时防止所述杆的尖端刺穿所述 可破裂屏障。
14. 如权利要求11所述的试剂盒，其中所述容器被设置成使得对所述容器的手动挤压 破坏所述可破裂屏障。
15. 如权利要求11所述的试剂盒，其中所述第一区室包含非变性溶液。
16. 如权利要求3所述的试剂盒，其进一步包含用于所述捕获装置的容器。
17. 如权利要求1所述的试剂盒，其进一步包含第二捕获装置，所述第二捕获装置包括 第二结合部分，所述第二结合部分结合除上皮细胞以外的细胞并且基本上不结合骨髓细胞 或淋巴样细胞。
18. -种方法，其包括： ?将唾液引入到容器中；以及 ?从所述容器中的所述唾液中移出上皮细胞，其中至少一种选自骨髓细胞和淋巴样细 胞的细胞类型被保留在所述容器中的所述唾液中。
19. 如权利要求18所述的方法，其中唾液由受试者通过从口中吐出、流出或滴下而引 入到所述容器中。
20. 如权利要求18所述的方法，其中移出上皮细胞包括向所述容器中的所述唾液中引 入被设置成结合上皮细胞的捕获装置，使所述上皮细胞结合到所述捕获装置，以及从所述 容器中移出结合有上皮细胞的所述捕获装置。
21. 如权利要求20所述的方法，其中所述捕获装置包含结合剂，所述结合剂结合上皮 细胞上的表面分子。
22. 如权利要求21所述的方法，其中所述表面分子是Ep-CAM。
23. 如权利要求18所述的方法，其进一步包括： ?在移出所述上皮细胞之后，使所述容器中的所述被保留的细胞裂解。
24. 如权利要求23所述的方法，其中所述容器包括被设置成接收所述唾液的第一区室 和包含裂解溶液的第二区室，其中所述第二区室由可破裂屏障与所述第一区室隔开并且其 中使所述被保留的细胞裂解包括破坏所述屏障以使所述裂解溶液与所述唾液混合。
25. 如权利要求23所述的方法，其进一步包括在使所述细胞裂解之前密封所述容器。
26. 如权利要求18所述的方法，其进一步包括： ?从所述容器中的所述唾液中移出细菌细胞。
27. 如权利要求18所述的方法，其进一步包括： ?将所述被移出的上皮细胞引入到第二容器中。
28. 如权利要求27所述的方法，其进一步包括使所述第二容器中的所述上皮细胞裂 解。
29. 如权利要求28所述的方法，其进一步包括在使所述上皮细胞裂解之前洗涤所述被 移出的上皮细胞。
30. 如权利要求20所述的方法，其进一步包括向所述容器中的所述唾液中引入被设置 成结合除上皮细胞以外的第二细胞的第二捕获装置，使所述第二细胞结合到所述第二捕获 装置，以及从所述容器中移出结合有上皮细胞的所述第二捕获装置。
31. 如权利要求18所述的方法，其进一步包括： ?从所述容器中的所述唾液中移出免疫细胞的子组。
32. 如权利要求18所述的方法，其进一步包括使所述容器中的所述唾液与非变性溶液 混合。
33. -种方法，其包括： ?将唾液引入到容器中；以及 ?用具有结合上皮细胞的部分的捕获粒子捕获所述容器中的所述唾液中的上皮细胞， 其中至少一种选自骨髓细胞和淋巴样细胞的细胞类型在所述容器中的所述唾液中保持呈 游离状态。
34. 如权利要求33所述的方法，其中所述捕获粒子是磁响应粒子并且所述方法进一步 包括用磁力隔离结合到捕获粒子的所述上皮细胞。
35. -种方法，其包括测定来自唾液样本的细胞上的端粒丰度的量度，其中所述细胞基 本上不含上皮细胞。
36. -种试剂盒，其包含： ?容器，所述容器具有开口并且适于接收液体样本； ?盖子，所述盖子被设置成可逆地密封所述开口；以及 ?捕获粒子，所述捕获粒子具有结合部分，所述结合部分结合上皮细胞，但基本上不结 合骨髓细胞和淋巴样细胞中的至少一种。
37. -种方法，其包括： ?测定来自受试者样本的源自唾液的细胞中的端粒丰度的量度；以及 ?使所述量度与以下各者相关联：（1)健康量度；（2)病理状态的风险；（3)端粒疾病； 或（4)药物响应性。
38. 如权利要求37所述的方法，其进一步包括： ?将唾液引入到容器中；以及 ?用具有结合上皮细胞的部分的捕获粒子捕获所述容器中的所述唾液中的上皮细胞， 其中至少一种选自骨髓细胞和淋巴样细胞的细胞类型在所述容器中的所述唾液中以源自 唾液的细胞形式保持呈游离状态。
39. 如权利要求37所述的方法，其中所述受试者样本包括针对淋巴样细胞和/或骨髓 细胞富集的唾液。
40. 如权利要求37所述的方法，其中所述端粒丰度的量度是相对丰度的量度。
41. 如权利要求40所述的方法，其中所述相对丰度的量度是相对于总受试者基因组 DNA的丰度的端粒DNA的丰度。
42. 如权利要求41所述的方法，其中所述相对丰度的量度是相对于基因组参考序列的 丰度的端粒DNA的丰度。
43. 如权利要求42所述的方法，其中所述基因组参考序列是单拷贝参考核苷酸序列 (例如，人β-球蛋白）或非端粒重复DNA(例如，Alu重复或着丝粒重复）的丰度。
44. 如权利要求37所述的方法，其中所述端粒丰度的量度是绝对丰度。
45. 如权利要求44所述的方法，其中绝对丰度是以端粒序列的长度测量的。
46. 如权利要求37所述的方法，其中所述测定端粒丰度的量度包括通过qPCR、DNA印 迹、核酸测序、原位杂交或流式FISH测量所述样本中的平均端粒长度。
47. 如权利要求46所述的方法，其中测量是以相对荧光单位（RFU)或通过 PicoGreen?来检测的。
48. 如权利要求37所述的方法，其中源自唾液的细胞主要是来自一个唾液腺。
49. 如权利要求37所述的方法，其包括使所述量度与健康量度相关联。
50. 如权利要求49所述的方法，其中所述健康量度是知觉应激的健康状况调查评分。
51. 如权利要求49所述的方法，其中所述病理状态的风险是疾病风险。
52. 如权利要求51所述的方法，其中所述疾病是老龄化疾病。
53. 如权利要求52所述的方法，其中所述老龄化疾病选自由心血管疾病、糖尿病、癌 症、肝纤维化和抑郁组成的组。
54. 如权利要求52所述的方法，其中所述老龄化疾病是心血管疾病并且其中低于群体 中的平均值的量度与增加的心血管疾病风险相关联。
55. 如权利要求54所述的方法，其包括使群体的最低两个或三个三分位数中的端粒丰 度的量度与相较于所述群体的最高三分位数中的量度显著较高的心血管疾病风险相关联。
56. 如权利要求52所述的方法，其中所述老龄化疾病风险进一步与从血液样本中测定 的所述端粒丰度的量度相关联。
57. 如权利要求378所述的方法，其包括使所述量度与端粒疾病相关联。
58. 如权利要求57所述的方法，其中所述端粒疾病选自由先天性角化不良、肺纤维化、 再生障碍性贫血和间质性肺炎组成的组。
59. 如权利要求37所述的方法，其包括使所述量度与药物响应性相关联。
60. 如权利要求59所述的方法，其中所述药物选自他汀类，其中短端粒长度与药物响 应性相关联；或伊美司他（GRN163L)，其中长端粒长度与药物响应性相关联。
61. 如权利要求37所述的方法，其进一步包括向所述受试者报告所述相关性。
62. 如权利要求37所述的方法，其进一步包括基于所述相关性向所述受试者提供诊断 或预后。
63. 如权利要求37所述的方法，其进一步包括基于所述相关性治疗所述受试者。
64. 如权利要求37至63所述的方法，其中所述群体与所述受试者是年龄匹配的。
65. -种用于监测受试者的状况的方法，其包括： ?从经过一定时段获取的多个源自唾液的受试者样本中的每个源自唾液的受试者样本 中的细胞中测定端粒丰度的量度； ?测定所述量度的差异；以及 ?使所述差异与端粒疾病的进展相关联，其中所述量度的降低指示所述疾病的进展。
66. 如权利要求65所述的方法，其进一步包括： ?将唾液引入到容器中；以及 ?用具有结合上皮细胞的部分的捕获粒子捕获所述容器中的所述唾液中的上皮细胞， 其中至少一种选自骨髓细胞和淋巴样细胞的细胞类型在所述容器中的所述唾液中以源自 唾液的细胞形式保持呈游离状态。
67. -种方法，其包括： ?发送包含有包括唾液的受试者样本的容器；以及 ?接收含有信息的电子传输信号，所述信息指示所述样本中的端粒丰度的量度的测定 结果或端粒丰度的量度与以下各者的相关性：（1)健康量度；（2)病理状态的风险；（3)端 粒疾病；或（4)药物响应性。
68. -种方法，其包括： ?测定来自多个受试者样本的源自唾液的细胞中的端粒丰度的量度的变化速率，每个 样本是在不同时间获取的；以及 ?使所述变化速率与以下各者相关联：（1)健康量度；(2)病理状态的风险；（3)端粒疾 病；或（4)药物响应性。
69. 如权利要求68所述的方法，其中所述端粒丰度的量度是平均端粒长度或短端粒的 百分比。
【文档编号】C12Q1/68GK104105798SQ201280068992
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2011年12月31日
【发明者】C·哈利 申请人:端粒健康公司