用于高效电子测序与检测的系统和方法

用于高效电子测序与检测的系统和方法
【专利摘要】本公开涉及用于高效率核酸电子测序和分子检测的系统和方法。在本公开的示例实施方式中，针对诸如DNA测序、DNA杂交或蛋白质检测等所关注的应用，可采用纳米针来检测由与诸如DNA或蛋白质等所关注的生物分子相关联的反荷离子浓度或德拜长度的调制所产生的阻抗变化。
【专利说明】用于高效电子测序与检测的系统和方法
[0001] 本申请要求 2011 年 12 月 1 日提交的、题为"GENIUS ELECTRONIC SEQUENCING TECHNOLOGIES AND METHODS THEREFOR"的美国临时申请No. 61/565,651 的优先权。美国临 时申请No. 61/565,651的公开内容通过引用而全文并入于此。
[0002] 本申请的主题涉及2010年10月4日提交的美国临时申请No. 61/389, 490、2010 年10月4日提交的美国临时申请No. 61/389, 484、2011年2月15日提交的美国临时申请 No.61/443, 167、2011年5月27日提交的美国临时申请Ν〇·61，491，081、2012年4月4日提 交的美国临时申请No. 61/620, 38U2012年2月15日提交的美国申请序号No. 13/397,581、 2012年10月1日提交的美国申请序号No. 13/632, 513以及2011年5月27日提交的美国 申请序号No. 13/118, 044,上述每个申请通过引用而全文并入于此。
[0003] 如在通过引用而全文并入于此的、题为"BIOSENSOR DEVICES, SYSTEMS AND METHODS THEREFOR"的美国公开专利申请No. US 2012/0138460中所描述的，纳米桥 (NanoBridge)可发挥pH传感器的功能。
[0004] 本申请涉及通过引用而全文并入于此的PCT/US2011/054769。
[0005] 本申请还涉及通过引用而全文并入于此的PCT/US2012/039880。

【背景技术】
[0006] 包括高通量DNA测序在内的用于快速而成本高效的遗传和生物分析的方法仍然 是发展个体化医疗及诊断试验的重要方面。当前的高通量或微型化系统具有局限性。例如， 当前用于DNA测序的系统--包括采用光学检测的系统--是笨重而昂贵的，并且具有有 限的通量。虽然一些系统使用传感器和测序流通池 （sequencing flow cell)来解决这些 局限，但它们一般为单次使用的一次性用品，这大幅增加了对用户的成本并且限制了传感 器的复杂度，因为必须针对单次使用而成本高效地制造传感器。
[0007] 需要用于遗传和生物分析的系统和方法，特别是需要既灵敏又成本高效的用于高 度并行或克隆测序反应的方法和系统。 纳米针（NanoNeedle)
[0008] 纳米针型生物传感器可以用于表征诸如抗体和抗原等生化物质，以及/或者用于 涉及DNA测序、DNA杂交、实时PCR、蛋白质或其他生物物质及化学物质检测中的一种或多种 的应用。
[0009] 在本公开的示例实施方式中，纳米针可用于针对诸如DNA测序、DNA杂交或蛋白质 检测等所关注的应用，来检测因关联于诸如DNA或蛋白质等所关注的生物分子的反荷离子 浓度或德拜长度（Debye length)的调制（modulation)而造成的阻抗变化。例如，在DNA测 序中，阻抗的变化与核苷酸的掺入相关联，并且这样的变化可用于检测掺入事件和DNA序 列的身份。核苷酸可按已知的顺序注入，从而允许通过经阻抗测量对掺入的检测，来识别互 补碱基。生物分子，诸如单链DNA，可附着到诸如微珠（bead)等载体上，或者可以直接结合 到衬底的表面上。
[0010] 纳米针的电极相对于它们与载体的距离的物理位置可影响阻抗测量的灵敏度， DNA结合到所述载体，该载体诸如微珠等。举例而言，如果在纳米针的电极与DNA所结合到 的诸如微珠等载体之间没有足够的物理对准，则传感器阻抗可能会被本体试剂的阻抗所主 导。举例而言，如果本体试剂的阻抗构成电极之间总阻抗的90%，并且微珠上的DNA及其关 联的反荷离子的阻抗构成电极之间总阻抗的10%，则DNA和关联的反荷离子的阻抗中1% 的变化将会导致电极之间总阻抗中〇. 1 %的变化。为了使传感器测量电极之间总阻抗的百 分比变化的能力最大化，同时使来自本体试剂的阻抗的干扰最小化，可以相对于传感器电 极离微珠的距离来更改传感器电极的位置。
[0011] 图1A提供了展示可由接收与发射电极100检测的各个路径的示意图。Cb和凡分 别代表因本体溶液而产生的电容和电阻。R DNA为因紧靠固定于微珠140上的模板DNA链120 的区域而产生的电阻。由于靠近并关联于（在微珠和/或DNA链的德拜层中的）固定的 DNA链的移动离子的改变的浓度，RDNA不同于Rb。因在固定于微珠140上的模板DNA链120 上的核苷酸掺入而造成的对R DNA的调制可以由纳米针用以检测掺入事件，从而检测DNA链 120的序列。Cdl为接收与发射电极100周围的双电层电容。
[0012] 还存在未示出的CDNA，其关联于微珠和固定在微珠上的DNA链，在模型中有效地与 RDNA并联作为集总元件。
[0013] 现参考图1B，为了测量因核苷酸掺入造成的电阻的改变，传感器可大致在中频 (mid-range frequency) 110下运行，以便帮助消除电极之间任何电容的影响。在一些实施 方式中，该运行条件如图1C中所示，取决于电极尺寸以及发射电极与接收电极的间距。该 图示出，如可由当进行例如用于DNA测序的核苷酸碱基对掺入的反应时电流相对于基线电 流的较大百分比变化看出，减小电极的长度可导致灵敏度的提高。在低频下，双电层电容可 主导阻抗，并且传感器对电阻变化的灵敏度可能变小。在非常高的频率下，两个电极之间的 寄生电容可能占主导地位。电流直接经过该区域，并且对电阻变化的灵敏度降低。因此，基 于电极尺寸和几何形状，可以实现针对最高传感器灵敏度的最佳运行条件。
[0014] 图1D提供了对一些潜在的电极实施方式和电极长度示例范围（1-3 μ m)的图示。 电极尺寸在长度、重量和深度上可为7nm至70nm，或者介于70nm至700nm之间或700nm至 7 μ m之间。图1E的电场线160示出离微珠最远的部分电极如何主要感测本体溶液180的 电阻或电容的变化。在离微珠最远的部分电极处的电场线具有从微珠远离的方向，指示出 电流路径经过试剂，而不是在微珠周围。在其中电极更小并且更靠近微珠的一些实施方式 中，电流的较大部分经过微珠，这可以提高传感器的灵敏度。可以存在最佳电极配置，该配 置增大基线电流并提高灵敏度，以便更好地检测DNA掺入事件。
[0015] 在一些实施方式中，可能期望使得用于诸如纳米针之类的传感器的传感器电极靠 近微珠，以便使可能存在于纳米针电极与微珠或颗粒之间的本体试剂（bulk reagent)体积 量最小化。一个实施方式可具有通过磁场或电场或者经由连接体的连接而被保持在平坦的 或大体平坦的表面上的微珠。一个实施方式可具有如图2A、图2B和图2C中所不的被保持 在凹陷（depression)中的微珠。
[0016] 如图2A中所示，凹陷可例如由诸如沉积在衬底202上的介电层203等材料所形 成，并且形成凹陷的材料可具有活性区域205以用于感测形成于所述材料上的目标反应。 电极204的活性区域205可感测目标分子和/或目标反应。凹陷可用于保留载体，诸如暴 露于本体溶液200的微珠201。
[0017] 图2B示出进一步的实施方式，其类似于图2A，不同之处在于具有较浅的凹陷以便 允许微珠201的更多的表面积暴露于本体溶液200。该实施方式可能是所期望的，因为微珠 210的表面积更多地暴露于本体溶液200,并且这可导致向微珠表面的更高效的试剂递送， 并且可允许更多的目标分子结合到该表面，从而潜在地增强可由活性区域205检测的来自 目标反应的信号。
[0018] 图2C示出纳米针传感器的进一步实施方式的俯视图，其中将活性区域205形成为 弧形，该弧形可吻合于形成到介电层203中的凹陷的边缘，并从而吻合于微珠的边缘。活性 区域205可连接至电极204,并且该纳米针实施方式暴露于本体溶液200以供检测目标分子 和/或反应。电极204可具有水平迹线或者可以直接延伸至位于下面的层中的读出电路，例 如CMOS读出电路。在高密度的纳米针传感器阵列中，能够由阵列中可具有不同形状和/或 尺寸的传感器的活性区域205来检测来自目标反应的信号。传感器阵列可为每一阵列100 至100000个传感器，或者1000000至1百万个传感器，或者1百万至1千万个传感器，或者 1千万至1亿个传感器，或者1亿至10亿个传感器。
[0019] 因此，电极可处于微珠或颗粒的表面以及与之附着或结合的DNA的德拜长度之 内。纳米针器件可允许由本体试剂溶液对纳米针电极之间总阻抗造成的最小影响，以及由 附着至或接合至微珠或颗粒的表面的DNA造成的最大影响。
[0020] 在一些其他实施方式中，可将微珠保持在无任何凹陷的平坦表面上。在此类实施 方式中，传感器或纳米针的电极可靠近DNA包覆的微珠，但不存在凹陷或凹洞，并且微珠被 置于平坦的或几乎平坦的表面上，由包括但不限于磁场或电场或不同的力的组合等虚拟 场力所保持。通过这种方式，在进一步的实施方式中，可以如图3中所示创造出"虚拟阱 (virtual well)"阵列。这些虚拟阱300还可称为"约束单元"300,这是因为在一些实施 方式中磁力或电力可将诸如模板DNA等目标颗粒约束在微珠320上或其附近。根据"虚拟 阱"或"约束单元"的结构和操作，它们可以充当"三维笼"或反应器。所述反应器可用于不 同的应用，诸如化学物质或生物物质的扩增、分离、约束、浓缩、检测。例如，其可用于高效率 DNA无乳剂扩增，或者高效率DNA或RNA合成，或者DNA杂交阵列等。
[0021] 在一个实施方式中，如图3所示，微珠320被装载到约束单元中，并且可具有已经 附着的目标颗粒，诸如DNA模板。可以将核苷酸或其他试剂注入到虚拟阱/约束单元阵列 中。在诸如DNA测序的目标反应完成并由诸如纳米针或纳米桥或其他类型传感器的传感 器检测之后，可以冲洗试剂、目标分子和微珠。该方法可以允许可重复使用的约束单元300 的阵列。使用约束单元来替代凹陷或物理阱可能是期望的，这是因为其可允许更容易地冲 洗微珠、试剂和目标分子，否则它们可能固着在凹陷中并且可能难以移除。在一个实施方式 中，电场可在微珠和/或模板DNA周围包含或移动核苷酸、DNA链或其他分子。
[0022] 在进一步的实施方式中，可以通过物理连接体（linker)将微珠放置到纳米传感 器阵列的衬底的表面。
[0023] 在替代实施方式中，如图4A中所示，可将一个电极405A直接附接至衬底402。可 以将纳米针上的第二电极405B附接在用于将微珠401或颗粒定位在固定位置的传感器413 的一部分上。微珠或颗粒因此与全部两个电极相接触，从而使本体试剂溶液400对纳米针 电极405A和405B之间总阻抗的影响最小化，这不同于因与微珠或颗粒以及附着或结合于 微珠或颗粒的DNA相关联的德拜长度内的反荷离子而产生的阻抗，即所关注的阻抗测量。
[0024] 在图4B中示出了如图4A中所示的实施方式的俯视图。该俯视图示出电极405A， 其可直接附接至衬底402,位于微珠401下方并与之靠近。第二电极405B可与传感器413 相接触，该传感器413用于将微珠401定位在固定的位置。
[0025] 在进一步的实施方式中，如图4C中所示，可将微珠401或颗粒在衬底402上保持 就位。纳米针的第一电极405A可直接附接至衬底402,或者附接至被粘附至所述衬底的粘 附层（未示出）。继而可制造介电层414,以便覆盖所述第一电极。继而可在纳米针的介电 质和所述第一电极之上制造纳米针的第二电极405B。第二电极可比第一电极更短。由于电 极之间长度的差异，可以创造出斜坡，以便吻合于微珠的曲线。所述长度差异可以是微珠或 颗粒的直径、以及两个电极和电极之间的电介质的厚度的函数。通过这种方式，电极可与微 珠相接触，或者可以极其靠近微珠，使得因与微珠或颗粒以及附着或结合至微珠或颗粒的 DNA相关联的德拜长度内的反荷离子所产生的阻抗大于本体试剂溶液400的阻抗。
[0026] 在一些实施方式中，微珠或颗粒在衬底上的放置可经由物理阱或凹陷来进行，或 者，也可以通过经磁力或电力或者经连接体机构和/或化合物的物理结合或者两种或更多 种所述方法的组合保持微珠来实现。
[0027] 通过使用介电衬底来屏蔽电极也可最大化由传感器进行的阻抗测量。所述衬底可 由玻璃、石英、塑料或任何其他介电材料所构成或制成。在一些实施方式中，可以由诸如氧 化硅、氮化硅或其他氧化物层或者甚至诸如聚二甲基硅氧烷（PDMS)、SU8或其他聚合物的 聚合物之类的介电层来覆盖硅衬底。使用这种类型的衬底以便使流经衬底的电流最小化， 从而增强微珠周围的阻抗的变化并使输出到传感器的期望信号最大化。
[0028] 在另一实施方式中，一个或全部两个电极的一些部分可由介电层所覆盖。在一些 实施方式中，最靠近微珠或DNA的电极的部分保持无覆盖。这些实施方式可通过对电极加 以屏蔽来优化传感器的阻抗测量。这些配置可协助防止对来自本体溶液的阻抗的测量。
[0029] 在一个实施方式中，一个或全部两个电极的尖端涂覆有薄介电层。这种薄介电层 提供电极与溶液之间的屏障，从而减少腐蚀量和/或降低腐蚀速率。通过这种方式，有涂层 电极的有效寿命可相比于无薄介电层的电极的寿命得到延长。所述层的厚度可介于〇. 3nm 至10nm之间，并且在一些实施方式中该厚度可大于10nm。
[0030] 这种涂层还可允许从可能在暴露于本体溶液时不发挥期望作用的更宽范围的电 极材料中进行选择。例如，可以选择易受腐蚀的铝、铜、钨或其他材料作为电极材料，并且将 其涂覆薄介电层。这样还允许选择可能与CMOS制造工艺不兼容的材料。此外，这样允许选 择可能较为便宜的材料。这种薄介电层可经由原子层沉积（ALD)或其他制造技术来涂覆。 纳米针可在交流（AC)模式下运行，并且因此信号可穿过薄介电层。在一个实施方式中，电 极材料可由硅或其他半导体材料制成，诸如由掺杂多晶硅或掺杂晶体硅制成。该材料可具 有天然氧化物层或掺杂薄层。
[0031] 在一些实施方式中，除了电极附近的介电层之外，可能还存在接地层或屏蔽层 (或者起屏蔽作用的低阻抗导电层）。在进一步的实施方式中，接地/屏蔽层位于衬底基层 中，例如，位于硅基底中。该接地/屏蔽层可为金属，举例而言，诸如铜、铝、钼、金或其他金 属。接地/屏蔽层可减少来自本体溶液或来自基底材料的信号干扰，使得经过电极的信号 被优化，以便测量因核苷酸掺入而造成的电导（conductance)变化。在另一实施方式中，接 地/屏蔽层可位于电极上方并被介电层所包围。接地/屏蔽层可减少来自本体溶液的信号 干扰，因为可阻止本体溶液中的变动或噪声影响不靠近于传感器的电极或电极迹线。
[0032] 在一个实施方式中，接地/屏蔽层可覆盖发射电极的一部分，但不覆盖接收电极。 在另一实施方式中，可以使用两个单独的接地/屏蔽层来覆盖接收电极的部分和发射电极 的部分。所述用于发射电极和接收电极的单独的接地/屏蔽层可在电极之间提供附加的隔 离，并进一步提高系统的灵敏度以便测量因核苷酸掺入而造成的电导变化。
[0033] 在一些实施方式中，纳米针可与关联于一个或全部两个电极的一个或多个局部电 容器相耦合，以便防止因来自驱动器电路的直流（DC)偏压电平所造成的影响，或者防止来 自芯片传感器内的泄漏影响到输出信号。
[0034] 纳米针可制造成平面结构，或者可制造成同轴结构。纳米针结构可制造成纳米针 的阵列，从而允许同时对大量的单个DNA分子进行测序。如图4D中所示，可以将聚合酶或 连接体分子附着到传感器的表面，例如附着在两个电极之间的介电层上，或者附着至所述 电极中之一，并且继而DNA链可以掺入核苷酸，从而导致改变两个电极之间的可检测阻抗。
[0035] 在替代实施方式中，可以使用其他分子和测定，尤其是允许对诸如其他酶促反应 等单个分子反应的动力学进行检测的那些分子和测定。纳米针或纳米桥阵列可用于检测单 个或多个分子以供DNA测序。
[0036] 在一些实施方式中，所述阵列为如图5A中所示的纳米针阵列，该图中同时图示了 纳米针的特写图（左）和纳米针阵列的俯视图（右）。纳米针传感器的特写图示出这样的 实施方式：其中传感器的宽度为1 μ m并且与目标分子所位于的微流体通道相接触。图5B 为处于微流体通道中的纳米针传感器的一个实施方式的俯视图的显微照片。在一些实施 方式中，信号放大发生在所述通道中，并且由纳米传感器所检测。由于放大发生在微流体 通道内或包含纳米传感器阵列的纳米传感器芯片附近，而将该过程称为片上放大（on-chip amplification) 〇
[0037] 在一个实施方式中，这种片上放大可以通过使用化学反应或过程来进行，以放大 信号。例如，在一些实施方式中，可以使用诸如T4聚合酶的聚合酶来放大靠近微珠和传感 器的区域中的无机焦磷酸盐或PPi浓度。例如，在一个实施方式中，可以使用诸如焦磷酸盐 的酶来将二磷酸盐或焦磷酸盐分成两个磷酸基团，从而产生不同的离子浓度。可以使用不 同的化学放大法来提高用纳米传感器进行的信号检测。在一些实施方式中，使用靠近纳米 传感器的局部放大器来进行信号放大。
[0038] 图6示出纳米针阵列的示意图，并在顶部有纳米针传感器600的特写图。在纳米针 的一些实施方式中，电极620部分地由介电层640所覆盖并搁置在介电层640上。在一些实 施方式中，纳米针传感器可包含两个跨圈的（inter-circled)或"同轴尖（coaxial tip)" 电极或者类似的形状。
[0039] 在图7中所示的进一步的实施方式中，纳米针或纳米桥传感器阵列关联于载体， 例如微珠740,以便结合诸如DNA等目标分子以供DNA测序。纳米传感器700可邻近能够保 留磁珠740的磁区720。所述阵列暴露于本体溶液760,其中引入诸如DNA和核苷酸（dNTP) 等目标颗粒和试剂以用于所关注的反应，例如DNA测序。磁区720可形成于结构如图7中 所示的矩形条中或者形成为任何其他形状，例如圆形或正方形或其他形状，以便将微珠捕 获在磁区上或磁区附近。
[0040] 在一些实施方式中，纳米针可经由DC信号来运行。测量可以通过检测DC信号（例 如，电流）的变化和/或电场的调制或者两个电极之间离子浓度的变化来实现。在一个实 施方式中，可将电解（氧化还原反应）速率的变化用作对发生所关注的反应的指示，例如， 在DNA测序中这样的变化可指示出核苷酸的掺入。这样的变化可因与两个电极之间的离子 浓度相关联的阻抗调制而发生。这种离子浓度的变化还可由诸如质子、无机焦磷酸盐（PPi) 等与核苷酸掺入相关的副产物所造成，或者由因 DNA分子的负电荷增加而产生的反荷离子 浓度所造成。
[0041] 在一些实施方式中，可以使用化学层来放大信号和/或氧化/还原效应。这些化 学层还可减少在电极处的气泡形成。对于此类实施方式，可以使用诸如具有可逆氧化还原 性质的材料或聚合物，例如，氢醌（HQ)和对苯醌（Q)。
[0042] 在一些实施方式中，可以向微流体纳米阵列的流添加作为HQ与Q的复合物的醌氢 醌（QH)。通过增加 QH的浓度以增大电流，可以发生QH在电极上的成膜和沉积。HQ浓度增 加越大，就有越多的分子在电极附近可用于还原氧化（氧化还原）反应。如果HQ的浓度低， 则在短时间段之后电极周围的区域可能耗尽一种产物（例如，阳极附近的H2Q和阴极附近 的Q)，而反应可在此时停止。在一些实施方式中，可能期望浓度足够高以便确保有充足的 H2Q在阳极电极附近可用或者扩散以继续反应。在一个实施方式中，诸如纳米针等传感器可 在非常低的频率下运行，以便电极可在阳极作用与阴极作用之间切换，其中HQ、Q和H2Q可 以总是在电极附近可用。所述低频率可为〇. 01Hz至10Hz，或者10Hz至1000Hz，或者更高。 在一些实施方式中，可基于HQ产物浓度和在缓冲液中的扩散速率来优化该低频率。所施加 的电压可以是低频信号与高频信号的组合。
[0043] 在水在纳米传感器阵列中单元的正电极附近水解的情况下，可能生成02气泡和H+ 离子。在一些实施方式中，可以通过向溶液中添加化学物来克服气泡问题，其中该化学物的 放电电位低于水，因此不生成气体。如图8中所示，HQ具有比水低的水解电压（分别为0.6V 与1. 2V)，并因此具有较低的放电电位，这可允许通过电极施加较低的电压而由此产生的信 号与无 HQ的溶液相比可能相同或增大。HQ-Q氧化还原反应可以解决气泡问题，但氧化还原 反应可生成H+离子，从而降低pH。在进一步的实施方式中，可以通过向测序和/或扩增缓 冲液中添加 HQ以便调控pH使其可更接近于期望的pH(例如，大约为7的pH水平）来解决 这个问题。
[0044] 在一些实施方式中，纳米针可配置成操作作为温度传感器和/或pH传感器，以检 测核苷酸掺入。该方法在全文并入于此的题为"Heat and pH measurement for sequencing of DNA"的美国专利申请2008/0166727中有进一步描述。
[0045] 在一些实施方式中，如图9A、图9B和图9C中所示，传感器可为纳米桥传感器，其 中可将活性区域制造成使得所述活性区域部分地包围微珠或颗粒，并且紧邻所述微珠或颗 粒。
[0046] 图9A为"环"纳米桥的侧视图，其中活性区域905的内部部分处于微珠601或颗 粒和可与之结合的DNA的德拜长度之内。活性区域可整体处于所述微珠或颗粒的德拜长度 之内，从而导致整个活性区域的阻抗响应于与微珠或颗粒相结合或关联的电荷的变化和/ 或核苷酸或核苷酸类似物的掺入事件而变化。电导体904提供了用于测量活性区域905的 阻抗的手段。所述环及关联的支撑结构903的直径的大小可设定成使得微珠紧密贴合在所 述环内，并且可位于衬底902之上。在一些实施方式中，纳米桥的电导或阻抗的变化是由于 离子浓度调制的影响，例如，由于核苷酸掺入而对诸如质子等离子的释放或无机焦磷酸盐 的释放。
[0047] 可选地，如图9B中所示，环905和支撑结构903的尺寸可设定成小于微珠901或颗 粒的直径，使得微珠可搁置在环上--特别是当其由磁阵列或电场所保持时--从而确保 所述环处于微珠或颗粒以及与之结合的DNA的德拜长度之内。环结构还可用于其他结构。
[0048] 图9C为使用环结构实现的纳米桥的俯视图，其示出微珠901重叠在传感器的活性 区域905上，以及可提供用以测量活性区域905的阻抗的手段的电导体904。
[0049] 根据输出信号的期望特性，可以选择图9A中所示的实施方式或图9B中所示的实 施方式。在图9A中所示的实施方式中，纳米桥的电阻可大于图9B中所示纳米桥的电阻。这 可归因于图9A中所示纳米桥环由于其在微珠的较宽部分周围的放置而造成的周长增大。 电阻与面积相关，如以下公式所描述 ：

【权利要求】
1. 一种用于感测流体中的局部化学扰动或电扰动的装置，该装置包括： 一个或多个传感器，其配置为检测邻近反应载体上的化学反应或生物反应的流体的阻 抗、电荷、pH和温度中的一项或多项的变化，从而生成指示出所述生物反应或化学反应的信 号； 支撑衬底，其包含流体通道，该流体通道配置为将包含反应底物或生物材料的流体传 递越过反应载体； 至少两个电极， 其中所述电极测量靠近反应事件的环境中的稳态变化，并且可选地测量至少一个瞬态 事件， 其中至少一个传感器的形状和/或相对于所述反应载体的接近度实质地增大相对于 所述流体的阻抗、电荷、pH和/或温度的所述变化。
2. 根据权利要求1的装置，其中所述稳态变化是由于邻近所述化学反应或生物反应的 环境或流体周围的德拜长度的调制。
3. 根据权利要求1的装置，其中至少一个传感器的电极处于所述反应载体的德拜长度 之内。
4. 根据权利要求1至3的装置，其中该装置为基本上是平面的纳米传感器阵列。
5. 根据权利要求1至4的装置，其中所述稳态变化或瞬态变化是由于靠近所述化学反 应或生物反应或者靠近所述电极的环境或流体周围的离子浓度的改变。
6. 根据权利要求5的装置，其中与所述化学反应或生物反应相关联的所述离子浓度的 改变可来自移动离子或固定离子。
7. 根据权利要求1至6中任一项的装置，其中所述反应为DNA测序反应，并且所述传感 器测量与一个或多个核苷酸向DNA链或DNA链的克隆群中的掺入相关联的阻抗。
8. 根据权利要求1至6中任一项的装置，其中所述反应为多核苷酸的扩增。
9. 根据权利要求1至8中任一项的装置，其中所述化学反应涉及直接或间接结合至所 述反应载体的目标生物材料。
10. 根据权利要求9的装置，其中所述反应载体为微珠。
11. 根据权利要求10的装置，其中所述微珠被可逆地保持靠近所述传感器。
12. 根据权利要求11的装置，其中所述微珠被保持在凹陷中。
13. 根据权利要求11或12的装置，其中所述传感器电极形成基本上吻合于所述凹陷和 /或微珠的边缘的弧形。
14. 根据权利要求11的装置，其中至少一个传感器的电极将所述微珠定位在固定位 置，并且所述传感器的第二电极与所述微珠下方的所述传感器的表面相接触。
15. 根据权利要求11的装置，其中至少一个传感器的两个电极被制造于所述微珠下方 的所述衬底上，并且形成基本上吻合于所述微珠的形状的斜坡。
16. 根据权利要求9至15中任一项的装置，其中所述微珠为磁性的。
17. 根据权利要求16的装置，其中所述微珠由电场或磁场中的至少一个来保持。
18. 根据权利要求9至15中任一项的装置，其中所述微珠由物理连接体来保持。
19. 根据权利要求1至18中任一项的装置，其中所述传感器的一个或多个电极由介电 衬底所屏蔽。
20. 根据权利要求19的装置，其中所述电极的一部分由介电层所覆盖。
21. 根据权利要求19的装置，其中一个或多个电极的尖端涂覆有薄介电层，或者一个 或多个电极的尖端保持不被介电层所覆盖。
22. 根据权利要求1至21中任一项的装置，其中所述传感器运行于AC模式、DC模式或 全部两种模式之中的至少一种模式下。
23. 根据权利要求22的装置，其中所述支撑衬底包含接地层。
24. 根据权利要求22的装置，其中所述接地层位于所述电极之上，并由介电层所包围。
25. 根据权利要求23的装置，其中所述接地层覆盖发射电极的一部分，但不覆盖接收 电极。
26. 根据权利要求1至25中任一项的装置，还包括与至少一个电极相关联的至少一个 局部电容器。
27. 根据权利要求1至26中任一项的装置，其中所述传感器为纳米桥。
28. 根据权利要求27的装置，其中所述纳米桥形成围绕所述微珠的环结构。
29. 根据权利要求28的装置，其中所述纳米桥环的尺寸显著提高信噪比。
30. 根据权利要求27至29中任一项的装置，其中所述纳米桥包含电导体，该电导体连 接至所述纳米桥的重掺杂区。
31. 根据权利要求1至26中任一项的装置，其中所述纳米传感器为纳米针。
32. 根据权利要求31的装置，其中所述纳米针形成围绕所述微珠的环结构。
33. 根据权利要求1至32中任一项的装置，还包括参考电极。
34. 根据权利要求33的装置，还包括背栅。
35. 根据权利要求34的装置，其中所述背栅是分段的。
36. 根据权利要求1至35中任一项的装置，还包括积分器，该积分器与所述传感器合 并。
37. 根据权利要求36的装置，其中所述积分器包括与所述传感器相关联的电容器。
38. 根据权利要求1至37中任一项的装置，还包括多个读出端口，该多个读出端口可选 地位于所述支撑衬底的一个或多个边角或侧边处。
39. 根据权利要求1至38中任一项的装置，包括选自Fin FET、纳米针、纳米桥、ISFET、 CHEMFET、pH传感器和微悬臂之中的至少一种传感器。
40. 根据权利要求1至39中任一项的装置，还包括富集模块，该富集模块用于将包含带 电目标分子的反应载体与不包含带电目标分子的反应载体相分离。
41. 根据权利要求40的装置，其中所述富集模块包含微流体通道、配置用于传递所述 反应载体的第一流体输入、配置用于传递缓冲溶液的第二流体输入、收集带有所述带电目 标分子的反应载体的第一输出端口、收集无所述带电目标分子的反应载体的第二输出端 口；以及用于朝着所述第一输出端口引导包含所述带电目标分子的所述反应载体的电场生 成组件。
42. 根据权利要求41的装置，其中存在用于分离带有所述带电目标分子的反应载体的 多个输出端口。
43. 根据权利要求41至42中任一项的装置，其中所述电场生成为与流动路径相垂直。
44. 根据权利要求40至43中任一项的装置，其中所述带电目标分子为多核苷酸。
45. 根据权利要求1至44中任一项的装置，还包括多个电极，多个电极该关联于每个传 感器，并且配置为通过生成电场来形成约束单元。
46. 根据权利要求1至45中任一项的装置，还包括与所述至少一个传感器相关联的张 弛振荡器电路。
47. -种用于感测流体中的局部化学扰动或电扰动的装置，该装置包括： 一个或多个传感器，其配置为检测邻近化学反应或生物反应的流体的阻抗、电荷、pH和 温度中的一项或多项的变化，从而生成指示出所述生物反应或化学反应的信号； 支撑衬底，其包含流体通道，该流体通道配置为将包含反应底物或生物材料的流体传 递越过反应载体； 至少两个电极， 其中所述检测是通过对所述电极之间的阻抗调制的直接测量而进行的，该阻抗调制是 由于因所述电极之间溶液中的所述反应而产生的德拜层调制或所述生物分子周围的移动 离子浓度的变化所造成的， 其中至少一个传感器的形状和/或相对于所述反应载体的接近度实质地增大相对于 所述流体的阻抗、电荷、pH和/或温度的所述变化。
48. -种用于检测生物反应或化学反应的方法，包括：在根据权利要求1至47中任一 项的装置中传递含有一种或多种反应底物或生物分子的本体流体，以及测量pH、电荷、阻抗 和温度变化之中的一项或多项。
49. 根据权利要求48的方法，其中所述反应为DNA测序反应。
50. 根据权利要求49的方法，还包括基于所述反应载体上的DNA的长度来调节传感器 的电压。
51. 根据权利要求50的方法，其中传感器信号包括稳态阻抗测量。
52. 根据权利要求51的方法，其中向反应供应适合于DNA合成的缓冲液以用于核苷酸 掺入，随后供应低离子强度缓冲液以用于指示核苷酸掺入的稳态阻抗测量。
53. 根据权利要求48至52中任一项的方法，还包括使用差分测量来从由所述测量产生 的输出信号中移除噪声。
54. 根据权利要求53的方法，其中所述差分测量采用一个或多个空反应载体作为参 考。
55. 根据权利要求53的方法，其中所述差分测量采用所述装置中不具有生物反应或化 学反应的区域作为参考。
56. 根据权利要求53的方法，其中所述差分测量采用无反应载体的传感器作为参考。
57. 根据权利要求53至56中任一项的方法，其中所述反应载体为磁珠。
58. 根据权利要求53的方法，其中所述差分测量采用相邻传感器作为参考。
59. 根据权利要求53至58中任一项的方法，其中所述差分测量采用所述装置中的传感 器区域作为参考。
60. 根据权利要求53至59中任一项的方法，还包括使用串扰反褶积函数矩阵来从所述 输出信号中移除噪声。
61. 根据权利要求53至60中任一项的方法，其中基于让试剂团穿越流通池所需的时间 来利用所述差分测量。
62. 根据权利要求48至61中任一项的方法，还包括通过将传感器电子器件的读出与试 剂团穿过流通池的移动相同步来减少所述装置的数据输出。
63. -种装置，包括： 微流体通道； 第一流体输入，其配置用于传递载体微珠； 第二流体输入，其配置用于传递缓冲溶液； 第一输出端口，其收集具有较高电荷密度的载体微珠； 第二输出端口，其收集具有较低电荷密度的载体微珠；以及 电场生成组件，其用于朝向所述第一输出端口引导具有较高电荷密度的载体微珠。
64. 根据权利要求63的装置，其中所述较高电荷密度是由于关联的多核苷酸引起的。
65. 根据权利要求64的装置，其中所述多核苷酸为多核苷酸的克隆群。
66. 根据权利要求63或65中任一项的装置，其中所述电场生成为与流动路径相垂直。
67. 根据权利要求63至66中任一项的装置，其中所述微流体通道配置用于减少电渗 流。
68. 根据权利要求63至67中任一项的装置，其中所述缓冲溶液配置用于减少电渗流。
69. 根据权利要求63至68中任一项的装置，其中所述装置功能耦合至纳米传感器阵 列。
70. 根据权利要求69的装置，其中所述载体微珠为磁珠。
71. 根据权利要求70的装置，其中所述纳米传感器阵列包含磁区阵列，每个所述磁区 配置为将所述微珠中之一保持靠近至少一个传感器。
72. 根据权利要求71的装置，其中每个传感器具有多个关联的电极，所述电极配置用 于产生电场约束单兀。
73. -种用于将具有较高电荷密度的载体微珠与具有较低电荷密度的载体微珠相分离 的方法，包括：沿着根据权利要求63至72中任一项的微流体通道传递载体微珠和缓冲溶 液，以及施加电场以便朝向第一输出端口引导具有较高电荷密度的载体微珠。
74. -种用于约束或浓缩流体中的带电材料的装置，包括： 位于衬底上的多个磁结构，所述磁结构配置用于磁性载体的固位； 多个电极，其配置用于通过电场将所述带电材料约束在所述磁结构附近； 供应电信号的源，该源连接至所述至少一个电极以供生成电场，其中所述电信号具有 基本上不干扰靠近所述磁性载体的化学反应或生物反应的波形。
75. 根据权利要求74的装置，其中所述波形是移除了正弦曲线顶部附近的电压的经修 改的正弦波形。
76. 根据权利要求74或75的装置，其中所述信号在循环期间被中断一次到多次。
77. 根据权利要求74至76中任一项的装置，其中所述电信号为DC信号、AC信号或同 时具有AC分量和DC分量的混合信号之中的至少一种。
78. 根据权利要求77的装置，包括一个或多个内电极以及一个或多个外电极。
79. 根据权利要求78的装置，其中所述一个或多个内电极具有交替的正电荷和负电 荷。
80. 根据权利要求78的装置，其中所述一个或多个外电极具有负电荷。
81. 根据权利要求74至80中任一项的装置，其中所述电极的一些部分覆盖有介电材 料。
82. 根据权利要求81的装置，其中靠近所述磁性载体的所述电极的尖端覆盖有薄介电 层。
83. 根据权利要求74至82中任一项的装置，其中所述装置包括微流体通道。
84. 根据权利要求83的装置，其中所述通道的高度为所述磁性载体的高度的至少3-5 倍。
85. 根据权利要求83的装置，其中所述磁结构为铁磁性或顺磁性的。
86. 根据权利要求85的装置，其中所述磁结构用粘附层磁化。
87. 根据权利要求85的装置，其中所述磁结构具有夹心层成分。
88. 根据权利要求85的装置，其中所述夹心层包含交替的非磁性材料层和磁性材料 层。
89. 根据权利要求85的装置，其中所述非磁性材料和磁性材料分别为铬和钼。
90. 根据权利要求85的装置，其中所述磁结构还包含至少一个基层。
91. 根据权利要求85的装置，其中所述磁结构还包含至少一个氧化物层。
92. 根据权利要求85至91中任一项的装置，其中多个磁结构具有尖锐的边缘。
93. 根据权利要求74至92中任一项的装置，其中约束单元中的多个磁结构创造出间 隙。
94. 根据权利要求93的装置，其中磁性载体搁置在所述间隙内。
95. 根据权利要求74至92中任一项的装置，其中有一个或多个磁体关联于所述微流体 通道并且位于所述电极和关联于所述电极的磁体对面。
96. 根据权利要求95的装置，其中关联于所述微流体通道的磁体为磁性层。
97. 根据权利要求74至96中任一项的装置，还包括用于递送或移除带电材料和/或反 应底物的沟槽。
98. 根据权利要求97的装置，其中所述沟槽关联于所述载体，使可用于所述带电材料 的载体的表面积最大化。
99. 根据权利要求74至98中任一项的装置，其中磁体与所述电极相接触并位于其上 方。
100. 根据权利要求74至98中任一项的装置，其中磁体与所述电极相接触并位于其下 方。
101. 根据权利要求74至100中任一项的装置，其中所述带电材料为DNA。
102. 根据权利要求74至101中任一项的装置，其中所述电场为介电电泳的或电泳的。
103. 根据权利要求74至102中任一项的装置，还包括由所述一个或多个磁结构中的多 个磁结构固位的磁性载体。
104. 根据权利要求103的装置，其中所述磁性载体为磁珠。
105. 根据权利要求104的装置，其中所约束的带电材料为DNA或dNTP中的至少一种。
106. 根据权利要求105的装置，其中目标生物分子通过连接体结合至所述载体。
107. -种系统，其包含根据权利要求74至106中任一项的装置，以及根据权利要求1 至47中的一项或多项的装置，以及/或者根据权利要求63至72中的一项或多项的装置。
108. -种用于测量通过DNA聚合酶进行的DNA碱基掺入的分布的方法，包括： 在微流体腔室中提供模板DNA的引物区域； 向所述微流体腔室添加 DNA聚合酶和至少一种核苷酸以供掺入； 测量靠近掺入事件的环境中的稳态变化，以及可选地测量至少一个瞬态事件。
109. 根据权利要求108的方法，包括测量选自掺入反应的副产物的增加、流体环境的 阻抗、pH或温度的环境的变化。
110. 根据权利要求108的方法，其中核苷酸掺入发生在含有核苷酸掺入所需的离子成 分的缓冲液溶液中，并且在低离子强度缓冲液中测量稳态变化。
111. 根据权利要求110的方法，包括： 对有可能的全长进行测序反应，使经延伸的引物链解链，引入新的引物，以及继续进行 合成反应。
112. -种用于非常靠近地进行多个测序反应的方法，包括：使所述测序反应的成分与 在载体上隔开的DNA模板相接触，以便减少位阻。
113. 根据权利要求112的方法，其中通过使模板接触与双链或单链DNA形成复合物并 且大于聚合酶的结合部分来间隔开所述DNA模板，以及使间隔开的DNA模板在核苷酸掺入 条件下接触所述聚合酶。
114. 根据权利要求113的方法，其中所述部分为持续性聚合酶。
115. 根据权利要求108至114中任一项的方法，其中每次添加一种dNTP，并测量掺入。
116. 根据权利要求108至115中任一项的方法，其中在阵列上进行平行的测序反应。
117. 根据权利要求116的方法，其中每个反应涉及传感器和约束单元，所述约束单元 由电场形成。
118. 根据权利要求116或117的方法，其中所述测序反应发生在微珠阵列上。
119. 根据权利要求118的方法，其中所述微珠为磁性的，并且由磁结构保持靠近所述 传感器。
120. 根据权利要求119的方法，其中传感器电极处于微珠的德拜长度之内。
121. -种用于多核苷酸测序的系统，该系统包括适于感测核苷酸向多个多核苷酸的掺 入的多个传感器，以及多个积分器，所述多个积分器中的每一个耦合至所述多个传感器中 之一并且适于减少所述多个传感器中的每一个中的噪声。
122. 根据权利要求121的系统，其中所述系统适于测量电荷积聚而不是电流。
123. -种用于通过感测用第一聚合酶进行的在DNA上的核苷酸掺入来减少DNA测序中 的位阻的方法，该方法包括使用选自大于所述第一聚合酶的第二聚合酶以及与DNA结合的 蛋白质或部分的化合物，使得该化合物帮助将DNA分隔开并从而减少位阻。
124. 根据权利要求123的方法，其中所述第二聚合酶是持续性聚合酶。
125. -种用于减少碳酸对用于感测核苷酸向多核苷酸的掺入的pH测量的影响的方 法，该方法包括使用两种缓冲液来同时提供足够的缓冲和低离子强度。
126. 根据权利要求125的方法，其中使用组合的Tris和HEPES来贡献于缓冲。
127. -种用于减少来自多核苷酸载体的电荷的方法，该方法包括改变所述多核苷酸载 体的表面上的S0 4的量。
128. -种用于减少来自多核苷酸载体的电荷的方法，该方法包括在所述多核苷酸载体 的表面上添加一定量的负电荷。
129. 根据权利要求128的方法，其中所述负电荷的量足以减少多核苷酸或核苷酸与所 述多核苷酸载体的表面的结合，但不足以影响耦合至所述多核苷酸载体的传感器的动态范 围。
130. -种用于通过感测核苷酸向多核苷酸的掺入来进行多核苷酸测序的方法，该方法 包括向多核苷酸上提供四种核苷酸或核苷酸类似物，其中所述四种核苷酸或核苷酸类似物 中的三种为不可掺入的核苷酸类似物。
131. 根据权利要求130的方法，其中所述不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物选自：PNA 核苷酸、LNA核苷酸、单磷酸腺嘌呤、二磷酸腺嘌呤、腺苷、脱氧腺苷、单磷酸鸟嘌呤、二磷酸 鸟嘌呤、鸟苷、脱氧鸟苷、单磷酸胸腺嘧啶、二磷酸胸腺嘧啶5-甲基尿苷、胸苷、二磷酸胞嘧 啶、尿苷和脱氧尿苷。
132. 根据权利要求130的方法，其中核苷酸及核苷酸类似物的浓度水平匹配于相对聚 合物活性。
133. 根据权利要求130的方法，其中不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物的浓度水平高 于针对可掺入核苷酸的等效聚合酶结合效率的浓度水平。
134. -种用于利用传感器来感测多核苷酸上的核苷酸掺入的方法，该方法包括将所述 传感器耦合至张弛振荡器电路，以生成具有与传感器电导成正比的频率的时钟信号。
135. -种用于在多核苷酸测序中使用试剂的方法，该方法包括使用至少两种不同的试 齐U，其中第一试剂至少用于提高聚合酶准确度和降低失相中之一，并且其中第二试剂用于 提高感测装置的准确度。
136. -种用于多核苷酸测序的系统，该系统包括衬底和纳米针装置，该纳米针装置适 于感测核苷酸向多核苷酸的掺入，所述纳米针具有第一电极和第二电极，所述第一电极直 接附接至所述衬底，所述第二电极附接在传感器上，该传感器用于将多核苷酸载体定位在 基本上固定的位置上。
137. -种用于多核苷酸测序的系统，该系统包括衬底和纳米针装置，该纳米针装置适 于感测核苷酸向多核苷酸的掺入，所述纳米针具有第一电极和第二电极，所述第一电极直 接附接至所述衬底或粘附层，所述第二电极位于介电层之上，该介电层覆盖所述第一电极。
138. -种用于多核苷酸测序的系统，该系统包括纳米针装置，该纳米针装置适于感测 核苷酸向多核苷酸的掺入，所述纳米针耦合到至少一个电容器，以减少来自驱动电路的DC 偏压电平的影响和来自芯片传感器的泄漏之中的至少一项。
139. -种用于多核苷酸测序的系统，该系统包括适于感测核苷酸向多核苷酸的掺入的 纳米桥传感器，该纳米桥传感器具有活性区域，该活性区域部分地包围并紧邻多核苷酸载 体。
140. 根据权利要求139的系统，其中所述多核苷酸载体为微珠。
141. 根据权利要求140的系统，其中所述微珠为磁性的。
142. 根据权利要求139的系统，其中所述活性区域的内部处于所述多核苷酸载体的德 拜长度之内。
143. 根据权利要求139的系统，其中所述活性区域小于所述多核苷酸载体的直径。
144. 一种用于多核苷酸测序的系统，该系统包括适于感测核苷酸向多核苷酸的掺入的 纳米桥传感器，该纳米桥传感器具有活性区域，所述活性区域被重掺杂以提供更好的电连 接。
145. -种用于多核苷酸测序的系统，包括适于检测由核苷酸向多核苷酸的掺入所产生 的电荷、pH和阻抗变化中的一项或多项的多个纳米传感器，所述多个纳米传感器具有附加 的参考电极以提供商动态范围和商灵敏度。
146. 根据权利要求145的系统，其中可在所述参考电极与多个纳米传感器的活性区域 之间外加可变电压。
147. 根据权利要求145的系统，其中所述多个传感器为ChemFET和非桥式传感器中之 〇
148. -种用于多核苷酸测序的方法，该方法包括通过测量核苷酸向多核苷酸的掺入的 副产物来测量所述核苷酸掺入。
149. 根据权利要求148的系统，其中所述副产物包括PPi和水合氢离子中的至少一种。
150. 根据权利要求148的系统，其中在所述核苷酸掺入期间有效进行副产物的测量。
【文档编号】C12Q1/68GK104105797SQ201280068919
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2012年12月3日 优先权日:2011年12月1日
【发明者】H·埃斯范德亚珀 申请人:吉纳普赛斯股份有限公司