用于对尿液样品进行染色和处理的方法和组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求2013年3月15日提交的标题为"Analysis of Particles in Urine Sampled对尿液样品中的粒子的分析）"的美国专利申请No. 61/799, 014的权益，特 此以引用的方式将该专利申请全文并入。
技术领域
[0003] 本发明总体涉及粒子造影剂并且更具体而言涉及供在全自动或半自动设备中使 用以对流体样品如尿液样品中的粒子进行区分和定量的粒子造影剂组合物。
【背景技术】
[0004] 尿沉渣分析是用于提供患者健康状况概况的最常进行的诊断测试中的一种。尿液 样品可从患者身体获得并保存在试管中供后期处理和分析。尿液样品中某些特征性沉渣 (也称为有形成分（formed element))的出现可能是有临床意义的和/或可指示受试者的 病理状况。
[0005] -般而言，异常的尿液可能含有多种有形成分，例如血细胞、上皮细胞、晶体、管型 或微生物。例如，尿液样品可含有血液源性的细胞。红细胞或红血细胞（RBC)可因为泌尿生 殖系统中从肾小球到尿道的任何位点处的出血（血尿）而存在于尿液中。白细胞或WBC、嗜 中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的存在可能具有临床意义。闪光细胞是比重为1. 010或更低的 低渗尿中见到的一类嗜中性粒细胞。淋巴细胞的存在已被用作移植后肾排异的早期指标。 嗜酸性粒细胞与药物诱导的间质性肾炎相关，可能存在源自肾脏或下尿路的黏液丝。
[0006] 尿液样品还可含有上皮起源的细胞。因为正常的剥落，健康个人的尿液中可能会 存在也称为肾小管细胞的一些肾上皮细胞。然而，过多肾小管细胞的存在是活动期肾脏疾 病或肾小管损伤的表征。在尿液中存在的各种类型的上皮细胞（肾细胞、移行细胞或尿路 上皮细胞和鳞状细胞）中，肾上皮细胞是最有临床意义的。它们与急性肾小管坏死、病毒感 染（如巨细胞病毒）和肾移植排异相关。它们的存在也随发烧、化学毒素、药物（尤其是阿 司匹林）、重金属、炎症、感染和肿瘤而增加。此外，包涵体的存在可见于病毒感染中，例如风 疹和疱疹，尤其是巨细胞病毒的感染。
[0007] 尿液还可含有移行上皮细胞或尿路上皮细胞。移行上皮细胞是多层上皮细胞，其 沿尿道从肾盂到男性尿道的远端以及到女性膀胱（膀胱三角区）的基部排列。可能难以将 它们与肾上皮细胞相区分，但它们通常较大且更近球形。一些移行细胞存在于健康个人的 尿液中。增加的数目与感染相关。这些细胞的大的团块或片可见于移行细胞癌症。
[0008] 尿液还可含有鳞状上皮细胞。鳞状上皮细胞沿女性的尿道和男性尿道的远端排 列。女性中大量鳞状细胞的存在通常指示阴道污染。
[0009] 尿液还可含有线索细胞。线索细胞是另一类阴道起源的鳞状细胞，可看到污染尿 沉渣。该鳞状上皮细胞覆盖或包覆有一种细菌即阴道加德菌（Gardnerella vaginalis)，其 存在是细菌性阴道炎的表征。
[0010] 尿液可还含有卵形脂肪体、肾小管脂肪或肾小管脂肪体。这些团粒是充满脂肪或 脂质小滴的肾上皮细胞（或巨噬细胞）。该脂肪可以是中性脂肪（甘油三酯）或胆固醇。它 们具有相同的临床意义。尿液中卵形脂肪体的存在是疾病异常的表征并且不应该被忽视。 它们通常可见于尿沉渣中的脂肪管型和脂肪小滴，并且与如肾病综合征中所见的大量蛋白 尿相关。
[0011] 尿液还可含有诸如细菌和酵母之类的微生物。通常，尿液是无菌的，或者不含细 菌。然而，某些细菌通常在碱性PH的尿液中见到。相关的沉渣调查结果可能包括WBC(嗜 中性粒细胞）和管型（WBC管型、细胞管型、颗粒管型或细菌管型）的存在。尽管感染最经 常是归咎于肠起源的革兰氏阴性杆菌，但传染性生物体也可能是革兰氏阳性球菌。
[0012] 此外，酵母可能见于尿液中，尤其是由于阴道污染如来自酵母感染的女性患者的 污染。由于尿糖的存在其还与糖尿病相关。酵母是常见的污染物（来自皮肤和环境），在虚 弱和免疫受到抑制或免疫失能的患者中感染是一个问题。
[0013] 传统上，尿液中的沉渣分析已在普通实验室中通过使用显微镜目测来进行。使用 这些方法，首先将尿液样品进行离心分离和富集。在某些情况下将因而获得的沉渣进行染 色，然后加载在显微镜载片上，并使其在显微镜下经受手动测定和计数。
[0014] 样品制备步骤可包括通过离心浓缩尿液沉渣，并且有时候应用显微镜染色以增强 对比，如各沉渣类型如RBC、WBC和上皮细胞之间的对比。在手动计数中，技术人员观察湿法 安装的载玻片，从而在可见细胞的类型间作区分或者利用专业的判断通过它们的外观进行 区分，并对预定区域内所观察到的不同类型的尿沉渣的数目进行手动计数。
[0015] 多种染料已用于对尿液样品中存在的细胞或细胞结构进行染色。例如，赖特氏染 料（Wright'S stain)是已被用于对尿液样品进行染色以在光学显微镜下检查的染料。对 尿液样品进行染色涉及多种溶液和步骤依正确顺序的使用以便确保染色剂得以正确施加 并且细胞结构得以适当保存。在第一个步骤中可将固定剂施加至样品以保存样品免于降解 以及保持细胞结构。然后，在第二个步骤中可将透化剂施加至样品以溶解细胞膜以便让染 色剂进入细胞。在第三个步骤中可将染色剂施加至样品以对适当的结构进行染色。可进一 步冲洗样品以供观察，或者可采取额外步骤以应用额外的染色、复染色，或者说进行其他操 作。
[0016] 以适当的顺序进行所述步骤并持续适当的时间量是重要的。如果在样品固化之前 对其进行透化处理，则样品中的细胞结构可能在固化之前被降解，并丧失任何识别最初细 胞形态的能力。另外，染色不能在透化步骤之前进行，否则染色剂将不会恰当地透过细胞并 对细胞内的结构进行染色。另外，如果任何步骤如固定、透化和染色进行得过快，则细胞的 形态可能会丧失和/或细胞及其内部结构可能不会被恰当地染色。而且，可能有必要在其 他步骤之前使用PH调节剂，从而确保在尿液天然pH下不能正常作用的组分的适当功能。当 前的染色技术需要多个步骤和大量的时间。
[0017] 当前的染色技术需要在造影剂中稀释样品，通常约9份造影剂对应1份样品。至 少出于处理一定体积的混合物所耗费的时间考虑，将大体积混合物用于基于图像的分析系 统如流式细胞分析系统可能是不可取的。
[0018] 自动化分析仪正变得越来越普及。用于尿液分析的系统的使用在以下专利中 进行了大致描述：颁给 Villa-Real 的标题为"Compact Sanitary Urinalysis Unit" 的 美国专利 No. 4, 473, 530 ;均颁给 McDonald 的标题为 "Urine Collection and Analysis Device" 的美国专利 No. 3, 894, 845 和标题为"Microorganism Analysis Device" 的 美国专利 No. 3, 988, 209 ;颁给 Schluter 的标题为 "Device for Urinalysis" 的美国 专利 No. 4, 973, 450 ;颁给 Mansour 等人的标题为 "Detection and Quantitation of Microorganisms, Leukocytes and Squamous Epithelial Cells in Urine" 的美国专利 No. 4, 622, 298;以及颁给 Parker 的标题为 "Method and Apparatus for Preparation of Liquids for Examination" 的美国专利 No. 5, 132, 232。颁给 Deindoerfer 等人的标题 为"Method of Analyzing Particles in a Fluid Sample" 的美国专利 No. 4, 612, 614 报 道了通过使样品散布在延展的区域例如显微镜载波片或流动池中来分析尿沉渣的方法。 Deindoerfer等人报道了样品的多幅光学静态图像的用途，该图像被转换成电子图像，该电 子图像显示在根据可通过视觉区分的特征的类别排列的阵列中。然而，许多这些早期开发 的尿液分析系统通常缺少通量、精确性和/或在所有靶标/受试者中适用以达成所有预期 目的所需的普适性。
[0019] 为了使尿沉渣测定自动化，可使用自动化流式显微镜（flow microscope)(如流动 型自动显微镜一iq?:2〇〇, Iris Diagnostics公司）。使用这些类型的设备，将尿液样品引 至扁平型流动池而不需要预先浓缩，在样品流过该流动池的同时获取图像并保存。然而，尿 沉渣在其形态方面具有多样化同时许多沉渣受损，并因而，难以实现对所获取的图像进行 具备良好精确度的测定。特别是难以在没有外部使用者验证的情况下以良好的精确度测定 小尺寸的沉渣，例如红细胞（尤其是非均一红细胞）、细菌和晶体。
[0020] 上述各种自动化系统依赖于对样品的快速分析。染色过程的步骤的数量和持续时 间可以是自动化粒子分析系统的速度和效率方面的限制因素。如果缩短染色过程则自动化 粒子分析系统可以更有效率，并且如果染色过程可一步完成则该系统甚至更有效率。另外， 如果样品的总尺寸保持最小化则自动化粒子分析系统可以更有效率。
【发明内容】
[0021] 本发明公开了用于对泌尿流体样品的粒子进行染色以供在自动化粒子分析系统 中成像的粒子造影剂组合物。该粒子造影剂组合物可包括结晶紫，其量在染色条件下足以 形成50 μ M至500 μ M的浓度。粒子造影剂组合物还可包括选自5PD Lytic和皂苷的透化 剂。
[0022] 在一个实施例中，透化剂可以是5PD Lytic，其量在染色条件下足以形成约3. 5重 量％的浓度。在一个实施例中，结晶紫可以以足以在染色条件下导致约86 μΜ的浓度的量 存在。在一个实施例中，粒子造影剂组合物可还包括磷酸盐缓冲盐水，该磷酸盐缓冲盐水至 少包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。
[0023] 在一个实施例中，粒子造影剂组合物可包括抗微生物剂。在一些实施例中，抗微 生物剂可以是Proclin 300,并且粒子造影剂组合物还可包括80%纯度或更高纯度的结晶 紫，该结晶紫以足以在染色条件下导致约86 μΜ的浓度的量存在。在一些实施例中，粒子造 影剂组合物还可包括氯化钠和磷酸盐缓冲盐水，该磷酸盐缓冲盐水至少包括磷酸氢二钠和 磷酸二氢钾。
[0024] 本发明公开了处理泌尿流体样品的粒子以供在自动化粒子分析系统中成像的方 法。该方法可包括将粒子造影剂组合物和泌尿流体样品合并成样品混合物，从而导致粒子 造影剂组合物以样品混合物重量计的最终浓度在约1%至约20%之间。该方法可还包括将 样品混合物在高于20摄氏度的温度下温育少于90秒。在一些实施例中，粒子造影剂组合 物包括结晶紫和5PD-Lytic，结晶紫以足以在染色条件下导致50 μΜ至500 μΜ之间的浓度 的量存在。
[0025] 在一些实施例中，5H)-LytiC可以以足以在染色条件下导致约3. 5重量％的浓度 的量存在。结晶紫可以以足以在染色条件下导致约86 μΜ的浓度的量存在。粒子造影剂组 合物以样品混合物的重量计的最终浓度可以在约10%至约20%之间。可将该样品混合物 在30°C至50°C之间温育少于60秒。
[0026] 在一些实施例中，粒子造影剂组合物以样品混合物的重量计的最终浓度为约 15%，并且将样品混合物在30°C至50°C之间温育少于60秒。
[0027] 在一些实施例中，将样品混合物在40°C至50°C之间温育30至35秒。结晶紫可以 是大约80%的纯度或更高纯度。在一些实施例中，粒子造影剂组合物还包括Proclin 300。
[0028] 在一些实施例中，粒子造影剂组合物还包括添加氯化钠和磷酸盐缓冲盐水，该磷 酸盐缓冲盐水至少包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。
[0029] 当结合附图来考虑时通过参考下文的【具体实施方式】，本发明实施例的上述特征和 许多其他特征以及伴随的优点将会变得显而易