专利名称：羽衣甘蓝DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及植物基因片段、RNAi载体、RNAi载体的构建方法，以及RNAi载体在植物育种中的应用。
背景技术：
羽衣甘蓝为二年生草本植物，是食用甘蓝(卷心菜、包菜)的园艺变种，其叶色丰富多变，叶形也不尽相同，整个植株形如牡丹，因此又被形象地称为“叶牡丹”，是盆栽观叶的佳品。株型是植物重要的农艺性状。微型化作为观赏植物株型的重要方面，已显示出良 好的市场前景。例如，现代月季中的一个特殊品种——微型月季，因其株型矮小紧凑，叶片、花朵小巧可爱，不占空间，摆放位置选择性更大等优点，深受人们喜爱，目前已成为国际花卉市场上最受欢迎的盆栽花卉之一。因此，培育株型微型化的羽衣甘蓝品种，预计在未来的市场中也可以取得不错的成绩。虽然传统育种在以往改良植物性状的过程中做出了巨大的贡献，但传统育种费时费力。近年来，随着基因工程的迅速发展和转基因技术的日益完善，基因工程育种已成为植物育种领域的一个重要分支。文献报道，番茄品种Micro-Tom的株型微型化，整个植株与普通番茄品种相比整体等比例缩小，其株型表现主要由两个隐性突变基因和
决定，其中基因编码油菜素内酯(调控植物生长发育的重要激素)合成途径中的关键酶BR-6-氧化酶，SELF-PRUNING基因主要控制茎顶端分生组织的发育潜力，与花序转化有关。文献还报道，赤霉素也是对植物茎杆伸长起重要调控作用的激素，而GA20ox是其合成途径的关键酶。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于克隆羽衣甘蓝和三基因片段，目的之二在于提供一种羽衣甘蓝洲和GA20ox三基因RNAi载体，目的之三在于提供所述羽衣甘蓝和三基因RNAi载体的构建方法，目的之四在于提供含有所述羽衣甘蓝洲和三基因RNAi载体的微生物转化体，目的之五在于提供所述羽衣甘蓝和三基因RNAi载体在羽衣甘蓝植株育种中的应用，目的之六在于提供利用所述羽衣甘蓝5P和GA20ox三基因RNAi载体进行羽衣甘蓝植株育种的方法。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案1.羽衣甘蓝基因片段，核苷酸序列如SEQ ID No.1中第I位至第936位所示。2.羽衣甘蓝5Ρ基因片段，核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。3.羽衣甘蓝GA20ox基因片段，核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。4.羽衣甘蓝洲SP和GA20ox三基因RNAi载体，其含有一个hpRNA表达盒，所述hpRNA表达盒包括顺序连接的启动子、洲三基因拼接片段的正向片段、DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段的反向片段和终止子.^DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段包括基因片段或其互补片段、5P基因片段或其互补片段、以及基因片段或其互补片段，所述例從F基因片段的核苷酸序列 如SEQ ID No.1中第I位至第936位所示，5P基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，GA20ox基因片段的核苷酸序列如SEQID No. 3 所示。进一步，所述hpRNA表达盒包括顺序连接的CaMV35S启动子、DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段的正向片段、PDK内含子、洲三基因拼接片段的反向片段和Ocs终止子DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段包括顺序连接的洲基因片段的正向片段、5P基因片段的正向片段、以及基因片段的反向互补片段。进一步，所述羽衣甘蓝洲SP和GA20OX三基因RNAi载体是以pBIN19载体为骨架，所述hpRNA表达盒插入pBIN19载体的多克隆位点中，DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。5.羽衣甘蓝GA20ox三基因RNAi载体的构建方法，包括以下步骤
a.羽衣甘蓝和三基因片段的克隆以羽衣甘蓝幼叶总RNA为模板，反转录得到cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以BoDF-F和BoDF-R、BoSP-F和BoSP-R、BoGA20ox-F和BoGA20ox-R为引物，PCR扩增核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因片段、核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的5P基因片段和核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示的GA20ox基因片段；所述引物BoDF-F和BoDF-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 5和SEQID No. 6所示，BoSP-F和BoSP-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示，BoGA20ox-F和BoGA20ox-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10所示；然后，将PCR扩增所得的基因片段和5P基因片段分别与pMD18-T载体连接，获得重组质粒DWARF: :pMD18-T 和 SP: :pMD18_T，另将 PCR 扩增所得的 GA20ox 基因片段与 pGEM_T Easy 载体连接，获得重组质粒GA20ox: :pGEM-T Easy ；
b.羽衣甘蓝洲5P和GA20ox三基因片段的拼接将重组质粒DWARF::pMD18_T用通ol和feoRI双酶切，回收纯化重组质粒DWARF: :pMD18_T线性片段，另将重组质粒SP: :pMD18-T用Sal\和&0RI双酶切，回收纯化5P基因片段，再将纯化的重组质粒DWARF: :pMD18-T线性片段与5P基因片段连接，获得重组质粒SP/DF: :pMD18_T ;然后，将重组质粒SP/DF: : ]\ 18-1'用油<31和&oRI双酶切，回收纯化重组质粒SP/DF: :pMD18_T线性片段，另将重组质粒GA20ox: :pGEM-T Easy用5^1和&oRI双酶切，回收纯化GA20ox基因片段，再将纯化的重组质粒SP/DF: :pMD18-T线性片段与GA20ox基因片段连接，获得重组质粒 SP/DF/GA20ox::pMD18_T ；
c.羽衣甘蓝Λ^υ/^和三基因RNAi载体的构建以重组质粒SP/DF/GA20ox::pMD 18-T为模板，以DWARF (F+EX)和GA20ox (F+KB)为引物，PCR扩增两侧带酶切位点的洲三基因拼接片段；所述引物DWARF (F+EX)和GA20ox (F+KB)的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示；将纯化的PCR产物用油al和双酶切，回收纯化训三基因拼接片段，再与经同样双酶切的pHANNIBAL载体连接，获得重组质粒SP/DF/GA20ox: :pHANNIBAL ;另将纯化的PCR产物用Kpnl和&oRI双酶切，回收纯化洲三基因拼接片段，再与经同样双酶切的重组质粒SP/DF/GA20ox::pHANNIBAL连接，获得含有hpRNA表达盒的重组质粒(SP/DF/GA20ox)1: :pHANNIBAL ;然后，将重组质粒(SP/DF/GA20ox)1: :pHANNIBAL用5^1和5^1双酶切，回收纯化hpRNA表达盒，另将植物表达载体PBIN19用油al和feci双酶切，回收纯化载体pBIN19线性片段，再将纯化的载体PBIN19线性片段与hpRNA表达盒连接，获得重组质粒(SP/DF/GA20ox)1::PBIN19,即羽衣甘蓝GA20ox三基因RNAi载体。6.含有羽衣甘蓝DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi载体的微生物转化体。进一步，所述微生物为农杆菌。7.羽衣甘蓝GA20ox三基因RNAi载体在微型化羽衣甘蓝植株育种中的应用。8.利用羽衣甘蓝Λ^υ/^和 GA20ox三基因RNAi载体获得微型化羽衣甘蓝植株的方法，包括以下步骤
a.羽衣甘蓝外植体的制备将羽衣甘蓝种子消毒后，播种于含有质量分数为3%的蔗糖和质量分数为O. 8%的琼脂、pH为5. 8的1/2MS固体培养基上，在25±2°C、光周期16h/d、光照强度1000-20001χ条件下培养；将生长7-10天的帯柄子叶切下，接入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为O. 8%的琼脂、lmg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和lmg/L 2，4_D、pH为5. 8的MS固体培养基中，在25±2°C黑暗条件下预培养48小时，制得羽衣甘蓝外植体；
b.农杆菌工程菌液的制备将含有羽衣甘蓝洲5P和GA20ox三基因RNAi载体的农杆菌工程菌株接种于含有质量分数为1. 2%的琼脂、50mg/L利福平(Rif)、500mg/L链霉素(Str)和50mg/L卡那霉素(Kan)、pH为7. 2的YEB固体培养基上，28±2°C黑暗条件下活化2-3天至长出单菌落，挑取单菌落,用含有50mg/L Rif、500mg/L Str和50mg/L Kan、pH为
7.2的YEB液体培养基20mL，在28±2°C、200rpm条件下扩大培养1. 5天，再将所得菌液按体积比为 1:100 接入含有 50mg/L Rif、500mg/L Str 和 50mg/L Kan、pH 为 7· 2 的 YEB 液体培养基中，在28±2°C、200rpm条件下扩大培养至OD6tltl=L 8-2. 0，然后28 ±2°C离心弃上清，菌体用新鲜的YEB液体培养基洗涤，再用含有质量分数为3%的蔗糖、pH为5. 8的MS盐溶液IOOmL重悬，制得农杆菌工程菌液；
c.农杆菌的侵染转化将步骤a制得的羽衣甘蓝外植体置步骤b制得的农杆菌工程菌液中浸染15分钟后，接入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为O. 8%的琼脂、lmg/L 6-BA和lmg/L 2，4-D、pH为5. 8的MS固体培养基中，25±2°C黑暗条件下共培养48小时，再转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为O. 8%的琼脂、4mg/L 6_BA、2mg/L玉米素(ZT)、5mg/L硝酸银、500mg/L羧苄青霉素(Carb)和20mg/L Kan、pH为5· 8的MS固体培养基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照强度1000-20001x条件下培养至长出绿色愈伤组织及抗性芽；将长2-3cm的抗性芽切下，转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为O. 8%的琼脂、
O.2mg/L 萘乙酸(NAA)、250mg/L Carb 和 5mg/L Kan、pH 为 5· 8 的 1/2MS 固体培养基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照强度1000-20001x条件下培养至生根，即得转基因羽衣甘蓝植株;
d.转基因阳性植株的获得通过PCR检测羽衣甘蓝洲和三基因RNAi载体中含有的报告基因在转基因羽衣甘蓝植株中的表达，以及qPCR检测和GA20ox三基因在转基因羽衣甘蓝植株中的表达，从步骤c获得的转基因羽衣甘蓝植株中筛选出转基因阳性植株，即获得微型化羽衣甘蓝植株。
进一步，所述步骤a中羽衣甘蓝品种为京莲红I号。进一步，所述羽衣甘蓝洲SP和GA20ox三基因RNAi载体中含有NPTII报告基因，所述步骤d通过PCR检测NPTII报告基因在转基因羽衣甘蓝植株中的表达以及qPCR检测Λ / 八5Ρ和GA20ox三基因在转基因羽衣甘蓝植株中的表达来筛选转基因阳性植株；所述PCR检测方法是分别取步骤c获得的转基因羽衣甘蓝植株和非转基因羽衣甘蓝植株，提取基因组DNA，再以所得基因组DNA为模板、NPTI1-F和NPTI1-R为引物进行PCR，所述引物NPTI1-F和NPTI1-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示；所述qPCR检测方法是分别取步骤c获得的转基因羽衣甘蓝植株和非转基因羽衣甘蓝植株，提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以特异性引物qBoDWARF_F和qBoDWARF-R、qBoSP-F 和 qBoSP-R、qBoGA20ox_F 和 qBoGA20ox_R、内参引物 qBoactin-F 和qBoactin-R进行qPCR，所述引物qBoDWARF_F和qB oDWARF-R的核苷酸序列分别如SEQ IDNo. 15和SEQ ID No. 16所示，qBoSP-F和qBoSP-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 17和SEQ ID No. 18 所示，qBoGA20ox_F 和 qBoGA20ox_R 的核苷酸序列分别如 SEQ ID No. 19 和SEQ ID No. 20 所示，qBoactin-F 和 qBoactin-R 的核苷酸序列分别如 SEQ ID No. 21 和 SEQID No. 22 所示。本发明中所述1/2MS培养基为除蔗糖外其他组分浓度减少至原浓度1/2的MS培养基；所述MS盐溶液为不含有机物成分的MS液体培养基。本发明的有益效果在于
(I)本发明首次通过基因工程技术开发出株型微型化的植物新品种，通过植物基因转化，目的明确、高效并可稳定遗传地改变了植物株型，避免了费时费力、通过喷施相应植物激素、改变植株耕作时间及扦插方式来获得不可稳定遗传的矮化植物株型的传统育种方法，为观赏植物的品种改良作出了积极的探索。(2)本发明利用物种进化同源性，克隆得到羽衣甘蓝例和三基因片段，基于上述三基因片段构建了羽衣甘蓝洲5P和GA20ox三基因共沉默的RNAi载体，并将该RNAi载体转入羽衣甘蓝，获得了转基因阳性植株。分析结果显示，转基因阳性植株中和GA20ox三基因的表达均较非转基因植株显著降低，其株系为微型化表型，从而通过例和三基因共沉默获得了微型化羽衣甘蓝新品种。本发明提供的羽衣甘蓝和GA20ox三基因片段，羽衣甘蓝训⑷^、#和GA20ox三基因RNAi载体及其构建方法，羽衣甘蓝的遗传转化方法，利用羽衣甘蓝洲SP和GA20ox三基因RNAi载体获得微型化羽衣甘蓝植株的方法都具有良好的市场前景和经济价值，同时为其他植物的微型化育种提供了参考和借鉴。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。图1为本发明流程示意图。图2为羽衣甘蓝八5P 二基因扩增片段的琼脂糖凝胶电泳分析图，其中M为DNA分子量标准(Maker)，I为基因扩增片段，2为SP基因扩增片段。图3为羽衣甘蓝基因扩增片段的琼脂糖凝胶电泳分析图，其中M为Maker，I和2为GA20OX基因扩增片段。图4为重组质粒DWARF: :pMD18_T构建示意图。图5为重组质粒SP: :pMD18-T构建示意图。图6为重组质粒GA20ox: :pGEM_T Easy构建示意图。图1为重组质粒SP/DF: :pMD18-T构建示意图。图8为重组质粒SP/DF/GA20ox: :pMD18_T构建示意图。图9为重组质粒SP/DF/GA20ox: :pHANNIBAL构建示意图。图10 为重组质粒(SP/DF/GA20ox)1: : pHANNIBAL 构建示意图。 图11为重组质粒(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19构建示意图。图12为&oRI和油al双酶切重组质粒(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19的琼脂糖凝胶电泳分析图，其中对照为重组质粒(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19，l和2为酶切产物，M为Maker。图13为共培养后的羽衣甘蓝外植体在抗性筛选诱导生芽培养基中长出绿色愈伤组织。图14为抗性芽的分化。图15为转基因羽衣甘蓝植株。图16为PCR检测NPTII报告基因在转基因羽衣甘蓝植株中的表达，其中M为Maker, NT为无模板空白对照，CK-为阴性对照，CK+为阳性对照，1-6为转基因羽衣甘蓝植株。图17为DWARF、SP和GA20ox三基因在转基因羽衣甘蓝阳性植株中的沉默效果鉴定，其中I和2为转基因羽衣甘蓝阳性植株，WT为非转基因羽衣甘蓝植株。图18为转基因羽衣甘蓝阳性植株的表型，其中Tl为转基因羽衣甘蓝阳性植株，WT为非转基因羽衣甘蓝植株。图19为转基因羽衣甘蓝阳性植株的生长过程表型，其中I和2为转基因羽衣甘蓝阳性植株，WT为非转基因羽衣甘蓝植株。
具体实施例方式以下将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。优选实施例中使用的羽衣甘蓝品种为京莲红I号。pMD18-T载体为TaKaRa公司产品，pGEM-T Easy载体为Promega公司产品，pHANNIBAL载体、pBIN19载体、大肠杆菌DH5a、含有游动质粒Prk2013的大肠杆菌“协助”菌(helper)、根癌农杆菌LBA4404由本实验室保存。RNA提取试剂盒、RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O试剂盒、DNA提取试剂盒UniversalGenomic DNA Extraction Kit Ver. 3.0、连接试剂盒 DNA Ligation Kit Ver. 2. 0 (T4 DNA连接酶/Solution〗)、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、PrimeSTARHS DNA聚合酶为大连TaKaRa公司产品。超薄/普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)为TIANGEN公司产品。其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。本发明的流程示意图如图1所示。
一、羽衣甘蓝洲辦八^^和GA20ox三基因片段的克隆
根据番爺例级/ /7基因序列(GenBank登录号U54770),在TIGR数据库(http://compbio.dfc1.harvard.edu/cg1-bin/tgi/Blast/index.cgi)中 BLAST 得到拟南芥和油菜(羽衣甘蓝)数据库中最同源的基因序列，在这两个物种的保守区域设计特异性引物BoDF-F和BoDF-R ;根据番茄5P基因序列(GenBank登录号U84140)，在TIGR数据库中BLAST得到拟南芥和油菜(羽衣甘蓝)数据库中最同源的基因序列，在这两个物种的保守区域设计特异性引物BoSP-F和BoSP-R ;根据拟南芥GA20ox基因序列(GenBank登录号X83379)，在TIGR数据库中BLAST得到油菜(羽衣甘蓝)数据库中最同源的基因序列，在这两个物种的保守区域设计特异性引物BoGA20ox_F和BoGA20ox_R ;引物序列如下
BoDF-F :5’-ATCGCTGCGGTTCACGG-3’ (SEQ ID No. 5)；
BoDF-R :5’-CTCCCATTTGTATCTCGTA-3’ (SEQ ID No. 6)； BoSP-F :5’-CCCAAAGCAGAACTAAAGC-3’ (SEQ ID No. 7)；
BoSP-R :5’-TGATCTCATGTCACCCC-3’ (SEQ ID No. 8)；
BoGA20ox-F :5’-GGTCAATCACGGCATCAG-3’ (SEQ ID No. 9)；
BoGA20ox-R :5’-TCGGTGGCGTCACTACTC-3’ (SEQ ID No. 10)。以羽衣甘蓝(京莲红I号)幼叶总RNA为模板，根据RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O试剂盒说明书，以oligodT引物反转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以BoDF-F和BoDF-R,BoSP-F 和 BoSP-R、BoGA20ox_F 和 BoGA20ox_R 为引物，PCR 扩增羽衣甘蓝
和三基因片段。PCR 反应体系为ddH20 16. 5μ LUOXPCR Buffer 2· 5 μ L、MgCl2
2· 5 μ L、dNTP (10 μ Μ)1. O μ L、上下游引物各 O. 5 μ L、cDNA 模板1. O μ L、Taq DNA 聚合酶
O.5 μ L，共25 μ L。PCR反应程序为94°C预变性5分钟；然后94°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸I分钟(以BoSP-F和BoSP-R为引物时为72°C延伸30秒，以BoGA20ox_F和BoGA20ox-R为引物时为72°C延伸50秒)，共35个循环；最后72°C终延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定(图2-3)后，采用超薄/普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化。将纯化的羽衣甘蓝基因片段和5P基因片段分别与pMD18-T载体连接，获得重组质粒DWARF: :pMD18-T和SP: :pMD18_T(图4_5);将纯化的羽衣甘蓝GA20ox基因片段与pGEM-T Easy载体连接，获得重组质粒GA20ox: :pGEM-T Easy (图6)。将上述三种重组质粒委托英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，结果显示，分别获得974bp的羽衣甘蓝洲基因片段(SEQ ID No. l)、336bp的羽衣甘蓝5P基因片段(SEQ IDNo. 2)和710bp的羽衣甘蓝GA20ox基因片段(SEQ ID No. 3)。二、羽衣甘蓝洲辦八^^和GA20ox三基因片段的拼接
将重组质粒DWARF: :pMD18-T用沿ol和&oRI双酶切，回收纯化重组质粒DWARF::PMD18-T线性片段；另将重组质粒SP: :pMD18-T用Sal\和&oRI双酶切，回收纯化5P基因片段；再将纯化的重组质粒DWARF: :pMD18-T线性片段与5P基因片段在T4 DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒SP/DF: :pMD18-T(图7)。然后，将重组质粒SP/DF: :pMD18_T用油al和&oRI双酶切，回收纯化重组质粒SP/DF: :pMD18-T线性片段；另将重组质粒GA20ox::pGEM-T Easy用分el和&0RI双酶切，回收纯化GA20ox基因片段；再将纯化的重组质粒SP/DF: :pMD18-T线性片段与GA20ox基因片段在T4 DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒SP/DF/GA20ox: :pMD18-T(图 8)。将重组质粒 SP/DF/GA20ox: :pMD18_T 委托英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，结果显示，获得1997bp的洲三基因拼接片段(SEQID No. 4)，其中包括顺序连接的936bp的羽衣甘蓝基因片段(SEQ ID No.1中第I位至第936位核苷酸)的正向片段、336bp的羽衣甘蓝5Ρ基因片段(SEQ ID No. 2)的正向片段、以及710bp的羽衣甘蓝基因片段(SEQ ID No. 3)的反向互补片段。上述步骤中，酶切体系为ddH20 23 yL、重组质粒20yL、限制性内切酶各lyL、IOXBuffer 5 μ L，共50 μ L ;连接体系为T4 DNA连接酶(Solution〗)5 μ L、目标基因片段
4.5 μ L、重组质粒线性片段0.5 μ L，共10 μ L。三、羽衣甘蓝DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi载体的构建
根据pHANNIBAL载体的多克隆位点和所得洲三基因拼接片段序列，设 计如下引物
DWARF (F+EX) :5’ -CCGGAATTCTCTAGAATCGCTGCGGTTCACGG-3’ (SEQ ID No. 11)，下划线部分为油al酶切位点，黑体部分为feoRI酶切位点；
GA20OX (F+KB) :5’-CGGGGTACCGGATCCGGTCAATCACGGCATCAG-3’ (SEQ ID No. 12)，下划线部分为Bamm酶切位点，黑体部分为Kpnl酶切位点。以重组质粒 SP/DF/GA20ox: : pMD18_T 为模板，以 DWARF (F+EX)和 GA20ox (F+KB)为引物，PCR扩增两侧带酶切位点的麗三基因拼接片段。PCR体系为ddH2016 μ LUO XPrimeSTARBuffer (含 MgCl2) 2. 5 μ L、dNTP (2. 5 μ M) 4.0yL、上下游引物各
O.5 μ L、质粒模板1. O μ L、PrimeSTARHS DNA 聚合酶 O. 5 μ L，共 25 μ L。PCR 循环参数为98°C变性10秒，56°C退火15秒，72°C延伸2分钟，共40个循环；最后72°C终延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用超薄/普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化。将纯化的PCR产物用Xba I和Bamm双酶切，回收纯化DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段，再与经同样双酶切的pHANNIBAL载体在T4 DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒SP/DF/GA20ox: : pHANNIBAL (图9)。另将纯化的PCR产物用Kpn I和&oRI双酶切，回收纯化洲三基因拼接片段，再与经同样双酶切的重组质粒SP/DF/GA20ox: : pHANNIBAL在T4 DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒(SP/DF/GA20ox)i pHANNIBAL (图10)，即将DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段分别正向和反向插入pHANNIBAL载体中TOK内含子的两侧，以形成hpRNA表达盒“35S pro-fDWARF/SP/GA20ox-pdk-rDWARF/SP/ GA20ox-0cs ter”。然后，将重组质粒(SP/DF/GA20ox)1: :pHANNIBAL用5^1和5^1双酶切，回收纯化上述hpRNA表达盒，另将植物表达载体PBIN19用油a I和feci双酶切，回收纯化载体PBIN19线性片段，再将纯化的载体PBIN19线性片段与hpRNA表达盒在T4 DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19 (图11)，即羽衣甘蓝洲^^产和GA20ox三基因RNAi载体。将重组质粒(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，蓝白斑及Kan筛选阳性克隆，用载体引物进行单菌落PCR检测，阳性菌落扩大培养后提取重组质粒，用载体引物进行PCR检测，并用^0RI和油al进行双酶切检测。酶切结果显示，重组质粒(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19 酶切后出现 12491bp、4821bp 和 1383bp 共 3 条电泳条带，与理论结果相符合(图12)。四、羽衣甘蓝DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi载体转化农杆菌将根癌农杆菌LBA4404在含有1. 2%(w/w)琼脂、50mg/L Rif和500mg/L Str的YEB固体培养基上划线，28 ±2 °C黑暗条件下培养2-2. 5天至长出单菌落；分别将含有重组质粒(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19的大肠杆菌DH5 α和含有游动质粒Prk2013的大肠杆菌helper在含有50mg/L Kan的LB固体培养基上划线，37±2°C条件下倒置培养14-16小时至长出单菌落；将根癌农杆菌LBA4404单菌落、大肠杆菌helper单菌落和含有重组质粒(SP/DF/GA20ox)i PBIN19的大肠杆菌DH5 α单菌落依次重叠均匀涂在含有1. 2%(w/w)琼脂的YEB固体培养基(PH7. 2)中央直径为Icm的圆圈中，28±2°C黑暗条件下倒置共培养24小时至长出菌团，用接种环挑取菌团适量，在含有1.2%(W/W)琼脂、50mg/L Rif、500mg/L Str和50mg/LKan的YEB固体培养基(pH7. 2)中划线，28 ±2°C黑暗条件下倒置培养2-2. 5天至长出单菌落，挑取3-4个单菌落，用含有50mg/L Rif、500mg/L Str和50mg/L Kan的YEB液体培养基(pH7. 2)，在28±2°C、黑暗、200rpm条件下摇床培养1. 5天至菌液均匀且OD6tltl=L 8-2. 0，提取重组质粒，用&oRI和油a I进行双酶切鉴定，阳性重组子即为(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19农杆菌工程菌株，_80°C冻存备用。
五、农杆菌介导的DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi载体转化羽衣甘蓝
将羽衣甘蓝(京莲红I号)种子用70%(v/v)乙醇溶液浸泡I分钟，无菌水冲洗3次，再用1% (v/v)次氯酸钠溶液反复冲洗12-15分钟，无菌水冲洗8次，播种于含有3%(w/w)蔗糖和O. 8%(w/w)琼脂的1/2MS固体培养基(pH5. 8)上，在25±2°C、光周期16h/d、光照强度1000-20001x条件下培养；将生长7-10天完全展开(未长出真叶)的帯柄子叶切下，接入预培养培养基(含有3%(w/w)蔗糖、0.8%(w/w)琼脂、lmg/L 6-BA和lmg/L 2，4-D的MS固体培养基，pH5. 8)中，在25±2°C黑暗条件下预培养48小时，制得羽衣甘蓝外植体。将(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19农杆菌工程菌株接种于含有1. 2%(w/w)琼脂、50mg/L Rif、500mg/L Str和50mg/L Kan的YEB固体培养基(ρΗ7· 2)上，28±2°C黑暗条件下活化2-3天至长出单菌落，挑取单菌落,用含有50mg/L Rif >500mg/L Str和50mg/L Kan的YEB液体培养基(PH7. 2) 20mL，在28±2°C、200rpm条件下扩大培养1. 5天，再取培养菌液lmL，加入含有 50mg/L Rif、500mg/L Str 和 50mg/L Kan 的 YEB 液体培养基(ρΗ7· 2) lOOmL，在28±2°C、200rpm 条件下扩大培养 8-10 小时至 OD6tltl=L 8-2. 0，28°C、4000rpm 离心 10 分钟，弃上清，菌体用新鲜的YEB液体培养基(pH7. 2)洗涤，再用含有3%(w/w)蔗糖的MS盐溶液(pH5. 8) IOOmL 重悬，制得(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19 农杆菌工程菌液。将前述羽衣甘蓝外植体置(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19农杆菌工程菌液中浸染15分钟，无菌吸水纸吸去多余菌液后，接入共培养培养基(含有3%(w/w)蔗糖、0.8%(w/w)琼月旨、lmg/L 6-BA和lmg/L 2，4-D的MS固体培养基，pH5. 8)，25±2°C黑暗条件下共培养48小时，用无菌水清洗后，再转入抗性筛选诱导生芽培养基(含有3%(w/w)蔗糖、O. 8%(w/w)琼脂、4mg/L 6_BA、2mg/L ZT、5mg/L AgNO3>500mg/L Carb 和 20mg/L Kan 的 MS 固体培养基，pH5. 8)中，在25±2°C、光周期16h/d、光照强度1000-20001x条件下培养至长出绿色愈伤组织及抗性芽(图13-14);将同一个生长点长出的长2-3cm的抗性芽切下，转入生根培养基(含有 3%(w/w)鹿糖、O. 8%(w/w)琼脂、O. 2mg/L NAA、250mg/L Carb 和 5mg/L Kan 的 1/2MS固体培养基，pH5. 8)中，在25±2°C、光周期16h/d、光照强度1000_20001x条件下培养至生根，即得转基因羽衣甘蓝植株(图15)。上述农杆菌介导DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi载体转化羽衣甘蓝的方法为优化方法，其具有以下特点①农杆菌的浓度影响菌体在植物细胞上的附着，在一定范围内，菌液浓度越大，附着率越高，转化率越大，但超过该范围，由于菌的毒害作用或生长过快等，会使外植体受到农杆菌过度伤害而导致外植体切口褐化腐烂严重，且不利于共培养后去除农杆菌，而低于该范围，较低的菌液浓度会使T-DNA不能有效地整合进植物细胞基因组中，大大降低转化效率。本发明对农杆菌工程菌液的浓度进行了优化，能够有效保证八AaSd和此三基因RNAi载体的转化率；②激素是影响再生频率的主要因素之一，不同的激素组合及激素水平对诱导不同外植体愈伤和出芽的影响不同，本发明方法中预培养和共培养的激素组合优选为lmg/L 6-BA和lmg/L 2，4_D，分化的激素组合优选为4mg/L 6-BA和2mg/L ZT并加入5mg/L AgN03促分化，生根激素优选为O. 2mg/L NAA 由于羽衣甘蓝对Kan很敏感，Kan浓度过低，选择压不足，易产生非转基因植株，反之则不利于芽分化，本发明方法中抗性筛选诱导生芽培养基中Kan的浓度优选为10-20mg/L ;④采用本发明所述生根培养基进行生根培养,生根率可达10%，阳性植株得率可达3. 6%。六、转基因羽衣甘蓝阳性植株的筛选1.PCR检测NPTII报告基因在转基因羽衣甘蓝植株中的表达 根据载体PBIN19中的NPTII报告基因序列，设计如下特异引物
NPTI1-F :5’-GACAATCGGCTGCTCTGA-3’ (SEQ ID No. 13)；
NPTI1-R :5’-AACTCCAGCATGAGATCC-3’ (SEQ ID No. 14)。分别取前述转基因羽衣甘蓝植株和非转基因羽衣甘蓝植株，提取基因组DNA，再以所得基因组DNA为模板、NPTI1-F和NPTI1-R为引物进行PCR扩增，检测NPTII报告基因在转基因羽衣甘蓝植株中的表达。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果如图16所示，部分转基因羽衣甘蓝植株的PCR产物在875bp位置出现目标DNA条带。将该DNA条带回收纯化后与PMD18-T载体连接，测序证明与NPTII报告基因片段序列一致，证实这些植株为转基因阳性植株。2. qPCR检测和三基因在转基因羽衣甘蓝阳性植株中的表达 根据羽衣甘蓝例和GA20ox三基因片段序列，设计如下特异性qPCR引物及内参
基因 BoActin (GenBank 登录号 AF044573)的 qPCR 引物
qBoDWARF-F :5’-GATGCGAGAACGAAGAGAGTC-3’ (SEQ ID No. 15)；qBoDWARF-R :5’-TGAAGAAGGAAGATAACCGATAC-3’ (SEQ ID No. 16)；qBoSP-F :5’-GACGCCGTTGACTGAAGG-3’ (SEQ ID No. 17)；qBoSP-R :5’-CCAGTCATAAGTATCCCG-3’ (SEQ ID No. 18)；qBoGA20ox-F :5’-TGAACAGCAAGAGCGAGAGG-3’ (SEQ ID No. 19)；qBoGA20ox-R :5’-GTGAACTCAAGCAACATAGACC-3’ (SEQ ID No. 20)；qBoactin-F :5，-GGAACTGGAATGGTGAAGGTG-3，(SEQ ID No. 21)；qBoactin-R :5’-GTCTTTCTGACCCATCCCAAC-3’ (SEQ ID No. 22)。分别取前述转基因羽衣甘蓝阳性植株和非转基因羽衣甘蓝植株的幼叶，提取总RNA,将总RNA反转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以qBoDWARF-F和qBoDWARF-R、qBoSP-F 和 qBoSP-R、qBoGA20ox_F 和 qBoGA20ox-R、qBoactin_F 和 qBoactin-R 为引物进行qPCR，检测和三基因在转基因羽衣甘蓝阳性植株中的表达。结果如图17所示，转基因羽衣甘蓝阳性植株中洲5P和GA20ox三基因的表达都较非转基因羽衣甘蓝植株显著降低，基因沉默效率高。七、转基因羽衣甘蓝阳性植株的表型分析
将上述筛选出的转基因羽衣甘蓝阳性植株和非转基因羽衣甘蓝植株按常规方法培育，观察分析转基因羽衣甘蓝阳性植株的表型特征，结果显示，转基因羽衣甘蓝阳性植株的株系为微型化表型(图18-19)。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
1.羽衣甘蓝ΛΚ^/^基因片段，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No.1中第I位至第936位所示。
2.羽衣甘蓝5P基因片段，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
3.羽衣甘蓝基因片段，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No. 3所示。
4.羽衣甘蓝训⑷ 八5^和GA20ox三基因RNAi载体，其特征在于，含有一个hpRNA表达盒，所述hpRNA表达盒包括顺序连接的启动子、洲三基因拼接片段的正向片毁、DWARF/SP/GA20OX三基因拼接片段的反向片段和终止子 ，所迷DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段包括基因片段或其互补片段、5P基因片段或其互补片段、以及基因片段或其互补片段，所述例從F基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1中第I位至第936位所示，5P基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3 所示。
5.根据权利要求4所述的羽衣甘蓝DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi载体，其特征在于，所述hpRNA表达盒包括顺序连接的CaMV35S B动予、DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段的正向片段、PDK内含子、DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段的反向片段和Ocs终止子；所述DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段包括顺序连接的DWARF基因片段的正向片段、5P基因片段的正向片段、以及GA20OX基因片段的反向互补片段。
6.根据权利要求5所述的羽衣甘蓝洲^^产和三基因RNAi载体，其特征在于，以pBIN19载体为骨架，所述hpRNA表达盒插入pBIN19载体的多克隆位点中，所述SP/GA20ox三基因拼接片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
7.权利要求4至6任一项所述羽衣甘蓝和GA20ox三基因RNAi载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤 a.羽衣甘蓝和三基因片段的克隆以羽衣甘蓝幼叶总RNA为模板，反转录得到cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以BoDF-F和BoDF-R、BoSP-F和BoSP-R、BoGA20ox-F和BoGA20ox-R为引物，PCR扩增核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因片段、核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的5P基因片段和核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示的GA20ox基因片段；所述引物BoDF-F和BoDF-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 5和SEQID No. 6所示，BoSP-F和BoSP-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示，BoGA20ox-F和BoGA20ox-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10所示；然后，将PCR扩增所得的基因片段和5P基因片段分别与pMD18-T载体连接，获得重组质粒DWARF: :pMD18-T 和 SP: :pMD18_T，另将 PCR 扩增所得的 GA20ox 基因片段与 pGEM_T Easy 载体连接，获得重组质粒GA20ox: :pGEM-T Easy ； b.羽衣甘蓝洲5P和GA20ox三基因片段的拼接将重组质粒DWARF::pMD18_T用通ol和feoRI双酶切，回收纯化重组质粒DWARF::pMD18-T线性片段，另将重组质粒SP: :pMD18-T用Sal\和&0RI双酶切，回收纯化5P基因片段，再将纯化的重组质粒DWARF: :pMD18-T线性片段与5P基因片段连接，获得重组质粒SP/DF: :pMD18_T ;然后，将重组质粒SP/DF: : ]\ 18-1'用油<31和&oRI双酶切，回收纯化重组质粒SP/DF: :pMD18_T线性片段，另将重组质粒GA20ox: :pGEM-T Easy用5^1和&oRI双酶切，回收纯化GA20ox基因片段，再将纯化的重组质粒SP/DF: :pMD18-T线性片段与GA20ox基因片段连接，获得重组质粒 SP/DF/GA20ox::pMD18_T ；C.羽衣甘蓝三基因RNAi载体的构建以重组质粒SP/DF/GA20OX::pMD 18-T为模板，以DWARF (F+EX)和GA20ox (F+KB)为引物，PCR扩增两侧带酶切位点的洲三基因拼接片段；所述引物DWARF (F+EX)和GA20ox (F+KB)的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示；将纯化的PCR产物用油al和双酶切，回收纯化训三基因拼接片段，再与经同样双酶切的pHANNIBAL载体连接，获得重组质粒SP/DF/GA20ox: :pHANNIBAL ;另将纯化的PCR产物用Kpnl和&oRI双酶切，回收纯化洲三基因拼接片段，再与经同样双酶切的重组质粒SP/DF/GA20ox::pHANNIBAL连接，获得含有hpRNA表达盒的重组质粒(SP/DF/GA20ox)1: :pHANNIBAL ;然后，将重组质粒(SP/DF/GA20ox)1: :pHANNIBAL用5^1和5^1双酶切，回收纯化hpRNA表达盒，另将植物表达载体PBIN19用油al和feci双酶切，回收纯化载体pBIN19线性片段，再将纯化的载体PBIN19线性片段与hpRNA表达盒连接，获得重组质粒(SP/DF/GA20ox)1::PBIN19,即羽衣甘蓝GA20ox三基因RNAi载体。
8.含有权利要求4至6任一项所述羽衣甘蓝洲和GA20ox三基因RNAi载体的微生物转化体。
9.权利要求4至6任一项所述羽衣甘蓝洲和GA20ox三基因RNAi载体在微型化羽衣甘蓝植株育种中的应用。
10.利用权利要求4至6任一项所述羽衣甘蓝八SP和GA20ox三基因RNAi载体获得微型化羽衣甘蓝植株的方法，其特征在于，包括以下步骤 a.羽衣甘蓝外植体的制备将羽衣甘蓝种子消毒后，播种于含有质量分数为3%的蔗糖和质量分数为O. 8%的琼脂、pH为5. 8的1/2MS固体培养基上，在25±2°C、光周期16h/d、光照强度1000-20001χ条件下培养；将生长7-10天的帯柄子叶切下，接入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为O. 8%的琼脂、lmg/L 6-苄氨基腺嘌呤和lmg/L 2，4_D、pH为5. 8的MS固体培养基中，在25±2°C黑暗条件下预培养48小时，制得羽衣甘蓝外植体； b.农杆菌工程菌液的制备将含有羽衣甘蓝洲5P和GA20ox三基因RNAi载体的农杆菌工程菌株接种于含有质量分数为1. 2%的琼脂、50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7. 2的YEB固体培养基上，28 ±2 °C黑暗条件下活化2_3天至长出单菌落，挑取单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7. 2的YEB液体培养基20mL，在28±2°C、200rpm条件下扩大培养1. 5天，再将所得菌液按体积比为1:100接入含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7. 2的YEB液体培养基中，在28±2°C、200rpm条件下扩大培养至OD6tltl=L 8-2. 0，然后28±2°C离心弃上清，菌体用新鲜的YEB液体培养基洗涤，再用含有质量分数为3%的蔗糖、pH为5. 8的MS盐溶液IOOmL重悬，制得农杆菌工程菌液； c.农杆菌的侵染转化将步骤a制得的羽衣甘蓝外植体置步骤b制得的农杆菌工程菌液中浸染15分钟后，接入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为O. 8%的琼脂、lmg/L 6-苄氨基腺嘌呤和lmg/L 2，4-D、pH为5. 8的MS固体培养基中，25±2°C黑暗条件下共培养48小时，再转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为O. 8%的琼脂、4mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、2mg/L玉米素、5mg/L硝酸银、500mg/L羧节青霉素和20mg/L卡那霉素、pH为5. 8的MS固体培养基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照强度1000-20001x条件下培养至长出愈伤组织及抗性芽；将长2-3cm的抗性芽切下，转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为O. 8%的琼月旨、O. 2mg/L萘乙酸、250mg/L羧苄青霉素和5mg/L卡那霉素、pH为5. 8的1/2MS固体培养基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照强度1000-20001x条件下培养至生根，即得转基因羽衣甘蓝植株； d.转基因阳性植株的获得 通过PCR检测羽衣甘蓝洲和三基因RNAi载体中含有的报告基因在转基因羽衣甘蓝植株中的表达，以及qPCR检测Λ / 八5P和GA20ox三基因在转基因羽衣甘蓝植株中的表达，从步骤c获得的转基因羽衣甘蓝植株中筛选出转基因阳性植株，即获得微型化羽衣甘蓝植株。
全文摘要
本发明公开了羽衣甘蓝DWARF、SP和GA20ox三基因片段(序列分别如SEQIDNo.1第1-936位核苷酸、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所示)和基于上述片段构建的羽衣甘蓝DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi载体，将该RNAi载体通过农杆菌介导转化羽衣甘蓝，所得转基因阳性植株中DWARF、SP和GA20ox三基因的表达均较非转基因植株显著降低，植株株型为微型化表型，从而通过DWARF、SP和GA20ox三基因共沉默获得了微型化羽衣甘蓝新品种，具有良好的市场前景和经济价值，同时为其它植物的微型化育种提供了参考和借鉴。
文档编号C12N15/54GK103014030SQ20131000873
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者胡宗利, 解巧利, 陈国平, 涂昀, 刘琴 申请人:重庆大学