专利名称：一株可可木霉及其在防治蔬菜病害中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株可可木霉及其在防治蔬菜病害中的应用。
背景技术：
目前，我国蔬菜种植面积已经超过15，000万亩，其中大棚蔬菜和设施园艺植物已超过2010万亩。由于蔬菜温室栽培面积的扩大和重茬连作，为病虫害的发生提供了有利的生态条件。蔬菜枯萎病，灰霉病，立枯病等多种真菌病害在蔬菜种植中普遍发生，发生严重时，造成大幅度减产，是农民在育苗、种植过程中常遇到的棘手问题。辣椒疫病是由青椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)引起的一种土传病害，是青椒的毁灭性病害，在青椒的整个生育期内均可发病。青椒疫霉(Phytophthora capsiciLeonian)是鞭毛菌亚门的真菌。病菌以卵孢子在土壤中或病残体中越冬，借风、雨、灌水及其他农事活动传播。发病后可产生新的孢子囊，形成游动孢子进行再侵染。病菌生育温度范围为10 - 37°C，最适宜温度为20 - 30°C。空气相对湿度达90%以上时发病迅速；重茬、低洼地、排水不良，氮肥使用偏多、密度过大、植株衰弱均有利于该病的发生和蔓延。大水漫灌和高温高湿的条件容易引起青椒疫病的大面积流行，常造成辣椒减产，甚至绝收，辣椒疫病已成为世界范围内青椒的毁灭性病害。灰霉病在我国北方菜区是一种危害性很大的病害。塑料大棚、温室、小拱棚等保护设施栽培的番茄、辣椒、黄瓜、菜豆等蔬菜常发生灰霉病的流行，严重时减产达20-30%以上。番爺灰霉病的病原是灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.),属于半知菌的一种真菌。分生孢子梗细长，有分隔和分枝，灰至灰褐色，成丛从寄主表皮长出，大小为280-550X12-24微米。分生孢子近球形或卵形，单细胞、淡色，大小为9-15X6.5_10微米。病菌还可产生黑褐色、不规则形的菌核。病菌寄主范围较广，除侵染茄科蔬菜外，还可侵染瓜类、甘蓝、菜豆、莴苣、洋葱、苹果等作物。病菌主要以菌丝体或微菌核随病残体或遗留在土壤中越冬，成为下一个生长季初侵染的菌源。在我国南方的病菌也可以在保护栽培设施内终年存活。病菌的分生孢子可通过风雨、昆虫、甚至农事操作而传播，条件适宜时即萌发，多从伤口或衰老、坏死组织侵入。初侵染发病后又长出大量新的分生孢子，通过传播可不断进行再侵染。目前生产上多采用化学药剂防治，但是长期大量地使用农药致使病原菌产生抗性，且严重破坏农业生态系统，造成对环境的污染。
发明内容
本发明的目的是提供一种可可木霉及其应用。本发明提供的可可木霉(Trichoderma theobromicola),名称为Gull,已于2012年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCN0.6994。可可木霉(Trichoderma theobromi cola )Gu 11CGMCC N0.6994 在下文中简称可可木霉 Gull。
所述可可木霉Gull可以分生孢子、厚垣孢子、菌丝或含有分生孢子和菌丝的菌丝体的形式存在。本发明所提供的可可木霉Gull的应用为下述任一种:1、可可木霉Gull在防治植物病害中的应用。2、可可木霉Gull和/或可可木霉Gull的代谢物在制备植物病原囷抑制剂中的应用。3、可可木霉Gull和/或可可木霉Gull的代谢物在制备植物病咅抑制剂中的应用。4、植物病原菌抑制剂或植物病害抑制剂，它的活性成分是可可木霉Gull和/或可可木霉Gull的代谢物。·5、防治蔬菜疫病的方法，包括用可可木霉菌悬浮液喷施蔬菜植株的步骤；所述可可木霉菌悬浮液是用水悬浮可可木霉Gull得到的液体，所述可可木霉菌悬浮液中可可木霉 Gull 的含量为(2.0X IO4)- (5.0XlO7) cfu/ml (如 107cfu/ml)。6、防治蔬菜真菌病害的方法，包括用可可木霉菌悬浮液喷施蔬菜植株的步骤；所述可可木霉菌悬浮液是用水悬浮可可木霉Gull得到的液体，所述可可木霉菌悬浮液中可可木霉 Gull 的含量为(2.0XlO4)- (5.0XlO7) cfu/ml (如 107cfu/ml)；所述蔬菜真菌病害为蔬菜灰霉病、蔬菜菌核病、蔬菜黑星病和蔬菜褐斑病中至少一种。7、防治蔬菜枯萎病的方法，包括用可可木霉菌悬浮液浸泡蔬菜胚根的步骤；所述可可木霉菌悬浮液是用水悬浮可可木霉Gull得到的液体，所述可可木霉菌悬浮液中可可木霉 Gull 的含量为(2.0XlO4)- (5.0XlO7) cfu/ml (如 107cfu/ml)。上文中，所述植物病害可为真菌病害。所述真菌病害可为植物疫病、植物灰霉病、植物菌核病、植物黑星病、植物枯萎病和植物褐斑病中的至少一种。所述植物疫病可由辣椒疫霉引起，所述植物灰霉病可由灰葡萄孢菌引起，所述植物菌核病可由菌核核盘菌引起，所述植物黑星病可由瓜疮痂枝孢霉菌弓I起，所述植物枯萎病可由尖孢镰刀菌引起，所述植物褐斑病可由瓜棒孢霉引起。所述植物疫病具体可为辣椒疫病。所述植物灰霉病具体可为番茄灰霉病。所述植物菌核病具体可为黄瓜菌核病。所述植物黑星病具体可为黄瓜黑星病。所述植物枯萎病具体可为黄瓜枯萎病。所述植物褐斑病具体可为黄瓜褐斑病。上文中，所述植物病原菌可为植物疫病致病菌、植物灰霉病致病菌、植物菌核病致病菌、植物黑星病致病菌、植物枯萎病致病菌、植物褐斑病致病菌和植物纹枯病致病菌中的至少一种。所述植物疫病致病菌具体可为辣椒疫霉，所述植物灰霉病致病菌具体可为灰葡萄孢菌，所述植物菌核病致病菌具体可为菌核核盘菌，所述植物黑星病致病菌具体可为瓜疮痂枝孢霉菌，所述植物枯萎病致病菌具体可为尖孢镰刀菌，所述植物褐斑病致病菌具体可为瓜棒抱霉。上文中，所述防治具体可为预防和/或治疗。所述可可木霉Gull的代谢物可从可可木霉Gull的发酵液中获得。所述可可木霉Gull的代谢物具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养可可木霉Gull，除去液体培养物(发酵液)中的可可木霉Gull即得到所述可可木霉Gull的代谢物。上文中，所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂中除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂中，所述可可木霉Gull可以分生孢子、厚垣孢子、菌丝或含有分生孢子和菌丝的菌丝体的形式存在。所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。根据需要，所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。本发明的制剂中的菌株Gull的分生孢子数量随剂型和施用的方法而变化。固体制剂中，分生孢子的数量为(I X IO5)- (I X 108)cfu/克，如(I X IO6)- (I X IO7)个Cfu/克。对于液体制剂，稀释后的喷洒液中分生孢子的含量通常为(2.0X IO4) - (5.0X IO7) cfu孢子/mL,如 107cfu/mL。所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂可以与其它适合的化学农药配合使用，从而降低化学农药剂的用量，减少对环境的污染。上述防治蔬菜疫病的方法中，所述蔬菜疫病可为辣椒疫病，所述蔬菜可为辣椒。上述防治蔬菜真菌病害的方法中，所述蔬菜可为黄瓜和/番茄。所述蔬菜灰霉病可为番茄灰霉病，所述蔬菜菌核病可为黄瓜菌核病，所述蔬菜黑星病可为黄瓜黑星病，所述蔬菜褐斑病可为黄瓜褐斑病。上述防治蔬菜枯萎病的方法中，`所述蔬菜枯萎病为黄瓜枯萎病，所述蔬菜为黄瓜。实验证明，可可木霉Gull菌剂(107cfu/mL)对褐斑病的防治效果是百菌清溶液的
0.463倍，对灰霉病的防治效果是百菌清溶液的0.931倍，对黑星病的防治效果是福星EC溶液0.752倍，对纹枯病的防治效果是井岗霉素溶液的0.568倍，对菌核病的防治效果是嘧霉胺悬浮剂溶液的0.831倍，对枯萎病的防治效果是甲基托布津溶液的0.581倍，对疫病的防治效果是烯酰吗啉溶液的1.10倍。本发明的可可木霉Gull及其制剂对环境友好，可抑制病害病原的耐药和抗药性发展，有利于绿色食品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对蔬菜作物安全。在土壤中引进拮抗微生物，通过生物防治可以有效地防治真菌病害并可以有效的改善环境，维持农业生态系统平衡，为走可持续发展道路提供强劲的后盾。生物材料保藏说明分类命名:可可木霉(Trichodermatheobromicola)菌株编号:Gull保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称:CGMCC地址:北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所保藏日期:2012年12月17日保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.6994下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 下述实施例中所用的黑星病致病菌为瓜疮痂枝孢霉菌(Cladosporiumcucumerinum),购自中国农业微生物菌种保藏管理中心,保藏编号ACCC36060。下述实施例中所用的枯萎病致病菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC36468。下述实施例中所用的褐斑病致病菌为瓜棒孢霉(Corynespora cassiicola Wei),购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC36068。下述实施例中所用的疫病致病菌为辣椒疫霉(Phytophthora capsisi,购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC37401。下述实施例中所用的灰霉病致病菌为灰葡萄孢菌(Botrytis Cinerea),购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC36041。下述实施例中所用的菌核病致病菌为菌核核盘菌(Sclerotiniasclerotiorumm),购自中国农业微生物菌种保藏管理中心,保藏编号ACCC30096。实施例1、可可木霉(Trichoderma theobromicola)GulI的获得和保藏一、采样
从北京、河北、新疆、山东、湖北等采集土样。二、菌株分离采用涂布法分离菌株。每个土样称取10g，分别倒入加有少许吐温80、玻璃珠以及IOOml蒸馏水无菌的500ml三角瓶中，摇勻,标号,用摇床摇30分钟。然后用微量注射器吸5ml 土壤悬池液于加入到含45ml灭菌蒸馏水的250ml三角瓶中，摇匀，再从250ml三角瓶中吸Iml加入到含9ml灭菌蒸馏水的试管中，进行倍比稀释，将样品梯度稀释到10_4和10_5的每个样品吸0.1ml滴于PDA平板，涂布，28°C培养48-72小时，从中挑选出产绿色分生孢子的菌落，进行斜面接种，待菌落长出后，将转接于PDA平板上分离、纯化，直到获得木霉纯培养。置于冰箱4°C保存。三、菌株筛选1、平皿拮抗筛选在PDA平板中心接种木霉菌块，在半径2.5cm左右的圆周上，等距离接种3点等量不同病原菌，将每三种不同的病原菌作为一组，共有三组，每组设三个重复。用记号笔做好标记菌株编号，以备观察记录。将接种好的培养皿放于28°C的培养箱中培养7-10d左右。隔日对所做的实验进行拍照，测量病原菌指向木霉的半径R和r。记录木霉与病原菌之间的形态特征。病菌与木霉交接后，观察病原菌对木霉菌落的包围、抑制、侵入和占领其营养空间的过程。筛选木霉菌株，依据以下原则进行:(I)生长速度明显高于病原菌的木霉，能够与病原菌争夺营养，从而显著抑制病原菌的生长；(2)与病原菌之间有0.2cm左右空隙，即产生了抑菌带，说明木霉在代谢过程中产生了某种抗生物质。结果见表I。
表1木霉菌株与9种病原菌之间平皿对峙记录
权利要求
1.可可木霉(Trichodermatheobromicola),其特征在于:所述可可木霉(Trichoderma theobromicola)的菌株号为Gull,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC N0.6994。
2.权利要求1所述可可木霉在防治植物病害中的应用。
3.权利要求1所述的可可木霉和/或所述可可木霉的代谢物在制备植物病原菌抑制剂或植物病害抑制剂中的应用。
4.植物病原菌抑制剂或植物病害抑制剂，它的活性成分是权利要求1所述的可可木霉和/或所述可可木霉的代谢物。
5.如权利要求2或3所述的应用或权利要求4所述的抑制剂，其特征在于:所述植物病害为真菌病害。
6.如权利要求5所述的应用或抑制剂，其特征在于:所述真菌病害为植物疫病、植物灰霉病、植物菌核病、植物黑星病、植物枯萎病和植物褐斑病中的至少一种；或，所述植物病原菌为植物疫病致病菌、植物灰霉病致病菌、植物菌核病致病菌、植物黑星病致病菌、植物枯萎病致病菌和植物褐斑病致病菌中的至少一种。
7.如权利要求6所述的应用或抑制剂，其特征在于:所述植物疫病由辣椒疫霉引起，所述植物灰霉病由灰葡萄孢菌引起，所述植物菌核病由菌核核盘菌引起，所述植物黑星病由瓜疮痂枝孢霉菌引起，所述植物枯萎病由尖孢镰刀菌引起，所述植物褐斑病由瓜棒孢霉引起；或，所述植物疫病致病菌为辣椒疫霉，所述植物灰霉病致病菌为灰葡萄孢菌，所述植物菌核病致病菌为菌核核盘菌，所述植物黑星病致病菌为瓜疮痂枝孢霉菌，所述植物枯萎病致病菌为尖孢镰刀菌，所述植物褐斑病致病菌为瓜棒孢霉。
8.防治蔬菜疫病的方法，包括用可可木霉菌悬浮液喷施蔬菜植株的步骤；所述可可木霉菌悬浮液是用水悬浮权利要求1所述的可可木霉得到的液体，所述可可木霉菌悬浮液中权利要求1所述的可可木霉 的含量为(2.0XlO4)- (5.0XlO7) cfu/ml。
9.防治蔬菜真菌病害的方法，包括用可可木霉菌悬浮液喷施蔬菜植株的步骤；所述可可木霉菌悬浮液是用水悬浮权利要求1所述的可可木霉得到的液体，所述可可木霉菌悬浮液中权利要求1所述的可可木霉的含量为(2.0X IO4) - (5.0X IO7) cfu/ml ；所述蔬菜真菌病害为蔬菜灰霉病、蔬菜菌核病、蔬菜黑星病和蔬菜褐斑病中至少一种。
10.防治蔬菜枯萎病的方法，包括用可可木霉菌悬浮液浸泡蔬菜胚根的步骤；所述可可木霉菌悬浮液是用水悬浮权利要求1所述的可可木霉得到的液体，所述可可木霉菌悬浮液中权利要求1所述的可可木霉的含量为(2.0XlO4)- (5.0XlO7) cfu/ml。
全文摘要
本发明公开了一株可可木霉及其在防治蔬菜病害中的应用。本发明的可可木霉(Trichoderma theobromicola)的菌株号为Gu11，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.6994。本发明的可可木霉Gu11及其制剂对环境友好，可抑制病害病原的耐药和抗药性发展，有利于绿色食品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对蔬菜作物安全。在土壤中引进拮抗微生物，通过生物防治可以有效地防治真菌病害并可以有效的改善环境，维持农业生态系统平衡，为走可持续发展道路提供强劲的后盾。
文档编号C12R1/885GK103074237SQ201310023319
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者顾金刚, 李世贵, 刘好宝, 阮志勇, 张晓霞, 马晓彤, 张瑞颍 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所