一种基于mso/go的水体环境汞离子检测方法和试剂盒的制作方法

专利名称：一种基于mso/go的水体环境汞离子检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种基于汞离子特异性寡核苷酸探针(mercury-specific oligonucleotide, MS0)和氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)的萊离子检测方法及用于水中汞离子快速检测的试剂盒。
背景技术：
近年来，随着现代工农业的迅速发展，由汞引起的环境污染和中毒事件频繁爆发。工业“三废”的排放、城乡垃圾的制造、农药的不合理使用等，使得这个“隐形杀手”正威胁着我们的生活、侵蚀着我们的躯体。其中，我国水体环境汞污染问题较为突出，据农业部调查，我国污灌区面积约140X 104hm2，遭受重金属污染的土地面积占污染总面积的64.8%，其中以汞等的污染面积最大。全国目前约有3.2X 104hm2的耕地受到汞的污染，涉及15个省市的21个地区。2012年4月，全国污染防治工作会议在南京召开，从公布的2011年《重金属规划》考核结果中看，2011年重金属污染治理结果不理想，全国废水中汞排放量增幅最大，上升26.1%。汞作为引起 全球性环境污染的重金属之一，其在环境中主要以两种形态存在，表现为无机汞和有机汞。汞离子(Hg2+)长时间沉积不仅会造成土壤和环境的不可逆性污染，而且Hg2+通过食物链传递富集，进而进入人体，蓄积在骨骼与各器官中对大脑、神经系统等造成严重的破坏，严重危害着人类健康。因此，Hg2+的定性分析和定量检测对环境监测、食品工业和临床医学等领域都具有重要的意义。目前，国内外已经有许多灵敏性和特异性的Hg2+检测方法逐渐运用到实践中。传统的检测方法有原子吸收分光光度法、原子荧光分光光度法、高效液相色谱法和质谱法等，这些检测法都需要大型仪器，成本昂贵，操作复杂耗时，且需要有熟练的人员操作；而近年来发展的光化学分析技术、电化学传感器技术等，由于在灵敏度、特异性或操作简便性等上的缺陷，往往只能对被检物定性或半定量检测，仍然无法满足当前对Hg2+检测的要求。而新近发展的纳米生物传感器法具有体积小、简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点，很大程度上弥补了这些缺陷，特别是其中利用Hg2+可与MSO之间形成特异错配结合(T-Hg2+-T)这一特性构建的系列Hg2+生物传感器近年来逐渐成为研究的热点，在环境Hg2+监测中有十分广阔的应用前景。GO是由石墨经化学氧化，超声制备所得。它是一种二维的碳材料，具有电学性能优、导热性能好、力学强度高、比表面积大和水溶性强等优点，特别是它具有很好地区分单双链DNA和极高的荧光猝灭能力，因此也为生物分子的检测提供了新的思路。GO与生物分子之间的相互作用得到了广泛的研究。黄维等人设计了一种利用MSO和GO检测汞离子的突光检测方法(Xingfen Liu, Likun Miao, Xu Jiang, Yanwen Ma, Quli Fan and WeiHuang.Highly Sensitive Fluorometric Hg2+Biosensor with a Mercury (II)-SpecificOligonucleotide(MSO)Probe and Water-Soluble Graphene Oxide (WSGO).ChineseJournal of Chemistry2011, 29:1031-1035 ;利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测萊离子的突光检测方法，专利申请号:201010223065.4.)，但所用MSO是具有28个碱基的茎环结构，含有不与Hg2+结合的环结构和部分茎结构。

发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有的汞离子检测方法存在的不足，提供一种基于MS0/G0的痕量汞离子检测方法及用于水体环境汞离子超灵敏检测的试剂盒。为了能够降低DNA的合成成本，并提高汞离子检测的灵敏度，本研究者发现短序列寡核苷酸比长序列寡核苷酸与GO吸附速率更快而且更紧密，本发明对MSO进行优化设计并提供一种基于MS0/G0的汞离子检测方法和试剂盒，以满足实际环境监测中高效率低成本的要求。本发明的第一个目的是公开两条优化的MSO序列，去除原有MSO非特异的环部分(4bp)，截取两端的茎部分(9bp)，序列分别为5 ’ -TTCTTTCTT-3 ’(荧光标记)和5，-TTGTTTGTT-3’ (未荧光标记)。本发明的第二个目的是公开一种基于MS0/G0的汞离子检测方法。这种新方法可包括以下步骤:(I)将荧光标记和未荧光标记的MSO、GO在缓冲液中混合，室温反应；(2)将待测水溶液加入到上述溶液中，室温反应；(3)用荧光分光光度计进行荧光波长曲线的扫描，观察荧光强度变化，实现溶液中汞离子的定量检测。本发明的第三个目的是提供一种基于MS0/G0的水中汞离子快速检测的试剂盒，它含有:(1)60，浓度为0.58/1;(2)荧光标记和未荧光标记的MS0，浓度均为I μ mo I/L ；(3)含有金属离子的Tris-HCl缓冲液，浓度为20mM，PH为7.4 ;(4)阳性对照溶液和阴性对照溶液；(5)说明书。本发明的有益效果:(I)灵敏度高，最低检测限为IOpM ；(2)特异性强，与除Hg2+以外的其它10种金属离子交叉反应低；(3)价格低廉，优化设计后的MSO仅截取原MSO两端的茎部分(9bp)；(4)操作便捷，无需样本前处理；(5)具有一定的可重复使用性。

我们成功构建了一种基于MSO/和GO的汞离子检测方法及用于水中汞离子快速检测的试剂盒。具体涉及通过非共价键(η-η叠加)作用力将荧光修饰和未荧光修饰的两种MSO吸附到GO的表面，利用MSO与汞离子形成T-Hg2+-T的结构，使荧光标记的MSO从GO表面释放和荧光信号得到恢复，通过检测溶液中荧光信号的变化情况，实现溶液中汞离子的定量检测。相对于现有技术，本发明提供的两条截短的MS0(9bp)，序列更短、成本更低；利用GO对荧光标记和未荧光标记的MSO的影响，实现对Hg2+的定量检测，且灵敏度更高(IOpM)，与黄维和刘兴奋等人报道结果(最低检测限为187pM)相比提高了 18倍。本发明涉及的汞离子检测方法，在其他金属离子存在的情况下，依然拥有良好的选择性，并且实现了可重复使用的实际利用价值。该汞离子检测方法和试剂盒在不使用任何特殊仪器条件下就可以实现对Hg2+便捷分析，操作简便，分析速度快，灵敏度高，特异性强，对很多非特异性金属离子的响应都非常小，特别适合于推广利用。


下面结合附图对本发明做进一步说明。图1荧光标记和未荧光标记的MSO用量优化设计图2缓冲液优化设计(注=Bufferl表示含有金属离子Tris-HCl缓冲液，Buffer2表示不含有金属离子Tris-HCl缓冲液)图3 GO与Hg2+加样顺序探究图4 GO用量优化设计图5最佳反应时间确定 图6 Hg2+荧光检测灵敏度分析图7 Hg2+荧光检测特异性评价图8荧光检测混合溶液(注:A为一价金属离子混合组；B为二价金属离子混合组；C为碱土金属混合组；D为一价金属离子混合组+100 μ M Hg2+ ；Ε为二价金属离子混合组+100 μ M Hg2+ ；F 为碱土金属混合组 +100 μ M Hg2+ ；G 为 100 μ M Hg2+)图9荧光检测河水模拟标本(注:Α:空白对照组组；Β:河水组；C:10 μ M Hg2+河水组)图10可重复利用性研究(注:1:去离子水组；2:第一次加入Hg2+ ；3:第一次加入Na2S2O3 ；4:第二次加入 Hg2+)
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。以下是部分本发明实施例中所用的仪器和设备，其他未注明的实验条件按照常规或以其制造厂商所建议的条件:RF-5301PC荧光分光光度计(日本岛津公司)；MiniSpin个人型高速离心机(德国Eppendorf公司);Centrifuge5417R小型台式高速冷冻离心机(德国 Eppendorf 公司)；Thermo Scientific NanoDrop2000 分光光度计(美国 ThermoScientific 公司)；PURELAB Classic 超纯水仪(英国 ELGA LabWater 公司);PHS_3C 型 PH计(上海精密科学仪器有限公司)；电子天平BSA224S (德国sartorius公司)；通风橱(苏净集团安泰公司)；高压锅(日本ALP公司)。实施例1 MSO优化设计本发明选用的MSO序列见表1，其中MSO1为黄维等人报道的汞离子特异性寡核苷酸探针(茎环结构)。为了能够提高汞离子检测的灵敏度，并降低DNA的合成成本，对MSO1进行优化设计，去除非特异的环部分(4bp)，截取两端的茎部分(9bp)，分别标记为1^02和MSO3。
表I汞离子特异性寡核苷酸
权利要求
1.一种基于MSO/GO汞离子检测用的荧光标记MSO序列:5’ -TTCTTTCTT-3’和未荧光标记 MSO 序列:5’ -TTGTTTGTT-3’。
2.一种基于MS0/G0的汞离子检测方法，其特征在于，依次包括以下步骤: (1)将突光标记和未突光标记的MSO、GO在缓冲液中混合,室温反应； (2)将待测水溶液加入到上述溶液中，室温反应； (3)用荧光分光光度计进行荧光波长曲线的扫描，观察荧光强度变化，实现溶液中汞离子的定量检测。
3.根据权利要求2所述的一种基于MS0/G0的汞离子检测方法，其特征在于，将荧光标记和未荧光标记的MS0，通过非共价键(J1-Ji叠加)作用力吸附到GO表面，如果溶液中不存在汞离子，荧光标记和未荧光标记的MSO会无规则卷曲，通过强烈的π-π叠加作用而吸附于GO的表面，使得标记于MSO末端的荧光基团由于染料与GO之间的高效电子或能量转移而严重猝灭；如果溶液中存在汞离子，这两种MSO会与汞离子形成T-Hg2+-T的结构，使荧光标记的MSO从GO表面释放和荧光信号得到恢复；通过检测溶液中荧光信号的变化情况，可以实现溶液中汞离子的定量检测。
4.根据权利要求2所述的一种基于MS0/G0的汞离子检测方法，其特征在于，步骤(I)所述的突光标记和未突光标记的MSO的序列为权利要求1所述的序列，突光标记的MSO的序列5’ -TTCTTTCTT-3’和未荧光标记的MSO的序列5’ -TTGTTTGTT-3’。
5.根据权利要求2所述的一种基于MS0/G0的汞离子检测方法，其特征在于，步骤(I)所述的MSO的浓度均为I μ Μ,荧光标记的染料为荧光素。
6.根据权利要求1所述的一种基于MS0/G0的汞离子检测方法，其特征在于，步骤(I)所述的GO用量为5 μ 1，浓度 为0.5g/L。
7.根据权利要求2所述的一种基于MS0/G0的汞离子检测方法，其特征在于，步骤(I)所述的缓冲液为含有IOOmM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2的Tris-HCl缓冲液，PH为7.4，Tris-HCl 浓度为 20mmol/L。
8.根据权利要求2所述的一种基于MS0/G0的汞离子检测方法，其特征在于，步骤(I)所述的室温反应时间为5分钟。
9.根据权利要求2所述的一种基于MS0/G0的汞离子检测方法，其特征在于，所有步骤均需在避光条件下进行。
10.根据权利要求2所述的一种基于MS0/G0的汞离子检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的室温反应时间为30分钟。
11.根据权利要求2所述的一种基于MS0/G0的汞离子检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的荧光波长扫描，所用的激发波长为480nm，发射波长为522nm。
12.—种用于特异性检测汞离子检测的MS0/G0试剂盒，其特征在于，试剂盒中含有: (1)G0，浓度为0.5g/L； (2)荧光标记和未荧光标记的MS0，浓度均为Iμ mo I/L ； (3)含有金属离子的Tris-HCl缓冲液，浓度为20mM，PH为7.4 ; (4)阳性对照溶液和阴性对照溶液； (5)说明书。
13.根据权利要求11所述的特异性检测汞离子的MS0/G0试剂盒，其特征在于，步骤(4)所述的阳性对照溶液为10iimol/LHgCl2溶液，阴性对照为去离子水。
全文摘要
本发明涉及一种基于汞离子特异性寡核苷酸探针(mercury-specific oligonucleotide，MSO)和氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)的汞离子检测方法及用于水中汞离子快速检测的试剂盒。利用非共价键(π-π叠加)作用力将荧光修饰和未荧光修饰的优化MSO吸附到GO的表面，利用MSO与汞离子形成T-Hg2+-T的结构，使荧光标记的MSO从GO表面释放和荧光信号得到恢复，通过检测溶液中荧光信号的变化情况，实现溶液中汞离子的定量检测。本发明所述的方法在不需要任何特殊条件下即可实现对汞离子便捷分析，最低检测限为10pM，灵敏度大幅提高，并降低了DNA合成成本，为监测水中汞离子的污染提供一种简便、高效、灵敏、高性价比的解决方案，易于推广。
文档编号C12Q1/68GK103173540SQ201310037728
公开日2013年6月26日 申请日期2013年1月3日 优先权日2013年1月3日
发明者吕建新, 吴文鹤 申请人:温州医学院