专利名称：焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法
技术领域：
:本发明属于食源性寄生虫的检测技术领域，涉及一种采用焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术检测贾第鞭毛虫的方法。
背景技术：
:贾第鞭毛虫(Giardia Iamblia)是一种具有2个细胞核的多鞭毛寄生原虫,可寄生于人体和多种脊椎动物肠道内，继而引起以腹泻为主的贾第虫病(Giardiasis)，为人体肠道感染的常见寄生虫之一，在世界范围内普遍存在。由于其在供水系统中存活时间较长，对氯等消毒剂的耐受性高，存在污染的水对供水安全造成极大威胁。研究表明:贾第虫的致病剂量为10 100个活孢囊。人体感染贾第虫后，主要症状是腹痛、腹泻、腹胀、呕吐、发热和厌食等，典型病人表现为以腹泻为主的吸收不良综合征，腹泻呈水样粪便，量大、恶息、无脓血。儿童患者可由于腹泻，引起贫血等营养不良，导致生长滞缓。若不及时治疗，多发展为慢性，表现为周期性稀便，反复发作，大便甚臭，病程可长达数年。据美国资料分析显示，1990 2000年，由于地表水受原虫污染，导致生活饮用水污染而引起的感染暴发事件呈上升趋势；加拿大66家水厂水源水样本中有81%的水样检出了原虫；日本某饮用水净水厂原水中，贾第虫包囊的检出率为12/13。就我国的情况看，在珠江的西江珠海段监测显示，水中贾第虫包囊量为O 152个/100L，在广州市2003年主要供水河段水源水原虫监测中，阳性率为46 %，枯水期更高达80 %。因此，深入加强对贾第鞭毛虫的检测确证研究刻不容缓。目前，用于贾第鞭毛虫的检测及确证方法主要有密度检测、聚合酶链反应、荧光杂交等方法。但应用密度检测时，其回收率偏低，同时显微镜检分析多依赖于人员的经验和专业背景知识，主观性较大；应用PCR技术检测确证时，如果引物特异性不强，可能出现检测假阳性；利用荧光杂交方法时由于DNA量较少，方法又不够灵敏。焦磷酸测序技术是近年发展起来的新技术，它是目前唯一得到定量序列结果的检测技术，具有极高的准确性，且重现性极佳，是一种通用型技术平台，功能多样，应用领域广泛，具有高通量、低成本的特点，聚合酶链式反应产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小，符合出入境检验检疫的要求，鉴于贾第鞭毛虫等原虫危害的严重性，加强环境中的的监控，提高检测效率和确证的准确度，对有效控制贾第鞭毛虫的传播在现阶段具有重要的实际意义
发明内容
:本发明所要解决的技术问题是克服现有技术在确证贾第鞭毛虫上存在的缺点，提供一种贾第鞭毛虫的焦磷酸测序技术检测确证方法，以克服现有检测技术的不足，为人体感染者及环境 中的水质监控提供一种快速、简便、高效、实用的确证贾第鞭毛虫的检测方法。为解决上述技术问题，本发明的主要原理是利用焦磷酸测序技术，通过测序引物和聚合酶链式反应扩增单链脱氧核糖核酸模板杂交，与脱氧核糖核酸聚合酶、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物(APS)、荧光素孵育，逐一加入四种三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs):三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP，如与模板配对，此三磷酸碱基脱氧核苷酸与引物的术端形成共价键，释放焦磷酸基团(PPi);腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶在底物(APS)存在的情况下催化焦磷酸形成腺嘌呤核苷三磷酸，腺嘌呤核苷三磷酸驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，氧化荧光素发出与腺嘌呤核苷三磷酸量成正比的可见光信号；光信号由电荷耦合器件(CCD)收集并由软件转化为峰；每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比，腺嘌呤核苷三磷酸和未掺入的三磷酸碱基脱氧核苷酸由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系，利用光信号转化得到的峰图，对样品中的贾第鞭毛虫进行准确的检测。本发明的实现，首先依据贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶(triose phosphateisomerase, tim)设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸(DNA)，然后分别以tim基因的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为165bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫。本发明所述的设计贾第鞭毛虫的特异性引物及焦磷酸测序引物是根据该虫的磷酸丙糖异构酶基因序列，选取保守序列，通过Assay Design SW软件设计特异性引物序列，以扩增出特异性单一条带，再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列(目标序列)设计焦磷酸测序引物以确证是否为贾第鞭毛虫；贾第鞭毛虫PCR及测序引物为:tim 基因上游引物 5’ -AATGTGTACCTAGAGGGGAACG-3’，5’ 进行生物素标记tim 基因下游引物 5’ -CTTTTCCAGGGCACGCTTA-3’，tim 基因测序引物 5’ -TCCAGGGCACGCTTA-3’。贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶的目标序列:GCCTTCTTGG CGCTTTGCTCGTCGGTCTCC ;扩增片段长度为165bp。本发明所述的提取待测样品的DNA是利用人源贾第虫包囊的粪便经100目系统网过滤，滤液用酚-氯仿法抽提而得；亦可用商业化的DNA提取试剂盒提取。本发明所述的以贾第鞭毛虫tim引物进行PCR扩增:其中，上下游引物扩增是将提取的待测样品DNA进行PCR扩增，扩增溶液中加入2XPCR buffer (10倍聚合酶链式Mix反应液)12.5 μ L，IOpmoI/ μ L上游引物和下游引物各0.5 μ L7DEPC水补足体积至25 μ L，PCR循环条件为:94°C预变性5min后，进入94°C变性30s，46°C退火30s，72°C延伸30s，共循环50次；然后72°C再延伸IOmin0本发明所述的PCR扩增产物电泳检测:取2g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 μ g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 μ L 6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。本发明所述的制备焦磷酸测序单链模板:使用50μ I标记有生物素的PCR产物与200 μ g链霉亲和素包被的磁珠,在室温25°C下孵育20分钟,用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起,然后在70%乙醇中清洗5s ；denatureation buffer (变性缓冲液)洗5s ;最后移到washingbuffer (冲洗缓冲液)中清洗IOs ;然后将vaccum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80°C烘箱2分钟，再冷却到室温。本发明所述的焦磷酸测序反应:测序反应在室温下于焦磷酸测序仪上检测，加样使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间,每轮反应时间65秒,引物链随着不同dNTP的加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。本发明所述的关于根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫:PCR反应为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段与tim基因目标片段完全相同的，确定为贾第鞭毛虫；PCR反应为阳性的，测序片段与目标片段有一个以上碱基不同判定为非贾第鞭毛虫；PCR反应为阴性的判定为非贾第鞭毛虫。本发明适用于对贾第鞭毛虫进行快速检测确证，可广泛应用于环境中的水质监控、人体粪便中卵囊检测及进出口贸易中该类原虫的确证；与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本的特点，PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
:图1为本发明对粪便样品中tim基因的扩增图谱，其中M:DL2000，1:粪便样品。图2为本发明对粪便样品中tim基因焦磷酸测序结果。
具体实施方式
:下面通过具体实施例并结合附图进一步阐述本发明。
实施例1:检测感染者粪便样品中是否含有贾第鞭毛虫1、设计特异性引物序列通过Internet登陆美国国立生物信息技术中心(NCBI)，查询检索已公布的贾第鞭毛虫tim的核苷酸序列，不包含不明碱基成分序列，对同源性较近的同年份同地点的虫株只选取一株，用DNAStar7.1软件包中的Editseq和MegAlign软件对所选样本的tim基因核苷酸序列进行编辑，逐一比对，用Clustal W Method (软件)默认参数对所选的tim核苷酸序列进行同源性比较，找到表征该虫的特异核苷酸序列(目标检测序列)。PCR扩增引物设计和测序引物设计均可以通过Assay Design SW软件来进行,使用得分较高的一组引物进行实验，根据DNASTAR的同源性分析结果，选取样本基因中较保守的序列区域，设计扩增引物，以便于扩增出特异性单一条带，为后续测序奠定基础。同时为各个扩增区域中包含的特异核苷酸序列(目标序列)设计测序引物，tim扩增片段长度为165bp0贾第鞭毛虫PCR及测序引物为:tim 基因上游引物 5’ -AATGTGTACCTAGAGGGGAACG-3’，5’ 进行生物素标记t im 基因下游引物 5 ’ -CTTTTCCAGGGCACGCTTA-3 ’，tim 基因测序引物 5’ -TCCAGGGCACGCTTA-3’。2、提取待测样品的DNA
将含贾第虫包囊的粪便经100目细铜网过滤，滤液离心(2000r/min，IOmin)，弃上清，沉淀加水至2mL 3mL ;取另一离心管,加入0.85mol/L鹿糖5mL ;将上述包囊液加入到鹿糖上层，离心(2000r/min, 5min),缓慢吸取鹿糖上层含包囊悬液2mL,洗2次。用血球计数板计数纯化包囊数目。向上述纯化的包囊沉淀中加入400 μ L裂解液(含蛋白酶Κ200 μ g/mL)，重悬包囊，56°C温育3h，期间混匀多次；用酚-氯仿法分别抽提贾第虫包囊DNA。。3、以贾第鞭毛虫tim引物进行PCR扩增扩增溶液中加入2 X PCR buffer (10倍聚合酶链式Mix反应液)12.5 μ L，IOpmoI/μ L上游引物和下游引物各0.5 μ L，将提取的待测样品DNA加入反应体系中，DEPC水补足体积至25 μ L，PCR循环条件为:94°C预变性5min后，进入94°C变性30s，46°C退火30s，72°C延伸30s，共循环50次；然后72°C再延伸IOmin.
4、进行琼脂糖凝胶电泳将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 μ g/mL,制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 μ L 6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果，待检贾第虫样品能够扩增出特异性条带，扩增条带为165bp，电泳结果见图1。5、制备焦磷酸测序单链模板
使用50 μ I标记有生物素的PCR产物与200 μ g链霉亲和素包被的磁珠，在室温25°C下孵育20分钟，用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70%乙醇中清洗 5s ；denatureation buffer 洗 5s ;最后移到 washing buffer 中清洗 IOs ；vaccumprep tool放入含有tim基因测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80°C烘箱2分钟，再冷却到室温。6、焦磷酸测序在焦磷酸测序仪(PYR0MARK ID)上进行反应，室温条件下，加样使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延伸；随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，tim基因焦磷酸测序结果见图2，读取的序列为GCCTTCTTGG CGCTTTGCTC GTCGGTCTCC。7、结果判定粪便样品的tim基因扩增片段长度为165bp，与预期一致；经过焦磷酸测序，测定的tim序列与贾第鞭毛虫目标序列一致，为:GCCTTCTTGG CGCTTTGCTC GTCGGTCTCC，因此判定样品中含有贾第鞭毛虫。实施例2:检测某水域中是否含有贾第鞭毛虫1、设计特异性引物序列同实施例1。2、提取待测样品的DNA:采集一定体积水样(水源水10L,滤后水50L),经I μ m孔径滤膜过滤后，依次用PBS+0.1% Tween80、乙醇、超纯水清洗容器，滤膜用40mL丙酮溶解，在3000r/min下离心去上清液后，再次加入40mL丙酮溶液并离心去上清液，得到相应沉淀。向浓缩得到的沉淀中加入6mL的PBS+0.1 % Tween80,用振荡器振荡2min,混合均匀后将溶液均匀分至4个15mL离心管中，向每个离心管中加入3mL离心介质Percoll-蔗糖，于20°C、3000r/min下离心IOmin,此时溶液分成3层,取出中间层放入新的离心管中。采用 DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver3.0)，按照说明书进行中间层DNA的提取。3、以贸第鞭毛虫tim引物进行PCR扩增同实施例1。4、进行琼脂糖凝胶电泳:将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 μ g/mL,制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 μ L 6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果。待检样品PCR扩增未扩增出特异性条带，因此判定某水域中的样品中不含有贾第鞭毛虫。实施例3:检测不同原虫样品中是否含有贾第鞭毛虫基因1、设计特异性引物序列同实施例1。2、提取待测样品的DNA2.1贾第虫虫株来源用于本实验的贾第鞭毛虫株购自澳大利亚BTF公司。2.2对照DNA样本日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、微小隐抱子虫(Cryptosporidium parvum)、溶组织内阿米巴虫(Entamoeba histolytica)DNA样本为上海兽医研究所提供。2.3贾第虫包囊的分离纯化及DNA制备将含贾第虫包囊的样品经100目细铜网过滤，滤液离心(2000r/min，IOmin)，弃上清，沉淀加水至2mL 3mL ;取另一离心管,加入0.85mol/L鹿糖5mL ;将上述包囊液加入到鹿糖上层，离心(2000r/min, 5min),缓慢吸取鹿糖上层含包囊悬液2mL,洗2次。用血球计数板计数纯化包囊数目。向上述纯化的包囊沉淀中加入400 μ L裂解液(含蛋白酶Κ200 μ g/mL)，重悬包囊，56°C温育3h，期间混匀多次；用酚-氯仿法分别抽提贾第虫包囊DNA。3、以贾第鞭毛虫tim引物进行PCR扩增扩增溶液中加入2 X PCR buffer (10倍聚合酶链式Mix反应液)12.5 μ L, IOpmoI/μ L上游引物和下游引物各0.5 μ L，将提取的待测样品DNA和对照DNA样本分别加入到反应体系中，DEPC水补足体积至25 μ L，PCR循环条件为:94°C预变性5min后，进入94°C变性30s，46°C退火30s，72° C延伸30s，共循环50次；然后72°C再延伸IOmin.
4、进行琼脂糖凝胶电泳将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 μ g/mL,制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 μ L 6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果，待检贾第虫样品能够扩增出特异性条带，扩增条带为165bp，其他原虫DNA样本均未检测到条带。
5、制备焦磷酸测序单链模板使用扩增出条带的PCR产物50μ I与200μ g链霉亲和素包被的磁珠，在室温25°C下孵育20分钟，用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70%乙醇中清洗 5s ;denatureation buffer 洗 5s ;最后移至丨J washing buffer 中清洗 IOs ；vaccum preptool放入含有tim基因测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80°C烘箱2分钟，再冷却到室温。6、焦磷酸测序在焦磷酸测序仪(PYROMARK ID)上进行反应，室温条件下，加样使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延伸；随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读取的序列为GCCTTCTTGGCGCTTTGCTCGTCGGTCTCC。7、结果判定粪便样品的tim基因扩增片段长度为165bp，与预期一致；经过焦磷酸测序，测定的tim序列与贾第鞭毛虫目标序列一致，为:GCCTTCTTGG CGCTTTGCTC GTCGGTCTCC，因此判定样品中含有贾第 鞭毛虫。
权利要求
1.一种焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，首先依据贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase, tim)设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸(DNA)，然后分别以tim基因的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为165bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫；所述的设计贾第鞭毛虫的特异性引物及焦磷酸测序引物是根据该虫的磷酸丙糖异构酶基因序列，选取保守序列，通过Assay Design SW软件设计特异性引物序列，以扩增出特异性单一条带，再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列(目标序列)设计焦磷酸测序引物以确证是否为贾第鞭毛虫；贾第鞭毛虫PCR及测序引物为: tim基因上游引物5’ -AATGTGTACCTAGAGGGGAACG-3’，5’进行生物素标记 tim 基因下游引物 5’ -CTTTTCCAGGGCACGCTTA-3’， tim 基因测序引物 5’ -TCCAGGGCACGCTTA-3’ ； 贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶的目标序列:GCCTTCTTGG CGCTTTGCTCGTCGGTCTCC ;扩增片段长度为165bp。
2.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，所述的提取待测样品的DNA是利用人源贾第虫包囊的粪便经100目系统网过滤，滤液用酚-氯仿法抽提而得；或用商业化的DNA提取试剂盒提取。
3.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，所述的以贾第鞭毛虫tim引物进行PCR扩增:其中，上下游引物扩增是将提取的待测样品DNA进行PCR扩增，扩增溶液中加入2XPCR buffer (10倍聚合酶链式Mix反应液)12.5 μ L，10pmol/yL上游引物和下游引物各0.5yL, DEPC水补足体积至25 μ L，PCR循环条件为:94°C预变性5min后，进入94°C变`性30s，46 °C退火30s，72°C延伸30s，共循环50次；然后72°C再延伸 lOmin。
4.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，所述的PCR扩增产物电泳检测:取2g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 μ g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 μ L 6 μ LPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。
5.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，所述的制备焦磷酸测序单链模板:使用50 μ I标记有生物素的PCR产物与200 μ g链霉亲和素包被的磁珠，在室温25°C下孵育20分钟,用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70%乙醇中清洗5s ;denatureation buffer (变性缓冲液)洗5s ;最后移到washing buffer (冲洗缓冲液)中清洗IOs ;然后将vaccum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80°C烘箱2分钟，再冷却到室温。
6.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，所述的焦磷酸测序反应:测序反应在室温下于焦磷酸测序仪上检测，加样使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。
7.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，所述的关于根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫:PCR反应为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段与tim基因目标片段完全相同的，确定为贾第鞭毛虫；PCR反应为阳性的，测序片段与目标片段有一个以上碱基不同判定为非贾第鞭毛虫；PCR反应为阴性的判定为非贾第鞭毛`虫。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，属于食源性寄生虫的检测技术领域，首先依据贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase，tim)设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸(DNA)，然后分别以tim基因的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为165bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫。本发明适用于对贾第鞭毛虫进行快速检测确证，可广泛应用于环境中的水质监控、人体粪便中卵囊检测及进出口贸易中该类原虫的确证。
文档编号C12Q1/68GK103103276SQ20131003685
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月31日 优先权日2013年1月31日
发明者孙涛, 邓明俊, 肖西志, 王群, 郑小龙, 凌宗帅 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心