专利名称：一种快速检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒的方法
技术领域：
本文发明一种快速检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒的方法，属于农业科学技术领域。
背景技术：
水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)为呼肠孤病毒科斐济病毒属(Fijivirus)病毒，危害水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、燕麦等，对农业生产造成了严重影响。RBSDV不仅危害水稻，弓I起水稻黑条矮缩病，同时也是引起玉米粗缩病的病原。20世纪60年代和90年代，由RBSDV引起的水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病在我国华北、华东等地大规模流行，造成严重损失。近年来，水稻黑条矮缩病危害呈逐年加重的趋势，所造成的损失也越来越大。江苏省2007年水稻黑条矮缩病的发生面积为2万hm2，至2008年迅速上升至26万hm2，2009年则发展到约33万hm2。RBSDV主要通过介体昆虫灰飞虱以增殖型持久性方式传播。介体带毒率与病害发生关系密切。快速而准确地检测灰飞虱体内的水稻黑条矮缩病毒对于由RBSDV引起的病毒病的预测预报和病害防治等具有重要的现实意义。RBSDV病毒粒子不稳定，在病毒纯化过程中病毒的外壳蛋白和表面突起容易丢失，因此提纯的病毒一般都是各种亚病毒粒子的混合物。用提纯的亚病毒粒子制备的抗血清对外壳蛋白不起特异反应，抗血清特异性较差。目前虽已有研究报道成功制备了 RBSDV的多克隆抗体，但用RBSDV多克隆抗体进行检测时容易出现假阳性。RT-PCR是检测单头灰飞虱是否携带RBSDV病毒的有效方法。该方法具有特异性好和灵敏度高的特点。常规RT-PCR方法在检测时需先提取灰飞虱的RNA，之后再进行RT-PCR检测。这个方法存在三个问题:(I)检测成本高。RNA提取过程需要购买多种试剂，如Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇等，约需花费2 3元，此过程大大增加了检测成本。
(2)灰飞虱虫体非常小，体长仅1.8 4.0mm，虫体不易研磨。(3)检测周期长。仅完成整个RNA提取过程就需50分钟。针对以上检测过程中存在的费时费力的问题，本文发明了一种快速检测单头灰飞虱体内RBSDV病毒的方法。采用清洗、捣碎和离心等步骤获取上清液，之后用此上清液进行反转录和PCR检测。该检测方法操作简便，大大节省了检测成本，缩短了检测时间，提闻了检测效率。
发明内容
本发明提供了一种快速检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒的方法。具体操作方法如下:(I)灰飞虱虫体在冰箱_20°C冷冻5分钟，取出单头灰飞虱装入0.2mL离心管；加入100 μ L的无菌水，用移液器轻轻吹打以清洗灰飞虱；清洗2次后将无菌水吸出，加入30 μ LDEPC水；取灭菌后的牙签捣碎灰飞虱虫体；10000g离心I分钟，取上清。(2)取离心后所得上清液为模板，进行反转录。反转录的具体操作步骤为:在
0.2mL离心管内加入9.5 μ L上清液和1μ L随机引物Random6。70°C放置5min后立即取出置于冰上放置lmin，依次加入5 XM-MuLV反转录酶缓冲液3 y L、dNTPs (10mM/dNTP) 0.5 y L、RNase inhibitor (20U/ u L)0.5u L, M-MuLV 反转录酶(200U/ u L)0.5u L, 42 °C 放置 lh，70°C保温5min。通过上述反转录步骤获得的反转录产物可置于_20°C保存备用或直接用于水稻黑条矮缩病毒的PCR检测。(3)采用PCR检测水稻黑条矮缩病毒。根据NCBI已登录的水稻黑条矮缩病毒基因组序列合成用于检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒的特异性引物。以步骤(2)中合成的反转录cDNA为模板进行PCR。PCR程序为:94°C预变性5min ;94°C变性50s，56°C退火50s，72°C延伸lmin，35 40个循环；72°C延长lOmin。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若出现与预期大小对应的电泳条带则表明灰飞虱体内含有水稻黑条矮缩病毒，反之则不含病毒。本发明提供了一种快速检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒的方法。该方法的特征是用无菌水清洗去除粘附在灰飞虱上的杂质；通过捣碎的方法使灰飞虱细胞内的RNA包括病毒的RNA释放出来；离心获得上清液，并用此上清液进行反转录和PCR。这个方法具有特异性好、灵敏度高的特点，不需要提取灰飞虱RNA，无需购买昂贵的RNA提取试剂，大大减少了检测成本，节省了时间，是一种快速、经济而且便捷的检测方法。
图1快速检测单头灰飞虱体内RBSDV的PCR结果示意图具体实施方法
实例一快速检测单头灰飞虱体内的水稻黑条矮缩病毒以饲养在水稻黑条矮缩病病苗上的灰飞虱群体作为检测对象，采用本发明的快速检测方法检测单头灰飞虱体内的水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)。具体操作方法为:将饲养在感染水稻黑条矮缩病毒的水稻病苗上的灰飞虱装入1.5mL离心管后置于_20°C冷冻5分钟；将冷冻后的单头灰飞虱装入0.2mL离心管，加入IOOuL的无菌水，用移液器轻轻吹打以清洗灰飞虱；清洗2次后将无菌水吸出，加入30 u LDEPC水后用无菌牙签捣碎灰飞虱虫体；10000g离心I分钟，取上清。在0.2mL离心管内加入9.5 ii L上清液和Iii L随机引物Random6，进行反转录。70°C放置5min后立即取出置于冰上放置lmin，依次加入5 XM-MuLV反转录酶缓冲液 3 ii L、dNTPs (10mM/dNTP) 0.5 u L, RNase inhibitor (20U/ u L)0.5u L,M-MuLV反转录酶(200U/ii L)0.L，42°C放置lh，70°C保温5min。将此反转录产物保存于_20°C或直接作为PCR模板进行检测。根据NCBI中已登录的RBSDV S6的序列(基因登录号:NC_003737)合成用于PCR检测的病毒特异性引物S6-F(引物序列为5，-gcctctcgaatcatccgtca-3，，198 217bp)和 S6-R(引物序列为 5，-acaatgaagactgaacatca-3，，909 928bp)进行 PCR 扩增。扩增的目标序列长度为731bp。PCR方法为:在0.2mL的离心管中分别加入反转录产物5.0 y L，10 X PCR 缓冲液 2.5 ii L, 10mM/dNTP0.5 y L，正向引物 S6-F0.5 y L，反向引物 S6-R0.5 u L,5U/u L TaqDNA聚合酶0.5 ii L，最后用ddH20补足至25 y L。PCR程序为:94°C预变性5min ;94°C变性50s，56°C退火50s，72°C延伸lmin，35个循环；72°C延长IOmin0 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。携带RBSDV的灰飞風可检测到731bp的电泳条带,不携带RBSDV的灰飞虱则检测不到此目标条带，如附图所示。
权利要求
1.一种快速检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒的方法，包括以下步骤: (1)灰飞虱在_20°C冷冻5min，取出单头灰飞虱装入0.2mL离心管，加入100 u L的无菌水清洗灰飞虱，清洗2次后加入30 μ L DEPC水，用无菌牙签捣碎虫体，IOOOOg离心lmin，取上清。
(2)以离心后获得的上清液为模板，用随机引物进行反转录。反转录方法为:在0.2mL离心管内加入9.5 μ L上清液和1 μ L随机引物Random6。70°C放置5min后立即取出置于冰上放置 lmin，依次加入 5 XM-MuLV 反转录酶缓冲液 3 μ L、dNTPs (10mM/dNTP) 0.5 u L, RNaseinhibitor (20U/ μ L)0.5 ii L、M-MuLV 反转录酶(200U/ μ L) 0.5 μ L，42°C放置 lh，70°C保温5min。
(3)以反转录产物为模板，采用RBSDV病毒的特异性引物进行PCR扩增。PCR扩增产物在I %琼脂糖凝胶上进行电泳分离，若PCR能扩增到与预期大小一致的电泳条带则表明单头灰飞虱中含有RBSDV。RBSDV病毒的特异性引物可根据NCBI中已登录的RBSDV的基因组S1 S10序列进行设计。PCR方法为:在0.2mL的离心管中分别加入反转录产物5.0 μ L，10XPCR 缓冲液 2.5u L, 10mM/dNTP0.5 u L,正向引物 0.5 y L，反向引物 0.5u L,5U/u LTaqDNA聚合酶0.5 iiL，最后用ddH20补足至25 μ L。PCR程序为:94°C预变性5min ;94°C变性 50s，56°C退火 50s，72°C延伸 lmin，35 40 个循环；72°C延长 10min。
2.根据权利要求1所述的快速检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒的方法，其特征在于不需要提取灰飞虱RNA，通过捣碎的方法使灰飞虱细胞内的RNA包括病毒的RNA释放出来，离心获得适用于检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒的上清液。
3.根据权利要求1所述的快速检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒的方法，其特征在于用上清液作为模板，用随机引物进行反转录，获得适用于PCR检测水稻黑条矮缩病毒的cDNA模板。
4.根据权利要求1所述的快速检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒的方法，其特征在于PCR扩增的循环次数为35 40次。
全文摘要
本发明提供一种快速检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒的方法，属于农业科学技术领域。水稻黑条矮缩病毒主要通过介体昆虫灰飞虱进行传播。采用常规RT-PCR方法检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒需提取单头灰飞虱RNA，之后再进行反转录和PCR检测。单头灰飞虱RNA提取存在成本高和耗时长等缺点。本发明用无菌水清洗灰飞虱虫体后，加入DEPC水，采用牙签捣碎虫体的方法使灰飞虱体内的RNA包括水稻黑条矮缩病毒RNA释放出来，通过离心获得上清液，之后用此上清液进行反转录和PCR。此方法无需提纯单头灰飞虱RNA，可以快速检测单头灰飞虱体内的水稻黑条矮缩病毒，大大降低了检测成本，缩短了检测时间。
文档编号C12Q1/68GK103103292SQ20131003712
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月31日 优先权日2013年1月31日
发明者徐秋芳, 周益军, 周彤, 季英华, 程兆榜 申请人:江苏省农业科学院