专利名称：修饰的安卡拉痘苗病毒基因的基因组中保守基因之间的基因间位点的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于稳定整合外源DNA序列至MVA基因组内的插入位点。相关技术的描述痘病毒科的成员具有编码数百种蛋白质的庞大双链DNA基因组(《费氏病毒学，第五版》Moss, B.2007 “痕病毒科:病毒及其复制”(〃Poxviridae: The Viruses and TheirReplication^in Fields Virology, 5th Ed) (D.M.Knipe, P.M.Howley, D.E.Griffin, R.A.1 Lamb, M.A.Martin, B.Roizman 和 S.E.Straus, Eds) , Lippincottffi 11 iams&ffilkins, Philadelphia, PA)。已 知高度减毒的痘苗病毒株-修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)的基因组序列(Sutter, G 和 Moss, B.1992 美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA) 89:10847-10851 ；和Sutter, G.等1994疫苗(Vaccine) 12:1032-1040)，其中所述的修饰的安卡拉痘苗病毒不能生长在大多数哺乳动物细胞中并且是重组疫苗载体的良好候选物。修饰的安卡拉痘苗病毒已经在鸡胚成纤维细胞中传代超过570次，在此期间相对于宿主范围严格限制的亲代野生型Ankara株而言,6个重大缺失已经出现(Meyer, H.等1991普通病毒学杂志(J GenVirol) 72:1031-1038)。发明简述本发明涉及用于整合外源序列至痘苗病毒基因组的基因间区(IGR)内的新插入位点，其中所述的IGR位于该痘苗病毒基因组的两个相邻开放阅读框(ORF)之间或所述的IGR位于该痘苗病毒基因组的两个相邻开放阅读框的侧面，并且其中所述ORF对应于保守基因，并涉及用来插入外源DNA至痘苗病基因组内的相关质粒载体，并且还涉及作为药物或疫苗的含有插入所述新插入位点内的外源序列的重组痘苗病毒。
图1.基于pol基因序列同一性的HIV-1和HIV-2的系统发生学关系。SIVcpz和SIVsmm是分别从黑猩猩(chimpanzee)和白眉猴(sooty mangabey monkey)中回收的类人灵长类慢病毒。图2.基于全长pol基因序列的具有四种不同SIVepz分离株的HIV-1M组、N组和O组(group)的系统发生学关系。短棒表示遗传距离0.1 (10%核苷酸趋异性)并且星号指出基于env序列的N组HIV-1分离株的位置。图3.HIV-1分离株的嗜性及生物学特征。图4.HIV-编码的蛋白质。显示HIV基因的位置、初级翻译产物(在一些情况下是多聚蛋白)的尺寸和加工的成熟病毒蛋白。图5.成熟HIV-1病毒粒子的示意图。图6.HIV-1Env糖蛋白的线性示意图。箭头I表示gpl60切割成gpl20和gp41的位点。在gpl20中，交叉线区域代表可变结构域(V1-V5)并且空心框描述保守序列(C1-C5X在gp41胞外结构域中，显示几个结构域:氨基端融合肽和两个胞外结构域螺旋(氨基端螺旋与羧基端螺旋)。跨膜结构域由黑色框代表。在gp41胞浆结构域中，显示Tyr-X-X-Leu(YXXL)内吞基序(SEQ ID NO:1)和两个预测性螺旋结构域(螺旋-1和螺旋-2)。氨基酸编号被标出。图7.pLW-73转移载体。图8.pLW-73转移载体的核苷酸序列(上部链，SEQ IDNO:2 ;底部链，SEQ ID N0:3)。图9.编码乌干达进化枝D Env蛋白(分离株A07412)的核苷酸序列(SEQ IDN0:4)。图10.编码乌干达进化枝D gagpol蛋白(分离株A03349)的密码子变异的核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)。图11.重组MVA的生成和对所插入基因的稳定性的分析。A)将env和gagpol分别插入Del II和Del III位点的示意图例。B)通过免疫染色法评价稳定性。
图12.MVA/65A/G env中env突变的类型和频率。图 13.在 Del III 中插入 Env in I8R/G1L IGR 和 Gag Pol。图14.修饰Α/G构建体以增加稳定性。图15.蚀斑传代后的Env的表达。图16.各个克隆的PCR和蛋白质印迹分析。图17.通过双重重组 MVA (double recombinant MVA)表达 A/G env。图18.表达来自乌干达HN-1分离株的env和gagpol的重组病毒。图19.MVA/UGD4a_无着色env蚀斑的分析。图20.对重组MVA中UGD env基因的修饰图21.MVA/UGD4b_无着色gag蚀斑的分析。*,成段4-6个G或C残基的位置。图22.对重组MVA中UGD gagpol基因的修饰。图23.构建表达UGD env和gagpol的稳定重组MVA。图24.由MVA/UGD4d激发的细胞应答。图25.由MVA/UGD4d激发的抗体应答。微生物的保藏以下微生物已经根据布达佩斯条约条款以所示日期保藏于弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC):
权利要求
1.重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒，其包含插入所述MVA基因组的基因间区(IGR)内的异源DNA序列，其中，所述的IGR位于该MVA基因组的两个相邻开放阅读框(ORF)之间或所述的IGR位于该MVA基因组的两个相邻开放阅读框的侧面，并且其中所述ORF对应于保守基因，并且其中所述的两个相邻ORF以示例性方式或其相应方式选自由(使用CDC/阿卡姆贝斯的命名法则)其它痘苗病毒毒株中的044-045、049-050、050-051、058-059、064-065、065-066、069-070、070-071、071-072、072-073、073-074、074-075、075-076、076-077、077-078、078-079、081-082、085-086、086-087、089-090、092-093、093-094、095-096、097-098、100-101、101-102、102-103、104-105、108-109、113-114、114-115、118-119、121-122、122-123、123-124、127-128、128-129、129-130、130-131、131-132、132-133、133-134、134-135、135-136、141-142 和 142-143 所组成的组中。
2.根据权利要求I所述的MVA，其中，所述的两个相邻ORF选自由049-050、071-072、074-075、078-079、092-093、100-101、118-119、121-122 和 132-133 所组成的组中。
3.根据权利要求2所述的MVA，其中，所述的两个相邻ORF是071-072。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的MVA，其中，所述的异源DNA序列包含在痘病毒转录控制元件的转录性控制下的至少一个编码序列。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的MVA，其中，所述的异源DNA序列编码一种或多种蛋白质、多肽、肽、外来抗原或抗原表位。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的MVA，其中，所述的异源DNA序列得自人免疫缺陷病毒(HIV)。
7.根据权利要求6所述的MVA，其中，所述得自人免疫缺陷病毒的异源DNA序列编码HIV包膜。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的MVA，其中，所述的MVA基因组是保藏于美国典型培养物保藏中心登录号PTA-5095下的MVA的基因组。
9.根据权利要求1-7中任意一项所述的MVA，其中，所述的MVA基因组是具有Genbank登录号AY603355的序列的MVA基因组。
10.根据权利要求1-7中任意一项所述的MVA，其中所述的MVA基因组是具有Genbank登录号U94848的序列的MVA基因组。
11.权利要求1-10中任意一项所述的MVA用作药物和/或疫苗。
12.权利要求1-10中任意一项所述的MVA在制备用于治疗和/或预防病毒感染和/或增殖病的药物和/或疫苗中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，用于治疗或预防人免疫缺陷病毒(HIV)感染。
14.用于诱导免疫应答的疫苗或组合物，其包含权利要求1-10中任意一项所述的MVA。
15.药物组合物，其包含权利要求1-10中任意一项所述的MVA以及药学上可接受的载体、添加物、辅药、稀释剂和/或稳定剂。
16.用于在包括人的活的动物体中诱导免疫应答的方法，其包括施用权利要求1-10中任意一项所述的MVA至包括人的所述动物。
17.用于体外制备蛋白质、多肽、肽、抗原或表位的方法，其包括用权利要求1-10中任意一项所述的重组MVA感染宿主细胞，在合适条件下培养所述感染的宿主细胞，并且分离和/或富集由所述宿主细胞产生的多肽、蛋白质、肽、抗原、表位和/或病毒。
18.用于体外导入DNA序列至细胞的方法，所述的DNA序列与所述细胞的基因组同源和/或异源，其中，所述细胞用权利要求1-10中任意一项所述的MVA感染。
19.用于离体导入DNA序列至细胞的方法，所述的DNA序列与所述细胞的基因组同源和/或异源，其中，所述细胞用权利要求1-10中任意一项所述的MVA感染，并且所述的感染细胞随后施用至包括人在内的活的动物体。
20.用于导入DNA序列至包括人在内的活的动物体的方法，所述的DNA序列与所述动物体的基因组同源和/或异源，其通过施用权利要求1-10中任意一项所述的MVA至包括人在内的所述动物。
21.质粒载体，其包含得自MVA的基因组或与其同源的DNA序列，其中，所述的DNA序列包含位于所述MVA基因组的两个相邻开放阅读框之间或位于所述MVA基因组的两个相邻开放阅读框的侧面的IGR序列的完整片段或部分片段和插入所述IGR序列的克隆位点，所述克隆位点用于插入与该MVA的基因组异源的DNA序列和任选地插入报道基因盒和/或选择基因盒，并且其中所述的两个相邻ORF以示例性方式或其相应方式选自由(使用CDC/阿卡姆贝斯的命名法则)其它痘苗病毒毒株中的044-045、049-050、050-051、058-059、064-065、065-066、069-070、070-071、07卜072、072-073、073-074、074-075、075-076、076-077、077-078、078-079、081-082、085-086、086-087、089-090、092-093、093-094、095-096、097-098、100-101、101-102、102-103、104-105、108-109、113-114、114-115、118-119、121-122、122-123、123-124、127-128、128-129、129-130、130-131、131-132、132-133、133-134、134-135、135-136、141-142 和 142-143 所组成的组中。
22.包含得自MVA的基因组或与其同源的DNA序列的质粒载体，其中，所述的DNA序列包含两个相邻ORF的IGR侧翼序列和插入所述IGR的克隆位点，所述克隆位点用于插入与该MVA的基因组异源的DNA序列和任选地插入报道基因盒和/或选择基因盒，并且其中所述的两个相邻ORF以示例性方式或其相应方式选自由(使用CDC/阿卡姆贝斯的命名法则)其它痘苗病毒毒株中的 044-045、049-050、050-051、058-059、064-065、065-066、069-070、070-071,071-072,072-073,073-074,074-075,075-076,076-077,077-078,078-079,081-082,085-086,086-087,089-090,092-093,093-094,095-096,097-098,100-101,101-102、102-103、104-105、108-109、113-114、114-115、118-119、121-122、122-123、123-124、127-128、128-129、129-130、130-131、131-132、132-133、133-134、134-135、135-136、141-142 和 142-143 所组成的组中。
23.根据权利要求21或22所述的质粒载体，其中，所述的DNA序列包含IGR序列的完整片段或部分片段，所述的IGR序列包括用于插入所述异源DNA序列和任选地插入报道基因盒和/或选择基因盒的克隆位点。
24.根据权利要求21或22所述的质粒载体，其中，所述的两个相邻ORF选自由049-050、071-072、074-075、078-079、092-093、100-101、118-119、121-122 和 132-133 所组成的组中。
25.根据权利要求24所述的质粒载体，其中，所述的两个相邻ORF是071-072。
26.根据权利要求21-25中任意一项所述的质粒载体，其中，所述DNA序列得自保藏于美国典型培养物保藏中心登录号PTA-5095下的MVA的基因组或与其同源。
27.根据权利要求21-25中任意一项所述的质粒载体，其中，所述DNA序列得自具有Genbank登录号AY603355的序列的MVA的基因组或与其同源。
28.根据权利要求21-25中任意一项所述的质粒载体，其中，所述DNA序列得自具有Genbank登录号U94848的序列的MVA的基因组或与其同源。
29.用于制备权利要求I所述的MVA的方法，其包括用权利要求21-39中任意一项所述的质粒载体转染细胞；用MVA感染已转染的细胞；并鉴定、分离及任选地纯化所述MVA。
30.稳定在重组痘苗病毒中的插入物的方法，其包括鉴定所述插入物中的一段4个或4个以上G或C残基，并且通过置换在如此鉴定的残基段中产生沉默突变，从而减少所述残基段的长度。
31.pLW-73。
32.MVA/UGD4do
33.重组痘苗病毒，其包含插入所述痘苗病毒的基因间区(IGR)内的异源DNA序列，其中，所述的IGR位于该痘苗病毒基因组的两个相邻开放阅读框(ORF)之间或所述的IGR位于该痘苗病毒基因组的两个相邻开放阅读框的侧面，并且其中所述ORF对应于保守基因，并且其中所述的两个相邻ORF以示例性方式或其相应方式选自由(使用CDC/阿卡姆贝斯的命名法则)其它痘苗病毒毒株中的 044-045、049-050、050-051、058-059、064-065、065-066、069-070、070-071、07卜072、072-073、073-074、074-075、075-076、076-077、077-078、078-079、081-082、085-086、086-087、089-090、092-093、093-094、095-096、097-098、100-101、101-102、102-103、104-105、108-109、113-114、114-115、118-119、121-122、122-123、123-124、127-128、128-129、129-130、130-131、131-132、132-133、133-134、134-135、135-136、141-142 和 142-143 所组成的组中。
全文摘要
本发明涉及重组修饰的安卡拉痘苗病毒，其包含插入所述MVA基因组的基因间区内的异源DNA序列，其中，所述的IGR位于该MVA基因组的两个相邻开放阅读框之间或所述的IGR位于该MVA基因组的两个相邻开放阅读框的侧面，并且其中所述ORF对应于保守基因，并且其中所述的两个相邻ORF以示例性方式或其相应方式选自由(使用CDC/阿卡姆贝斯的命名法则)其它痘苗病毒毒株中的044-045、049-050、050-051、058-059、064-065、065-066、069-070、070-071、071-072、072-073、073-074、074-075、075-076、076-077、077-078、078-079、081-082、085-086、086-087、089-090、092-093、093-094、095-096、097-098、100-101、101-102、102-103、104-105、108-109、113-114、114-115、118-119、121-122、122-123、123-124、127-128、128-129、129-130、130-131、131-132、132-133、133-134、134-135、135-136、141-142和142-143所组成的组。
文档编号C12N15/863GK103255110SQ20131005490
公开日2013年8月21日 申请日期2007年8月24日 优先权日2006年8月25日
发明者伯纳德·莫斯, 琳达·怀亚特, 帕特里夏·厄尔 申请人:美国国有健康与人类服务部(马里兰州)