专利名称：一株高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一株高产β -葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
葡聚糖酶是一类能降解谷物中葡聚糖的水解酶类的总称，主要包括4种酶，即内-β_1，3-葡聚糖酶、内-β-1，3-1，4-葡聚糖酶、外-β-1，3-葡聚糖酶和外-β -1，4-葡聚糖酶。作为一种特异性外源酶，β -葡聚糖酶被广泛应用于啤酒酿造工业和饲料工业中。葡聚糖酶可分解大麦及麦芽中葡聚糖凝胶，降低麦汁粘度，提高麦汁滤速及得率，有利于改善啤酒风味，保持成品酒非生物稳定性；将其添加于谷物类饲料可降低动物消化道内容物黏度，有效地改善单胃动物对营养物质的消化吸收，提高饲料转化率，还可减少排泄物对环境的污染，有利于环境控制和疫病防治。葡聚糖酶的产生途径主要有两种。一种是在植物萌芽早期过程中产生。大麦等谷类种子发芽过程中产生葡聚糖酶催化水解胚乳细胞壁中的葡聚糖，解除其对胚乳中其它营养物质的抗性作用，β_葡聚糖酶可以降低浸提物的粘度，在催化时表现出对底物的β_糖苷键极强的专一性。另一种是在微生物发酵过程中产生。很多细菌、真菌和瘤胃微生物都可以产生β -葡聚糖酶，细菌中典型的产酶菌株有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amvloliquefaciens)等,真菌中有黑曲霉(Aspergillus niger)等。目前国内外主要采用微生物发酵的方法生产葡聚糖酶。微生物的种类不同，其产酶活力也有差异，通 常提高微生物酶活力水平主要通过采取物理与化学多次交叉诱变以及构造基因工程菌的方法来实现。贺小贤等(黑曲霉葡聚糖酶菌株诱变选育研究[J].食品科技，2005 (11).)以黑曲霉FHI为出发菌株，采用物理与化学相结合的方法，诱变选育出一株葡聚糖酶活性较高的菌株FH12，酶活性较出发菌株提高2.23倍。韩晶等(高产嗜热β -葡聚糖酶菌种的诱变选育研究[J].酿酒科技.2009 (8).)以嗜热β -葡聚糖酶产生菌枯草芽孢杆菌Χ-5为出发茵株，采用紫外线和硫酸二乙酯复合诱变处理技术，选育出一株产嗜热β -葡聚糖酶性能稳定、活力较高的突变株AS35，酶活性较原始出发茵株提高了 81.54%。孙军涛等(β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的克隆与序列分析[J].食品与生物技术学报.2011(30).)为了获得耐热的β -1, 3-1，4-葡聚糖酶，利用PCR技术从解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中扩增β-1, 3-1，4_葡聚糖酶基因(bgl),构建重组表达质粒pET30a-bgl转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，经异丙基硫代-β -D-半乳糖苷酸(IPTG)诱导表达获得重组β -1, 3-1，4-葡聚糖酶，并对纯化后的β -1, 3-1，4-葡聚糖酶进行酶学特性研究。尽管如此，诱变育种因其盲目性、随机性，导致工作量巨大，筛选时间漫长，且菌株的突变还面临回复现象的难题。原生质体融合技术可以扮演类似于有性生殖途径基因信息交流的作用，可使遗传物质传递更为完整，重组机率更大，有利于提高育种速度。
目前，国际β_葡聚糖酶市场主要由几个酶制剂公司如丹麦N0V0、荷兰GIST、美国MILES等占有，并在中国市场占据着极大的份额，虽然我国国内针对β_葡聚糖酶开展了大量的相关研究，但因产酶菌株存在的酶活力不高，稳定性不强等原因，始终未能应用于大规模工业化生产，进口酶制剂垄断国内市场的局面始终未能打破。
发明内容
本发明提供了一种高产β -葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌，解决了传统产酶菌株的酶活力低、稳定性差的问题。—种高产β -葡聚糖酶的菌株,分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),完整命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) pjlOl，该菌株已于2012年11月28日保存在位于北京市朝阳区大屯路的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏编号为:CGMCC N0.6897。本发明菌株属于硬(或厚)壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，单细胞，无荚膜，周生鞭毛，能运动，革兰氏阳性菌。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。本发明还提供了上述高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的诱变筛选方法，具体包括以下步骤:(I)制备出发菌株的菌悬液；(2)将出发菌株的菌悬液分别进行LiCl-紫外复合诱变和6tlCo- Y射线诱变，获得诱变株；(3)在诱变株中筛选出β -葡聚糖酶酶活性高于出发菌株的LiCl-紫外复合诱变株和6tlCo- Y射线诱变株 ；(4)将步骤(3)获得的LiCl-紫外复合诱变株和6tlCo- Y射线诱变株进行原生质体融合，得到融合子；(5)筛选出产β -葡聚糖酶酶活性高的高产融合子；(6)将所述的高产融合子进行至少两次的递归式原生质体融合，筛选出酶活力最高的菌株。复合诱变具有协同效应，具有比单因子作用更好的诱变效果，而原生质体融合由于不受细胞壁的限制，杂交频率更高，遗传物质传递的更加完整。将两者结合起来有利于快速筛选稳定的目标菌株。所述出发菌株可以为产酶活性较高的菌株或者应用于工业化生产的菌株，本发明的出发菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) QB-OI,由浙江大学生命科学院保藏，邵建忠(浙江，杭州)赠送。一般，所述菌悬液的浓度为IiTlO7个/mL ;更优选的，所述菌悬液的浓度为IO6个/mL。浓度过高则难以保证菌体均一的接受诱变，筛选过程中会长出大量且未经诱变的菌落，若浓度过低则会导致菌体致死多，不利于筛选有利突变。所述LiCl-紫外复合诱变的方法为:在出发菌株的菌悬液中加入LiCl，LiCl的终浓度达到0.6%，混匀后，进行紫外诱变，诱变后涂布至筛选培养基培养获得LiCl-紫外复合诱变株。
紫外照射的诱变条件影响诱变效果，所述紫外照射的诱变条件为:15W紫外灯，距离30cm,处理75s。60Co- Y射线诱变时，采用常规的诱变方法即可，诱变剂量控制在200(T4500Gy，更优选为3500Gy。所述原生质体融合一般包括原生质体制备、原生质体灭活以及原生质体的融合与再生。原生质体制备时，通常使用溶菌酶处理枯草芽孢杆菌的菌体，去除其细胞壁，一般，溶菌酶的终浓度为0.Γ0.2g/L，处理时间为2(T40min，处理温度为25°C 37°C。所述递归式原生质体融合即每次将原生质体融合的后代筛选出的产β -葡聚糖酶酶活性高的高产融合子进一步制成原生质体，再以同样的方法再次融合，如此重复多次。本发明还提供了所述的枯草芽孢杆菌CGMCC 6897在生产β-葡聚糖酶中的应用。具体可以包括以下步骤:(I)将枯草芽孢杆菌CGMCC 6897接入液体种子培养基进行增殖培养，获得种子液；(2)将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养。所述发酵培养基包括供微生物自身生长及发酵所需要的碳源、氮源、无机盐及微量兀素，发酵培养基的pH—般为5.0^8.0,优选的,发酵培养基的pH为6.5^7.5,更优选的，发酵培养基的pH为6.5。所述碳源可以为糊精、大麦粉、麸皮、可溶性淀粉、玉米粉、葡萄糖等。所述氮源可以为豆柏、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。优选的，所述发酵培养基为:糊精，40.(Γ80.0g/L ;大麦粉，40.(Γ80.0g/L ;豆柏，20.0 60.0g/L ；MgS04.7Η20，0.Γθ.4g/L ;Κ2ΗΡ04，0.I 2.0g/L ；FeS04.7Η20，0.θΓθ.04g/L ；CaCl2,0.Γ2.0g/L。最优选的，所述发酵培养基为:糊精，40.0g/L ;大麦粉，60.0g/L ;豆柏，20.0g/L ；MgSO4.7Η20，0.3g/L ；K2HPO4,1.0g/L ；FeS04.7Η20，0.0lg/L ；CaCl2,1.5g/L。发酵条件影响菌株的产酶能力和酶活，所述发酵培养条件为:温度为32 37°C，时间为24 60小时；更优选为:温度为37°C，时间为48小时。所述发酵培养可以是摇床培养，也可以是利用发酵罐工业化大规模培养，当采用摇床培养时，摇床转速为20(T300r/min，更优选为200r/min。与现有技术相比，本发明的有益效果为:本发明枯草芽孢杆菌CGMCC 6897遗传稳定性好，产生的β -葡聚糖酶活力高且稳定。本发明优化了该枯草芽孢杆菌的发酵条件，取得了较好的产酶效果，可应用于工业化发酵生产葡聚糖酶。
图1发酵培养基中不同碳源对产β -葡聚糖酶的影响；图2发酵培养基中不同有机氮源对产β -葡聚糖酶的影响；
图3发酵培养基中不同浓度的MgSO4对产β -葡聚糖酶的影响；
图4发酵培养基中不同浓度的FeSO4.7H20对产β -葡聚糖酶的影响；图5发酵培养基中不同浓度K2HPO4对产β -葡聚糖酶的影响；图6发酵培养基中不同浓度CaCl2对产β -葡聚糖酶的影响；图7发酵时间对产β -葡聚糖酶的影响；图8接种量对产β -葡聚糖酶的影响。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例所用的培养基及相关溶液配方如下:保藏培养基/传代培养基:牛肉膏，5.0g/L ;蛋白胨，10g/L ；NaCl,5.0g/L ;琼脂，20g/L ；pH7.2。液体种子培养基:牛肉膏，5.0g/L ;蛋白胨，10g/L ;NaCl，5.0g/L ；ρΗ7.0 7.2。发酵培养基:糊精，40.0g/L ;大麦粉，60.0g/L ;豆柏，20.0g/L ；MgS04.7Η20，0.3g/L ；K2HPO4,1.0g/L ；FeS04.7H20，0.0lg/L ；CaCl2,1.5g/L ；pH7.0。筛选培养基:β -葡聚糖，3.0g/L ;酵母膏，2.0g/L ;刚果红,0.2g/L ;琼脂，18g/L,(NH4)2S04，0.3g/L ；K2HPO4,1.0g/L ；MgS04.7H2 0,0.5g/L ；FeS04.7H20,0.0lg/L ；CaCl2,1.5g/L ；KC1,0.5g/L ；NaN03,3.0g/L ；pH7.0 7.2。再生培养基:大麦粉，60.0g/L ;玉米粉，40.0g/L ；MgS04.7H20,0.5g/L ；K2HPO4,1.0g/L,FeSO4.7Η20，0.0lg/L ；CaCl2,1.5g/L ；NaCl,5.0g/L ;琼脂，20g/L ；pH7.0 7.2，用 SMM
高渗溶液配置。LiCl溶液:准确称取Ig LiCl溶于IOmL蒸馏水中，过滤除菌。SMM 高渗溶液:鹿糖，5mol/L ；顺丁烯二酸,0.02mol/L ；MgCl2.6H20,0.02mol/L ；ρΗ7.0 ；0.06 0.07MPa, 30min,灭菌备用。溶菌酶液:溶菌酶，100g/L ;用SMM高渗溶液配制，过滤除菌，分装成小份，_20°C保存。聚乙二醇(PEG6000)溶液:PEG6000，400g/L；pH9.0，用 SMM 高渗溶液配置。新生磷酸钙=CaCl2,lmol/L ;Κ2Ρ04，0.02mol/L ；0.06 0.07MPa，30min，灭菌备用，用时将两者等体积混合。实施例1高产菌株的获得1、LiCl-紫外复合诱变出发菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)QB_01，由浙江大学生命科学院保藏，邵建忠(浙江，杭州)赠送。将出发菌株活化后用无菌生理盐水配制成浓度为IO6个/mL的单细胞悬液；取IOmL单细胞悬液于带磁力转子的培养皿中，加入600 μ L10%LiCl溶液，混匀；打开培养皿的盖子，在距培养皿30cm处，用15W紫外灯照射75s ;黑暗条件下将诱变后的单细胞悬液稀释IO3倍，涂布至筛选培养基平板上，37° C恒温培养箱中暗培养48h，得到LiCl-紫外复合诱变株。
以未经诱变的菌悬液同样操作作为对照，计算致死率为85%，说明该LiCl-紫外复合诱变条件比较合理，有利于筛选有诱变株。致死率的计算方法如下:
权利要求
1.株高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) pjlOl，保藏编号为 CGMCC N0.6897。
2.按权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在生产葡聚糖酶中的应用。
3.按权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤: (1)将枯草芽孢杆菌CGMCC6897接入种子培养基进行增殖培养，获得种子液； (2)将种子液接入发酵培养基进行发酵培养。
4.按权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的碳源为糊精、大麦粉、麸皮、可溶性淀粉、玉米粉和葡萄糖中的至少一种；所述发酵培养基的氮源为豆柏、花生饼粉、酵母粉和蛋白胨中的至少一种。
5.按权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基为:糊精，40.(Γ80.0g/L ;大麦粉，40.0 80.0g/L ；豆柏，20.0 60.0g/L ；MgS04.7Η20，0.Γθ.4g/L ;Κ2ΗΡ04，0.I 2.0g/L ；FeSO4.7Η20，0.0Γ0.04g/L ；CaCl2,0.Γ2.0g/L。
6.按权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基为:糊精，40.0g/L;大麦粉，60.0g/L ;豆柏，20.0g/L ;MgS04.7Η20，0.3g/L ；K2HP04,1.0g/L ；FeS04.7H20,0.0lg/L ；CaCl2,1.5g/L。
7.按权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养的温度为32 37°C，时间为2r60h,发酵培养基的初始pH为5.(Γ8.0。
8.按权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵培养的温度为37°C，时间为48h，发酵培养基的初始pH为6.5。
全文摘要
本发明公开了一株高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用，该枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)pj101，该菌株已于2012年11月28日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.6897。本发明还提供了上述高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株在发酵生产β-葡聚糖酶中的应用。本发明枯草芽孢杆菌CGMCC 6897遗传稳定性好，产生的β-葡聚糖酶活力高且稳定，另外，本发明还优化了该菌株的发酵条件，取得了较好的产酶效果，可应用于工业化发酵生产β-葡聚糖酶。
文档编号C12N9/24GK103087967SQ20131005397
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月20日 优先权日2013年2月20日
发明者胡向东, 朱静, 许美芳, 叶茂 申请人:杭州贝姿生物技术有限公司