专利名称：一种大豆抗花叶病毒主效基因位点及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于大豆分子生物学及遗传育种技术领域。更具体涉及一种大豆抗花叶病毒主效基因位点及与该主效基因位点紧密连锁的分子标记，同时还涉及该分子标记在大豆抗花叶病毒育种中的应用。
背景技术：
大豆是一种重要农作物，富含蛋白质和脂肪以及对人体有利的活性成分如皂贰、异黄酮、磷脂等，是世界上植物性蛋白和油分的主要来源之一。目前我国大豆种植面积、总产及单产均居世界第四位，生产水平落后于世界大豆生产。2012年中国大豆种植面积718万公顷，总产量1280万吨，而进口大豆达到创记录的5750万吨，占据我国五分之四的大豆市场。造成我国大豆生产滞后、供给严重不足、国内大豆产业遭受进口转基因大豆严重冲击的原因是多方面的，但主要原因之一是综合抗病虫害和抗逆能力差，单产低，种植效益低下，国际竞争力弱。大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus SMV)病是世界上分布最广泛,危害大豆最严重的病毒性病害之一，在我国各产区均有发生，己经成为我国东北、黄淮和长江流域大豆主产区最主要的病害之一。SMV侵染大豆后，会导致大豆叶片中叶绿素含量及叶质下降，叶面积减小，影响光合面积和光合能力，植株矮小，生长量下降，单株荚数减少，降低种子百粒重、萌发率、蛋白质含量及含油量，并影响脂肪酸、蛋白质、微量元素及游离氨基酸的组分等，严重影响大豆产量和品质。大豆被花叶病毒侵染后的产量损失一般在15% - 35%，发病严重的年份，引起的产量损失可达70%以上，甚至绝产。大豆品种感染SMV后，根、茎、叶等形态器官受到严重影响，影响程度从大到小依次为单株粒重、单株叶面积、根瘤重、茎叶干重、根干重、种子褐斑粒率、株高、百粒重，且早期感染SMV其危害大于中后期感染。大豆花叶病毒病不但影响大豆的产量，还影响大豆的品质，严重时病粒率达50%以上，严重降低大豆的商品质量。
作物的许多重要农艺性状如产量、品质和抗性等都是数量性状，由多个基因控制，表现为连续变异，且易受环境影响，相对于由单基因控制的质量性状而言，选择效果不好。通过构建遗传图谱，定位数量性状位点(quantitative trait loci, QTL),利用与QTL紧密连锁的分子标记在早代对育种材料进行选择，可克服环境影响，节约生产成本，提高选择效率，加快育进程。对大豆抗SMV的QTL定位研究也有一些报道，目前，在大豆第2、13和14号染色体上已定位抗大豆花叶病毒QTL，但效应值较小,较难在大豆育种中应用。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供鉴定或辅助鉴定大豆抗花叶病毒(SC-3株系)性状的方法。本发明所提供的一种鉴定或辅助鉴定大豆抗花叶病毒性状的方法，包括如下步骤:分别以待鉴定大豆的基因组DNA为模板，用由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的两条单链DNA组成的PCR引物对进行PCR扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所得到的PCR产物，按照下述方法确定所述待鉴定大豆的抗花叶病毒性状:如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为与中豆32的PCR扩增产物大小相同的一个条带，所述待鉴定大豆为抗花叶病毒大豆或为候选抗花叶病毒大豆，如果所述PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为与中豆29的PCR扩增产物大小相同的一个条带，所述待鉴定大豆为非抗花叶病毒大豆或为候选非抗花叶病毒大豆；所述待鉴定大ii选自中ii 29 X中ii 32的杂种后代中的F7及其以后世代的豕系。其中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳中，所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度(凝胶溶液中单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺的总质量浓度)可为60g/L，所述聚丙烯酰胺凝胶的交联度(凝胶溶液中甲叉双丙烯酰胺占丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的质量分数)可为5%。上述方法中，所述PCR扩增中先进行10个第一个循环后再进行25个第二个循环，所述第一个循环的引物退火条件为60°C 30s，所述第二个循环的引物退火条件为55°C30s。其中，所述第一个循环的温度程序是:先94°C 30s，然后60°C 30s，最后72°CImin ;所述第二个循环的温度程序是:先94°C 30s,然后55°C 30s,最后72°C lmin。上述方法中，所述待鉴定大豆具体选自中豆29 X中豆32的杂种后代中的F7至F11豕系。在本发明的个实施例中，所述待鉴定大ii具体选自中ii 29 X中ii 32的杂种后代中的F11的家系。
上述方法中，所述抗花叶病毒大豆是指花叶病毒病的病情指数< 30的大豆品种或品系；所述非抗花叶病毒大豆是指花叶病毒病的病情指数> 30的大豆品种或品系。上述方法中，在中豆29X中豆32这个杂交组合中，中豆29为母本，中豆32为父本。上述方法可用于大豆育种、大豆抗花叶病毒SC-3株系的早期预测和筛选抗花叶
病毒大豆。在大豆育种中，可选择上述方法鉴定出的抗花叶病毒大豆或候选抗花叶病毒大豆进行育种。本发明所要解决的另一个技术问题是提供鉴定或辅助鉴定大豆抗花叶病毒性状的引物对。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定大豆抗花叶病毒性状的引物对，名称为GmSSRl3-23，由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的两条单链DNA组成。其中，SEQ ID N0.1由20个脱氧核苷酸组成，SEQ ID N0.2由20个脱氧核苷酸组成。含有上述引物对GmSSR13_23的鉴定或辅助鉴定大豆抗花叶病毒性状的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。上述引物对GmSSR13-23、含有上述引物对GmSSR13-23的试剂或试剂盒的下述a)、
b)或c)用途也属于本发明的保护范围:a)在大豆育种中的应用；b)在大豆抗花叶病毒的早期预测中的应用；c)在筛选抗花叶病毒大豆中的应用。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种大豆抗花叶病毒主效基因位点。本发明所提供的大豆抗花叶病毒主效基因位点是qRSC.13_1，该主效基因位点的贡献率(32.4%)超过已往的报导，对大豆抗花叶病毒起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择。上文中，花叶病毒具体为花叶病毒SC-3株系。本发明的引物对GmSSR13_23，是与主效基因位点qRSC.13-1紧密连锁的标记，与qRSC.13-1相距0.8cM,是基于PCR技术的共显性SSR标记，因而可靠且使用方便。实验证明，利用引物对GmSSR13_23对大豆育种群体进行辅助选择得到了花叶病毒病的病情指数低于30的抗花叶病毒家系，这表明引物对GmSSR13-23用于大豆抗花叶病毒育种的分子标记辅助选择是切实有效的。
本发明通过对大豆抗花叶病毒的QTL定位，首次精细定位了抗花叶病毒主效基因位点qRSC.13-1并获得了与其紧密连锁的分子标记GmSSR13_23，该大豆抗花叶病毒主效基因位点qRSC.13-1，可解释32.4%的表型变异，可用于图位克隆和分子标记辅助选择。在常规育种方法中，大豆对SMV的抗性需人工接种鉴定才能确定，且易受环境，选择效率低下。通过检测抗SMV SC-3株系主效基因位点，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，从而加快育种进程。本发明中抗花叶病毒主效基因位点位置明确，主效基因位点的检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与抗花叶病毒主效基因位点紧密连锁的分子标记，即可预测大豆的抗花叶病毒性状，进而准确快速筛选高抗花叶病毒的材料。本发明通过分子标记GmSSR13-23辅助选择得到的家系的花叶病毒病的病情指数均低于30，利用本发明的GmSSR13-23进行分子标记辅助选择可提高大豆抗花叶病毒育种的选择效率，加快育种进程。
图1为利用GmSSR13-23对1_36的家系的F11代、母本和父本的基因组DNA进行PCR得到的PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中1-36为材料编号，Pl和P2分别代表母本中豆29和父本中豆32。图2为大豆抗SMV SC-3株系病情指数LOD值分布曲线。图中横坐标代表连锁群，纵坐标代表LOD值。箭头所示为抗SMV SC_3株系主效基因位点(qRSC.13-1)曲线。图3为大豆13号染色体对应的F连锁群。左侧为抗SMV SC-3株系主效基因位点(qRSC.13-1)位置及置信区间示意图，右侧为标记名称及遗传距离(CM)。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。大豆中豆29和中豆32 (周新安等，大豆重组自交系群体三、四粒荚变异及其与产量的关系，中国油料作物学报，2005，27:22-25)公众可从商业途径获得，也可从中国农业科学院油料作物研究所获得，以重复本发明实验。花叶病毒SC-3株系(战勇等，黄淮地区大S 花叶病毒株系的鉴定与分布，中国农业科学，2006，39 =2009-2015)公众可从田间采集大豆叶片分离，也可从中国农业科学院油料作物研究所获得，以重复本发明实验。在以下的实施方案中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京:科学出版社，2002)所提供的方法进行。实施例1、利用引物对GmSSR13-23鉴定中豆29X中豆32的F11家系的抗花叶病毒性状一、鉴定或辅助鉴定大豆抗花叶病毒性状的PCR试剂本实施例的鉴定或辅助鉴定大豆抗花叶病毒性状的PCR试剂由PCR引物对GmSSR13_23、10XTaq缓冲液，dNTP混合物，MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶和ddH20组成。其中，PCR引物对GmSSRl3-23由正向引物和反向引物这两条单链DNA组成，其序列如下:正向引物:5，-CAGCCAATAGCAACAAAGGG-3，(SEQID N0.1),反向引物:5，-GCCTTGCTTGCTCATCAAAT-3，(SEQID N0.2)。二、待鉴定大豆中豆29 X中豆32的F11家系是按照如下方法获得:中豆29和中豆32杂交，杂交后代连续自交，在F3即分株行种植，以后各世代均从每一个株行中随机选择一个单株，衍生出下一世代。自F7世代同一个家系内随机选择5个单株，种子混合，不同家系分别种植，获得由406个F11株系组成的重组自交系群体。其中，从F2至F11的杂交方式均为自交。三、田间实验和利用引物对GmSSR13_23鉴定待鉴定大豆的抗花叶病毒性状(一)随机区组实验测定花叶病毒抗性从步骤二的406个家系中随机选36个家系的F11家系，即编号为1_36的大豆材料种植以测定每个家系对花叶病毒SC-3株系的抗性。试验采用随机区组设计，共设三个重复区。每个重复区设38个小区，36个家系中每个家系I个小区，母本中豆29 (Pl) I个小区,父本中豆32 (P2)l个小区。所有试验材料种植于中国农业科学院油料作物研究所试验农场。每个小区种植3行，行长3.5m，行距为
0.4m，株距为0.lm。在第一片真叶展开时人工磨擦接种鉴定(智海剑等，2002-2004年国家大豆区试品种对大豆花叶病毒抗性的评价.大豆科学，2005，24:190-193)，方法如下:(I)供试花叶病毒SC-3株系在感病品种大豆南农1138-2上繁殖保存。(2)群体及亲本材料播种后在未出苗之前盖好防虫网。在第一对真叶展开时，取南农1138-2上具有典型花叶病毒症状的新鲜病叶加0.1M、PH7.5的磷酸缓冲液(约Ig新鲜叶片加5ml缓冲液)和适量600目金刚砂，在搅拌机中打成匀浆，用毛刷蘸匀浆均匀摩擦接种于供试材料真叶上，接种后用清水冲洗叶片上多余的汁液。待第一片复叶展开时重复接种I次。(3)接种30天症状稳定时调查发病情况，并计算发病率、病情指数。(4)磷酸缓冲液的配制。称取 Na2HPO4.12H20 71.6g,KH2PO4.12H20 6.8g，加纯净水2400ml，搅拌使其充分溶解，调pH到7 .5，定容到2500ml。置于4°C冰箱中备用。(5)大豆接种SMV的鉴定方法。亲本及各家系的调查包括症状类型、病级，并计算病情指数。病级是株系症状的严重度分级，参照智海剑等(2005)的方法调查单株病级，具体的分级标准是:花叶型:0级:免疫、无症状或仅在接种叶上出现局部枯斑；1级:轻花叶；2级:黄斑花叶、叶片轻度皱缩；3级:重花叶、叶片皱缩卷曲；4级:叶片严重皱缩且植株矮化。坏死型:0级:免疫、无症状或仅在接种叶上有局部枯斑；1级:部分叶片上出现可见微小坏死斑；2级:多数坏死斑直径在5mm以下或有部分叶脉坏死，其长度小于IOmm ；3级:坏死斑连片或主脉坏死长度大于20mm ；4级:叶片因坏死脱落，或坏死面积超过叶片面积50%，或出现顶枯，植株停止生长。如在同一植株上同时出现花叶、坏死二种症状，病级取级别高者。病情指数(DI) =Σ(病级X发病株数)/(最高病级X总株数)X 100。(6)大豆对SMV抗感的划分标准:病情指数小于等于30为抗花叶病毒大豆；花叶病毒病的病情指数大于30为非抗花叶病毒大豆。结果如表2 所示，表明家系 2、3、5、9、10、11、13、18、20、21、23、25、26、29、30、31、33
这17个家系以及中豆32的花叶病毒病的病情指数均小于30，是抗花叶病毒大豆；家系1、
4、6、7、8、12、14、15、16、17、19、22、24、27、28、32、34、35、36 这 19 个家系以及中豆 29 的花叶病毒病的病情指数均大于30，是非抗花叶病毒大豆。(二)利用引物对GmSSR13_23测定大豆的抗花叶病毒性状在步骤(一)编号为1-36的家系的F11代、母本中豆29 (Pl)和父本中豆32的3叶期分别采集大豆叶片提取其基因组DNA，利用引物对GmSSR13-23进行PCR扩增，对得到的PCR扩增产物进行60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度为5%)电泳，检测电泳条带大小。其中，编号为1-36的家系每个家系采集5个植株的叶片等质量混合后提取基因组DNA，母本采集10个植株的叶片等质量混合后提取基因组DNA，父本采集10个植株的叶片等质量混合后提取基因组DNA。具体的实验方法如下:1、用 CTAB 法(Keim P.A rapid protocol for isolating soybean DNA.Soybeangenet newslett, 1988, 15:147-148)提取叶片基因组 DNA(I)取0.5g新鲜叶片放入1.5ml离心管中，用玻璃棒磨为匀浆，加入700 yl经65°C预热30min的CTAB溶液和20 yl P -巯基乙醇摇匀，放入65°C的水浴锅中水浴30min。(2)取出离心管，加入700 U I氯仿-异戊醇(24:l/v:v)轻摇几次，静置30min后12000rpm,离心 lOmin。(3)吸取上清液，加入2倍体积的冰冻无水乙醇，置于_20°C冰箱30min。12000rpm离心10分钟让DNA沉淀，倒掉离心管中乙醇溶液。(4)用75%(V/V)乙醇清洗2_3次，倒乙醇溶液，打开离心管盖置于通风橱内吹干。(5)加入200 U I双蒸水溶解DNA，用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于_20°C冰箱中保存备用。2、分别以步骤I提取的中豆29 X中豆32的的F11代家系1_36的基因组DNA为模板，利用引物对GmSSR13-23进行PCR扩增，反应体系如表1:表1.
权利要求
1.鉴定或辅助鉴定大豆抗花叶病毒性状的方法，包括如下步骤:分别以待鉴定大豆的基因组DNA为模板，用由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的两条单链DNA组成的PCR引物对进行PCR扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所得到的PCR产物，按照下述方法确定所述待鉴定大豆的抗花叶病毒性状: 如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为与中豆32的PCR扩增产物大小相同的条带，所述待鉴定大豆为抗花叶病毒大豆或为候选抗花叶病毒大豆，如果所述PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为与中豆29的PCR扩增产物大小相同的条带，所述待鉴定大豆为非抗花叶病毒大豆或为候选非抗花叶病毒大豆； 所述待鉴定大ii选自中ii 29 X中ii 32的杂种后代中的F7及其以后世代的豕系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述聚丙烯酰胺凝胶电泳中，所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度为60g/L，所述聚丙烯酰胺凝胶的交联度为5%。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述PCR扩增中先进行10个第一个循环后再进行25个第二个循环，所述第一个循环的引物退火条件为60°C 30s，所述第二个循环的引物退火条件为55°C 30s。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述第一个循环的温度程序是:先94°C30s，然后60°C 30s，最后72°C Imin ;所述第二个循环的温度程序是:先94°C 30s，然后55°C 30s，最后 72°C Imin。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述待鉴定大豆选自中豆29X中豆32的杂种后代中的F7至F11家系。
6.权利要求1-5中任一所述的方法的用途，所述用途为1)、2)或3): 1)权利要求1-5中任一所述的方法在 大豆育种中的应用； 2)权利要求1-5中任一所述的方法在大豆抗花叶病毒性状的早期预测中的应用； 3)权利要求1-5中任一所述的方法在筛选抗花叶病毒大豆中的应用。
7.鉴定或辅助鉴定大豆抗花叶病毒性状的引物对，名称为GmSSR13-23，由SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示的两条单链DNA组成。
8.含有权利要求7所述的引物对的鉴定或辅助鉴定大豆抗花叶病毒性状的试剂或试剂盒。
9.权利要求7所述的引物对、权利要求8所述的试剂或试剂盒的用途，所述用途为a)、b)或 c): a)权利要求7所述的引物对、权利要求8所述的试剂或试剂盒在大豆育种中的应用； b)权利要求7所述的引物对、权利要求8所述的试剂或试剂盒在大豆抗花叶病毒性状的早期预测中的应用； c)权利要求7所述的引物对、权利要求8所述的试剂或试剂盒在筛选抗花叶病毒大豆中的应用。
10.一种大豆抗花叶病毒主效基因位点，其特征在于:所述主效基因位点为qRSC.13-1。
全文摘要
本发明公开了一种大豆抗花叶病毒主效基因位点及应用。该大豆抗花叶病毒主效基因位点及其在分子标记辅助选择育种中的应用。该抗花叶病毒主效基因位点为qRSC.13-1,贡献率为32.4%。与抗花叶病毒主效基因位点紧密连锁的分子标记为GmSSR13-23。利用紧密连锁的分子标记检测育种群体家系是否含有该主效基因位点，可预测其抗花叶病毒性，大大提高了大豆抗花叶病毒育种的选择效率。
文档编号C12N15/11GK103114145SQ20131005381
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月20日 优先权日2013年2月20日
发明者陈海峰, 沙爱华, 单志慧, 杨中路, 张晓娟, 张婵娟, 陈李淼, 陈水莲, 邱德珍, 周蓉, 吴学军, 周新安 申请人:中国农业科学院油料作物研究所