专利名称：修复重金属污染土壤的生物制剂及土壤修复方法
技术领域：
本发明涉及修复重金属污染土壤的技术领域，具体的说是一种修复重金属污染土壤的生物制剂及土壤修复方法。
背景技术：
土壤是地球表面具有肥力，能生长植物的疏松表层，是人类赖以生存发展的基础，也是人类社会最基本、最重要、不可替代的自然资源。随着人类工业化进程的加快，土壤重金属污染已成为影响人类生存的重大环境问题，并产生许多世界著名的环境公害事件，如日本的骨痛病源于土壤镉污染。因此，土壤重金属污染修复已成为世界各国环境保护的研究热点。重金属作为一类特殊的污染物，具有显著的不同于其他污染物(无机离子或有机污染物)的特点。首先，重金属在环境中不会被降解，只会发生形态和价态的变化。同时，重金属在土壤环境中的迁移能力很差，也不能为土壤生物分解，相反可在土壤和生物体内富集。因此，重金属可以在环境中长期存在。其次，一些重金属是生物生长发育所必需的营养元素，如铜、铬等，这些重金属具有很强的生物富集效应。只有超过一定浓度时，它们才可以被称作污染物，产生更高的生物累积，并对生物的生长发育产生毒副作用。第三，一旦重金属离子通过各种途径进入土壤，就会通过吸附、沉淀、络合、氧化还原、酸碱反应等过程产生价态和形态的变化，而不同价态和形态的金属，其活性、迁移性、生物毒性是不同的。第四，重金属在进入生物体内后，不易被排出，在食物链中的生物放大作用十分明显，在较高营养级的生物体内可以成千上万倍的富集起来。还可通过食物链进入人体，在某些器官中富集造成慢性中毒，影响人体健康。现有技术中治理重金属 污染的方法一般分为物理方法、化学方法、生物方法。物理、化学方法一般仅适于浓度较高重金属离子废水的处理，对重金属离子浓度较低的废水，处理效果较差且成本较高。近年来用微生物制剂处理受重金属污染的土壤成为研究的热点。目前有关生物吸附重金离子的研究报道有节杆菌属、芽孢杆菌属、丝核菌属、壤霉菌属、酵母属等。而在实际应用中，用生物发处理废水中重金属的报道较多，土壤中具体应用的报道较少。现有的生物法修复受重金属污染的土壤中存在诸多的缺点，导致修复的效果不理想。首先，现有的生物法修复中所投加的功能微生物对环境的要求较高，特别是许多好氧微生物在土壤深层的厌氧环境下难以发挥有效作用；另外，投加的功能微生物对重金属的针对性较强，一种微生物只能修复一种或几种重金属的污染，对于受污染重金属种类较多的复合型污染不能彻底修复；第三，功能微生物对重金属的耐受力较低，对于重金属污染浓度较高的土壤也无能为力。因此，开发一种对环境的适应性强，耐受力高、修复范围广、使用方便、效果好的生物修复剂就成为重金属污染土壤生物修复的关键。光合细菌可以通过表面静电吸附、离子交换、表面络合等作用吸附重金属；也可以通过胞外金属沉淀物、金属价态转移、胞内积累、金属硫蛋白(MT)与金属离子螯合等作用使重金属形态改变从而降低毒性；另外，光合细菌在自然界广泛存在，适应性强，特别是是光合细菌中的紫色非硫细菌，不仅能在厌氧光照的条件下，利用光能把有机物作为供氢体固定二氧化碳进行光能异养生长，而且能在有氧的黑暗条件下，以上述有机物为呼吸基质，进行好气异养生长，即具有随着生存环境而灵活地改变代谢类型的特性，这就为光合细菌原位修复重金属污染土壤提供了理论基础。经文献与专利检索，未发现利用光合细菌制备生物制剂，并应用于土壤重金属污染修复的报道。
发明内容
本发明的目的是针对以上所述现有技术存在的不足，提供一种修复重金属污染土壤的生物制剂。
本发明的另一目的是提供一种使用生物制剂修复重金属污染土壤的方法。为了达到上述目的，本发明的技术方案是:修复重金属污染土壤的生物制剂，其包括光合细菌中红假单胞菌属的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)和红细菌属的类球红细菌(Rhodobactei sphaeroides),其中，所述沼泽红假单胞菌和类球红细菌两种菌的总数量超过30亿个/毫升。所述沼泽红假单胞菌可以是沼泽红假单胞菌ATCC17001菌株、N菌株和/或37号菌株。所述红细菌属的类球红细菌可以是类球红细菌ATCC17023菌株、T2菌株和/或55号菌株。可以在山西大学光合细菌研究室或者美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection)引进。其中，所述沼泽红假单胞菌与所述类球红细菌的复配方法如下:将所述沼泽红假单胞菌和类球红细菌经过培养液培养到有效活菌数达到30亿个/毫升时，按照体积比1:2的比例均匀混合。沼泽红假单胞菌中类球红细菌没有其他成分；修复重金属污染土壤的生物制剂的制备方法，生产过程为微生物逐级扩大培养的过程，其包括的具体培养工艺步骤如下:(I)分别取原始菌种；(2) —级菌种培养；(3) 二级菌种培养；(4)种子罐培养；(5)发酵罐培养；(6)(检验合格)无菌灌装。所述一级菌种培养和二级菌种培养采用光照1000-3000LUX、培养温度25_30°C、厌氧培养3-4天；当二级菌种培养的菌种浓度达到I X IO8个/毫升以上时,然后接种下一级培养。所述种子罐培养米取黑暗中好氧发酵的培养方式，培养温度为28_30°C、好氧培养6-8天,其中好氧发酵中的通气比例为1:0.5、搅拌转速120—150转/分(r/min);种子罐培养为进一步扩大培养提供接种源。所述发酵罐培养采取黑暗中好氧发酵的培养方式，培养温度为28_30°C、好氧培养6-8天，当菌种浓度达到5 X IO9个/毫升以上即可无菌灌装。其中好氧发酵中的通气比例为1:0.5、搅拌转速120—150转/分(r/min)，发酵罐培养为产品后续生产应用做培养。所述一级菌种培养、二级菌种培养、种子罐培养和发酵罐培养所用的菌种培养基中溶解有包含以下浓度的组分:碳源l_3g/L、氮源l_3g/L、酵母浸膏l_3g/L、蛋白胨0.02-0.08g/L、磷酸氢二钾 0.2-0.8g/L、硫酸镁 0.01-0.03g/L、氯化钙 0.033-0.152g/L。
另外所述菌种培养基中还包含有微量元素溶液和维生素溶液，其中，微量元素溶液为在 IOOOml 蒸馏水中含有 1.5 2g FeCL2.4Η202，0.2 0.5gCoCL2.6Η20，0.01 0.02gNiCL2.2Η20，0.01 0.02gCaCL2.5Η20，0.07 0.1g MnCL2.4Η20，0.I 0.2g ZnCL2,0.5 0.8g H3BO3,0.02 0.05mgNa2M004.2H20,0.01 0.03g Na2S e03.5H20 ;且 pH 值用 HCL 调节至2-3。所述维生素溶液是1000ml蒸馏水中含有0.01 0.02g生物素，0.03 0.05g烟酰胺，0.02 0.03g对氨基苯甲酸，0.01 0.02g盐酸吡哆醛，0.01 0.028泛酸钙，0.01 0.02g维生素B12和0.05 0.1g·酵母浸粉。使用生物制剂修复重金属污染土壤的方法，将修复重金属污染土壤的生物制剂淋施入污染土壤中，然后等待25-30天通过生物的活动可以有效的减少重金属的污染。使用生物制剂修复重金属污染土壤的方法，其包括具体步骤如下:对于污染土层进行开沟处理，开沟深度为污染土壤层的厚度(特别是污染土层较厚的土壤，为了使修复重金属污染土壤的生物制剂充分同受污染部分土壤接触)，淋施修复重金属污染土壤的生物制剂，使修复重金属污染土壤的生物制剂均匀渗透到受污染的土壤内。根据土壤的受污染程度每亩每次使用6-10公斤修复重金属污染土壤的生物制齐U，且所述修复重金属污染土壤的生物制剂稀释30倍以上后才淋施。淋施方式为间隔7天淋施一次，连续淋施4次。与现有技术相比，本发明的有益效果是:(I)功能微生物(所述沼泽红假单胞菌与所述类球红细菌)对环境的适应性强，能随着生存环境而灵活地改变代谢类型，从而大大增加了本生物制剂的应用范围；(2)功能微生物对重金属的耐受能力高，在重金属重度污染的土壤中仍能保持活性并进行高效修复；(3)功能微生物对重金属的修复机理多样，不仅能对重金属吸附积累，还能够转化重金属的形态，使其从对环境危害大的水溶态变成稳定态；(4)本发明修复重金属污染土壤的生物制剂制备工艺简单、适用范围广、处理成本低、处理时间短、处理彻底、可操作性强且可大范围推广应用。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明进行详细的说明。修复重金属污染土壤的生物制剂，其包括光合细菌中红假单胞菌属的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)和红细菌属的类球红细菌(Rhodobactei sphaeiOides)，其中，所述沼泽红假单胞菌和类球红细菌两种菌的总数量超过30亿个/毫升。其中，所述沼泽红假单胞菌可以是沼泽红假单胞菌ATCC17001菌株、N菌株和/或37号菌株。所述红细菌属的类球红细菌可以是类球红细菌ATCC17023菌株、T2菌株和/或55号菌株。以上菌种为现有菌种,可以i帧山西大学光合细菌研究室或者美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)购买引进。其中,所述沼泽红假单胞菌与所述类球红细菌的复配方法如下:将所述沼泽红假单胞菌和类球红细菌经过培养液培养到有效活菌数达到30亿个/毫升时，按照体积比1:2的比例均匀混合。沼泽红假单胞菌中类球红细菌没有其他成分。
修复重金属污染土壤的生物制剂的制备方法，生产过程为微生物逐级扩大培养的过程，其包括的具体培养工艺步骤如下:(I)分别取原始菌种；(2) —级菌种培养；(3) 二级菌种培养；(4)种子罐培养；(5)发酵罐培养；(6)(检验合格)无菌灌装。其中，所述一级菌种培养和二级菌种培养采用光照1000-3000LUX、培养温度25-30°C、厌氧培养3_4天；当二级菌种培养的菌种浓度达到IX IO8个/毫升以上时,然后接种下一级培养。优选的光照为1500-2000LUX，这样培养效果更佳。所述种子罐培养采取黑暗中好氧发酵的培养方式，培养温度为28-30°C、好氧培养6-8天，其中好氧发酵中的通气比例为1:0.5、搅拌转速120—150转/分(r/min);种子罐培养为进一步扩大培养提供接种源。所述发酵罐培养采取黑暗中好氧发酵的培养方式，培养温度为28-30°C、好氧培养6-8天，当菌种浓度达到5 X IO9个/毫升以上即可无菌灌装。其中好氧发酵中的通气比例为1:0.5、搅拌转速120—150转/分(r/min)，发酵罐培养为产品后续生产应用做培养。
所述一级菌种培养、二级菌种培养、种子罐培养和发酵罐培养所用的菌种培养基中溶解有包含以下浓度的组分:碳源lg/L、氮源lg/L、酵母浸膏lg/L、蛋白胨:0.02g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、硫酸镁0.01g/L、氯化钙0.033g/L。另外所述菌种培养基中还包含有微量元素溶液和维生素溶液，其中，微量元素溶液为在IOOOml蒸馏水中含有1.5g FeCL2.4Η202，0.2g CoCL2.6Η20，0.0lg NiCL2.2Η20，0.0lgCaCL2.5Η20，0.07g MnCL2.4Η20，0.Ig ZnCL2,0.5g H3BO3, 0.02mg Na2MOO4.2Η20,0.0lg Na2SeO3.5Η20 ;且 pH 值用 HCL 调节至 2。所述维生素溶液是1000ml蒸馏水中含有0.0lg生物素，0.03g烟酰胺，0.02g对氨基苯甲酸，0.0lg盐酸卩比卩多醒，0.0lg泛酸I丐，0.0lg维生素B12,0.05g酵母浸粉。所述一级菌种培养、二级菌种培养、种子罐培养和发酵罐培养所用的菌种培养基中溶解有包含以下浓度的组分:碳源3g/L、氮源3g/L、酵母浸膏3g/L、蛋白胨0.08g/L、磷酸氢二钾0.8g/L、硫酸镁0.03g/L、氯化钙0.152g/L ;另外所述菌种培养基中还包含有微量元素溶液和维生素溶液，其中，微量元素溶液为在IOOOml蒸馏水中含有2g FeCL2.4H202，0.5gCoCL2.6Η20，0.02g NiCL2.2Η20，0.02gCaCL2.5Η20，0.Ig MnCL2.4Η20，0.2gZnCL2，0.8gH3BO3,0.05mg Na2MOO4.2H20,0.03g Na2SeO3.5H20 ;且 pH 值用 HCL 调节至 3 ;所述维生素溶液是1000ml蒸馏水中含有0.02g生物素，0.05g烟酰胺，0.03g对氨基苯甲酸，0.02g盐酸吡哆醛，0.02g泛酸钙，0.02g维生素B12,0.1g酵母浸粉。所述一级菌种培养、二级菌种培养、种子罐培养和发酵罐培养所用的菌种培养基中溶解有包含以下浓度的组分:碳源2g/L、氮源2g/L、酵母浸膏2g/L、蛋白胨0.05g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.02g/L、氯化钙0.076g/L。另外所述菌种培养基中还包含有微量元素溶液和维生素溶液，其中，微量元素溶液为在IOOOml蒸馏水中含有1.8g FeCL2.4Η202，0.25gCoCL2.6Η20，0.0lg NiCL2.2Η20，0.0lgCaCL2.5Η20，0.07g MnCL2.4Η20，0.Ig ZnCL2,
0.6g H3BO3,0.03mg Na2MOO4.2Η20，0.02g Na2SeO3.5Η20 ;且 pH 值用 HCL 调节至 2-3。所述维生素溶液是IOOOml蒸馏水中含有0.0lg生物素，0.04g烟酰胺，0.02g对氨基苯甲酸，0.02g盐酸卩比卩多醒,0.0lg泛酸I丐，0.0lg维生素B12,0.1g酵母浸粉。优选的，本发明修复重金属污染土壤的生物制剂，主要是以红假单胞菌属的沼泽红假单胞菌ATCC17001菌株和红细菌属的类球红细菌ATCC17023菌株为功能微生物，另外可以辅佐所述沼泽红假单胞菌可以是沼泽红假单胞菌N菌株和/或37号菌株。所述红细菌属的类球红细菌可以是类球红细菌T2菌株和/或55号菌株。以通过微生物逐级扩大培养生产菌剂，培养工艺如下:分别取原始菌种一一级菌种培养一二级菌种培养一种子罐培养一发酵罐培养一(检验合格)无菌灌装。菌种培养采用光照1000-3000LUX、培养温度25-30°C、厌氧培养3-4天当菌种浓度达到I X IO8个/毫升以上即可接种下一级培养；种子罐和发酵罐培养采取黑暗好氧发酵、培养温度28-30°C、好氧培养6-8天当菌种浓度达到5X IO9个/毫升以上即可灌装。所用菌种培养基为:碳源2g/L、氮源2g/L、酵母浸膏2g/L、蛋白胨
0.05g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.02g/L、氯化钙0.076g/L、微量元素组合、维生素组合；其中微量元素溶液为:将 1.8g FeCL2.4H202，250mg CoCL2.6H20，IOmg Ni CL2.2H20，IOmgCaCL2.5Η20，70mg MnCL2.4Η20，IOOmg ZnCL2, 500mg H3BO3，30mgNa2M004.2Η20，IOmg Na2Se03*5H20溶解1000ml蒸馏水中，溶解的PH值用HCL调节至2—3。维生素溶液是IOOOm I蒸懼水中含有IOmg生物素，35mg烟酰胺，20mg对氨基苯甲酸，IOmg盐酸卩比卩多醒，IOmg泛酸钙，5mg维生素B12，5mg酵母浸粉。使用生物制剂修复重金属污染土壤的方法，将修复重金属污染土壤的生物制剂淋施入污染土壤中，然后等待25-30天通过生物的活动可以有效的减少重金属的污染。优选的使用生物制剂修复重金属污染土壤的方法，其包括具体步骤如下:对于污染土层进行开沟处理，开沟深度为污染土壤层的厚度(特别是污染土层较厚的土壤，为了使修复重金属污染土壤的生物制剂充分同受污染部分土壤接触)，淋施修复重金属污染土壤的生物制剂，使修复重金属污染土壤的生物制剂均匀渗透到受污染的土壤内。根据土壤的受污染程度每亩每次使用6-10公斤修复重金属污染土壤的生物制剂，且所述修复重金属污染土壤的生物制剂稀释30倍以上后才淋施。淋施方式为间隔7天淋施一次，连续淋施4次。用上述方法制备的生物制剂进行土壤重金属的修复试验:实施例1:在广东某受镉污染的土壤中，每亩施用6kg (稀释30倍)专利生物制剂，间隔7天淋施一次，连续使用4次，考察该生物制剂对土壤镉污染的修复效果。结果表明，施用专利菌剂后，该土 壤生长的植株中的镉含量降低60%以上，有效抑制了镉向植株体内的迁移，达到了较满意的修复效果。实施例2:在广东某受铅污染的土壤中，每亩施用8kg (稀释30倍)专利生物制剂，间隔7天淋施一次，连续使用4次，考察该生物制剂对土壤铅污染的修复效果。结果表明，施用专利菌剂后，该土壤中水溶性铅的含量降低80%以上，而稳定态铅含量大大增加，表明该生物制剂可以使铅在土壤中的形态发生变化，将其从危害性高的水溶态转变成对环境危害较小的稳定态，从而达到铅污染土壤的修复。实施例3:在广东某受铜污染的土壤中，每亩施用IOkg (稀释30倍)专利生物制齐U，间隔7天淋施一次，连续使用4次，考察该生物制剂对土壤铜污染的修复效果。结果表明，施用专利菌剂后，该土壤生长的植株生物量增加50%以上，植物吸收的镉含量降低60%以上，有效抑制了镉向植株体内的迁移，对铜的修复同样达到了较满意的效果。所述者，仅为本发明的较佳实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，即大凡依本发明申请专利范围及发明说明内容所作的简单的等效变化与修饰，皆仍属本发明专利涵盖的范围内。
权利要求
1.修复重金属污染土壤的生物制剂，其特征在于，包括光合细菌中红假单胞菌属的沼泽红假单胞菌和红细菌属的类球红细菌，其中，所述沼泽红假单胞菌和类球红细菌两种菌的总数量超过30亿个/毫升。
2.根据权利要求1所述的修复重金属污染土壤的生物制剂，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌是沼泽红假单胞菌ATCC17001菌株、N菌株和/或37号菌株；所述红细菌属的类球红细菌是类球红细菌ATCC17023菌株、T2菌株和/或55号菌株。
3.根据权利要求2所述的修复重金属污染土壤的生物制剂，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌与所述类球红细菌的复配方法如下:将所述沼泽红假单胞菌和类球红细菌经过培养液培养到有效活菌数达到30亿个/毫升时，按照体积比1:2的比例均匀混合。
4.根据权利要求1、2或者3所述的修复重金属污染土壤的生物制剂的制备方法，其特征在于，其包括工艺步骤如下:(I)分别取原始菌种；(2) —级菌种培养；(3) 二级菌种培养；(4)种子罐培养；(5)发酵罐培养；(6)无菌灌装。
5.根据权利要求4所述的修复重金属污染土壤的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述一级菌种培养和二级菌种培养采用光照1000-3000LUX、培养温度25-30°C、厌氧培养3-4天；当二级菌种培养 的菌种浓度达到IXlO8个/毫升以上时，然后接种下一级培养。
6.根据权利要求4所述的修复重金属污染土壤的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述种子罐培养采取黑暗中好氧发酵的培养方式，培养温度为28-30°C、好氧培养6-8天，其中好氧发酵中的通气比例为1:0.5、搅拌转速120-150转/分； 所述发酵罐培养米取黑暗中好氧发酵的培养方式，培养温度为28-30°C、好氧培养6-8天，当菌种浓度达到5X IO9个/毫升以上即可无菌灌装，其中好氧发酵中的通气比例为1:0.5、搅拌转速120-150转/分。
7.根据权利要求6所述的修复重金属污染土壤的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述一级菌种培养、二级菌种培养、种子罐培养和发酵罐培养所用的菌种培养基中溶解有包含以下浓度的组分:碳源:l_3g/L、氮源:l-3g/L、酵母浸膏:l_3g/L、蛋白胨:0.02-0.08g/L、磷酸氢二钾:0.2-0.8g/L、硫酸镁:0.01-0.03g/L、氯化钙:0.033-0.152g/L0
8.根据权利要求7所述的修复重金属污染土壤的生物制剂的制备方法，其特征在于，另外所述菌种培养基中还包含有微量元素溶液和维生素溶液，其中，微量元素溶液为在 IOOOml 蒸馏水中含有 1.5 2g FeCL2.4Η202，0.2 0.5g CoCL2.6Η20，0.01 0.02gNiCL2.2Η20，0.01 0.02gCaCL2.5Η20，0.07 0.1g MnCL2.4Η20，0.I 0.2g ZnCL2,0.5 0.8g H3BO3,0.02 0.05mgNa2M004.2Η20，0.01 0.03g Na2SeO3.5Η20 ;且卩11 值用 HCL 调节至2-3 ;所述维生素溶液是IOOOml蒸馏水中含有0.01 0.02g生物素，0.03 0.05g烟酰胺，0.02 0.03g对氨基苯甲酸，0.01 0.02g盐酸吡哆醛，0.01 0.028泛酸钙，0.01 0.02g维生素B12和0.05 0.1g酵母浸粉。
9.使用根据权利要求1-8所述的修复重金属污染土壤的生物制剂修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，将修复重金属污染土壤的生物制剂淋施入污染土壤中，然后等待25-30天通过生物的活动减少重金属的污染。
10.根据权利要求9所述的使用修复重金属污染土壤的生物制剂修复重金属污染土壤的方法，其特征在于:其包括具体步骤如下:对于污染土层进行开沟处理，开沟深度为污染土壤层的厚度，淋施修复重金属污染土壤的生物制剂，使修复重金属污染土壤的生物制剂均匀渗透到受污染的土壤内；每亩每次使用6-10公斤修复重金属污染土壤的生物制剂，且所述修复重金属污染土壤的生物制剂稀释30倍以上后才淋施；淋施方式为间隔7天淋施一次， 连续淋施4次。
全文摘要
本发明公开一种修复重金属污染土壤的生物制剂，其包括光合细菌中红假单胞菌属的沼泽红假单胞菌ATCC17001菌株、N菌株和37号菌株，红细菌属的类球红细菌ATCC17023菌株、T2菌株和55号菌株。修复重金属污染土壤的生物制剂的制备方法，生产过程为微生物逐级扩大培养的过程。本发明的有益效果是功能微生物对重金属的耐受能力高，在重金属重度污染的土壤中仍能保持活性并进行高效修复；不仅能对重金属吸附积累，还能够转化重金属的形态，使其从对环境危害大的水溶态变成稳定态；该生物制剂制备简单、适用范围广、处理成本低、处理时间短，处理彻底、可操作性强，可大范围推广应用。
文档编号C12N1/20GK103114039SQ201310057558
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者曹新现, 吴坚伟 申请人:广州天壤生物科技有限公司