专利名称：一种耐热酸性普鲁兰酶生产菌株及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种普鲁兰酶生产菌株及其应用，特别是一株产耐热酸性普鲁兰酶的芽胞杆菌及其应用。
背景技术：
淀粉脱支酶(E.C.3.2.1.41)是一类能够水解支链淀粉、α _极限糊精等分子中α -1, 6葡萄糖苷键的淀粉水解酶。淀粉脱支酶通常和其它淀粉酶复配用于生产葡萄糖、果糖、麦芽糖、麦芽糊精、低聚糖等产品。淀粉脱支酶可以切断淀粉中的分支点，加速后续酶的反应，缩短反应时间，提高淀粉的转化率，降低其它糖化用酶制剂的使用量，从而达到增加产量、提高设备利用率、降低生产成本的目的。近年来国内外学者把淀粉脱支酶的开发研究作为非常重要的研究主题。BunzoMikami等对来源于Klebsiella pneumoniae的淀粉脱支酶蛋白晶体结构进行解析,发现该酶具有GH13淀粉水解酶家族共有的(β/α)8桶状结构。近年来国外学者从极端嗜热微生物中分离出具有可以耐受接近100°C高温的淀粉脱支酶，但是这些酶往往只有在ρΗ6.0以上才具有较高的活性。我国对淀粉脱支酶的研究虽晚于国外，但也有30多年的历史。早期工作主要围绕菌株的筛选。·至上世纪90年代，我国市场上开始出售进口淀粉脱支酶，继而引发了对淀粉脱支酶在淀粉加工中的应用研究，并逐步推广到淀粉糖、酿造及其它发酵行业，带动了相关产业的技术提升。至2000年前后随着我国淀粉加工行业的快速发展，对淀粉脱支酶的需求激增，淀粉脱支酶生产菌株的开发逐渐升温。目前，我国科研人员先后在Bacillus、Thermotoga等微生物中筛选到一些性能优良的酶种，并开展了野生菌的诱变育种、酶的重组表达及发酵条件优化。朱梦等从海洋中分离出一株产普鲁兰酶不动杆菌，通过产酶条件优化，酶活达到2.3U/mL,该酶最适反应温度和pH分别为50°C和8.2。张明炎等将来源于地衣芽孢杆菌的淀粉脱支酶编码基因克隆大肠杆菌中进行表达，摇瓶发酵产酶最高达到6.5U/mL。苏喆等实现了来源于Thermotoga maritima的淀粉脱支酶编码基因在枯草芽孢杆菌中的成功表达,该酶最适温度90°C，最适pH6.0，发酵酶活可达89.lU/mL。综上所述，除了少数报道外，大多数微生物来源的普鲁兰酶在低pH、高温条件下的酶活力水平一般不高。然而，淀粉加工过程通常在酸性高温条件下进行，因此有必要筛选产新的耐热酸性普鲁兰酶的生产菌株，以提高其在淀粉加工中应用效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种耐热酸性普鲁兰酶生产菌株，于2013年I月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号CCTCC N0:M2013012，系从面粉厂土壤中分离得到的一株芽胞杆菌 WSH10-03 (Bacillus.Sp WSH10-03)。芽胞杆菌的筛选方法是从面粉厂土壤中经红色普鲁兰平板筛选，挑取产生透明圈菌落进行摇瓶培养，经酶活测定，比较普鲁兰酶活力大小而得到。
酶活力测定方法:分别取Iml的底物(0.5%普鲁兰溶液)和0.9ml0.1M pH4.5的醋酸缓冲液于试管中，60°C水浴锅预热IOmin左右。加入0.1ml适当稀释的酶液样品，震荡混匀，反应体系总体积为2ml，反应30min (准确计时)，加入3ml DNS混匀、并立刻放入冰水中终止反应,之后沸水浴7min，冰水中冷却。上述反应体系中加入IOml的蒸馏水，混匀。在540nm下测量其吸光值。本发明解决的另一个技术问题是提供一种采用芽胞杆菌WSH10-03为出发菌株，经种子培养和摇瓶发酵制得普鲁兰酶。种子培养基(g/L)及培养条件:蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，pH5.0 ;培养条件为:摇床转速200转/分，培养时间为10小时，培养温度37°C。 发酵培养基(g/L)及发酵条件:发酵培养基成分为(g/L):氯化铵1，十二水磷酸氢二钠2.7，磷酸二氢钾0.3，蛋白胨10，酵母粉3，七水硫酸镁0.3，无水氯化钙0.2，可溶性淀粉10，pH5.0。发酵条件为:37°C，摇床转速200转/分，发酵时间56小时。本发明提供了一种耐热酸性普鲁兰酶生产菌，用该菌株经摇瓶发酵可制备普鲁兰酶，该酶的最适温度55°C,最适pH4.2。
具体实施例方式实施案例I菌株的筛选从3家面粉厂附近分别采集土样5份，共15份样品。分别称取少量样品，放入烘箱60°C热处理30min，然后·称取样品Ig加入装有50mL无菌水的小三角瓶中，静置20min，取0.1mL上清液梯度稀释(10_4，10_5，10_6)涂布于红色普鲁兰筛选平板上，37°C培养箱中培养2天，观察菌落周围透明圈形成情况，挑选透明圈直径与菌落直径之比较大的单菌落进行初筛。首先，将上述单菌落进行平板划线分类纯化，并接种斜面保存备用。然后接种到发酵培养基中进行液体振荡培养。培养温度为37°C，摇床转速为200rpm，培养时间为56h。培养液经过12000rpm离心5min，收集上清液，在酸性条件下进行酶活测定。选取酶活高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高酶活的普鲁兰酶产生菌株。纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，4°C保藏，于2013年I月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号CCTCC N0:M2013012，系从面粉厂土壤中分离得到的一株芽胞杆菌 WSH10-03 (Bacillus.Sp WSH10-03)。红色普鲁兰筛选平板成分(g/L):氯化铵I，十二水磷酸氢二钠2.7，磷酸二氢钾0.3，酵母粉3，蛋白胨10，六水氯化镁0.2，红色普鲁兰2，琼脂粉20，pH5.0,培养温度为
37。。。发酵培养基成分为(g/L):氯化铵1，十二水磷酸氢二钠2.7，磷酸二氢钾0.3，蛋白胨10，酵母粉3，七水硫酸镁0.3，无水氯化钙0.2，可溶性淀粉10，PH5.0。发酵条件为:37°C，摇床转速200转/分，发酵时间56小时。实施案例2发酵产酶从斜面上刮取一环菌种，置于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在37°C，200rpm条件下振荡培养10h。以2.5%接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中进行发酵培养。条件为培养时间56h，温度37°C，摇床转速200rpm。经过活力测定，胞外酶活为 21.7U/mL。种子培养基(g/L)及培养条件:蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，pH5.0 ;培养条件为:摇床转速200转/分，培养时间为10小时，培养温度37°C。发酵培养基成分为(g/L):氯化铵1，十二水磷酸氢二钠2.7，磷酸二氢钾0.3，蛋白胨10，酵母粉3，七水硫酸镁0.3，无水氯化钙0.2，可溶性淀粉10，pH5.0。发酵条件为:37°C，摇床转速200转/分，发酵时间56小时。实施例3:普鲁兰酶的纯化和酶学性质将发酵上清液于4°C, 12000rpm离心5min除去细胞。向上清液中加入70%固体硫酸铵盐析过夜，4°C, 12000rpm离心20min,取沉淀物用适量pH4.5, 20mM磷酸-朽1檬酸缓冲液溶解，通过0.4 μ m膜过滤后制成上样样品。经过DEAE-Sepharose阴离子交换树脂纯化后得到电泳纯的普鲁兰酶。将纯化普鲁兰酶以普鲁兰多糖多糖为底物进行酶学性质测定。结果表明改普鲁兰酶的最适温度为55°C ,最适pH4.2,在60°C条件下半衰期可达20h。
权利要求
1.一种耐热酸性普鲁兰酶生产菌株，分类命名为芽胞杆菌(Bacillus. Sp)WSH10-03，于2013年I月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号CCTCC N0:M2013012。
2.一种筛选权利要求I所述普鲁兰酶生产菌株的方法，其特征是从面粉厂土壤中经红色普鲁兰平板菌落特征初筛，挑取其中透明圈较大的菌株进行摇瓶发酵，测定胞外普鲁兰酶活力，根据发酵产酶活力的大小而筛选得到普鲁兰酶生产菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述红色普鲁兰筛选平板成分为(g/L):氯化铵1，十二水磷酸氢二钠2. 7,磷酸二氢钾O. 3,酵母粉3,蛋白胨10,六水氯化镁O. 2,红色普鲁兰2，琼脂粉20，pH5. O。
4.应用权利要求I所述普鲁兰酶生产菌株生产普鲁兰酶的方法，其特征是采用芽胞杆菌WSH10-03为出发菌株，经种子培养和摇瓶发酵制得普鲁兰酶；所述种子培养条件为37°C，摇床转速200转/分，培养时间为10小时；所述摇瓶发酵条件为37°C，摇床转速200转/分，发酵时间56小时。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是所述种子培养中，种子培养基成分为(g/L)蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，pH5. O。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征是所述摇瓶发酵中，发酵培养基成分为(g/L)氯化铵I，十二水磷酸氢二钠2. 7，磷酸二氢钾O. 3，蛋白胨10，酵母粉3，七水硫酸镁O. 3，无水氯化钙O. 2，可溶性淀粉10，pH5. O。
7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于所述芽胞杆菌WSH10-03在发酵工业和淀粉糖生产中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种耐热酸性普鲁兰酶生产菌株，分类命名为芽胞杆菌(Bacillus.Sp)WSH10-03，于2013年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号CCTCC NO:M2013012。是从面粉厂土壤中经过在红色普鲁兰平板上具有菌落透明圈初筛，采用摇瓶复筛，测定酶活力，比较普鲁兰酶活性大小而得到。该酶的酶学性质为最适温度55℃，最适pH4.2，该酶的在60℃半衰期为20小时。该普鲁兰酶可以用于发酵工业和淀粉糖生产中淀粉中分支链的脱支反应。
文档编号C12N9/44GK103255079SQ20131007933
公开日2013年8月21日 申请日期2013年3月13日 优先权日2013年3月13日
发明者吴敬, 段绪果, 吴丹, 陈晟, 陈坚 申请人:江南大学