专利名称：一种多靶点基因检测甲型h1n1流感病毒变异株的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒检验检测领域，具体涉及针对M基因和HA基因检测甲型HlNl流感病毒变异株的多靶点检测用引物、相应的试剂盒及检测方法。
背景技术：
甲型HlNl流感于2009年4月由墨西哥开始，造成了全球大流行的疫情。序列进化分析显示，该病毒为一个新型甲型流感变异株，与人类季节性HlNl流感病毒和经典HlNl猪流感病毒，存在明显差异。序列分析显示它的8个基因片段具有明显特殊性。但其HA片段与北美猪流感病毒HA片段同源性最高，为95 %左右；NA和M与欧亚猪源病毒片段最为相近，同源性分别为92%和97%。因此在实际的诊断与检测中，采用核酸扩增方法进行鉴别时，必须进行仔细的序列比对分析，才能确保诊断与检测的准确性。
由于PCR检测技术以其灵敏性、特异性、高效性而最为通用，在甲型HlNl流感暴发后国内外很多学者研究建立了荧光RT-PCR检测方法用于检测甲型HlNl流感病毒(2009变异株)流感病毒。但是，荧光RT-PCR检测方法也存在检测中发生假阴性或假阳性的可能。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供了一种可靠的多基因靶点检测甲型HlNl流感病毒变异株的方法和试剂盒。本发明的原理是针对M和HA基因多个基因靶点检测甲型HlNl流感病毒2009变异株，用毛细管电泳荧光探测显示序列片段大小，来直观地确定扩增的每个片段的准确性。为避免人类样品在采集，保存和运输中发生降解人类而引起假阴性结果，试剂盒中针对人类beta-2-miciOglobulin基因设计了引物。同时，多基因靶点层层确认阳性结果，确保了检测结果的特异性。另外。本试剂盒可以检测出非HlNl甲型流感感染，和非甲型流感感染样品，提供了进一步诊断的信息。针对M基因和HA基因，发明人设计和建立了可靠的多基因靶点检测方法。通过仔细的序列比对分析，设计了引物针对以下基因靶点:M基因片段-检测所有甲型流感HA基因片段1-特异性针对甲型HlNl流感病毒(2009变异株)HA基因片段2-检测所有HlNl的流感病毒人类beta-2-microglobulin基因片段-检测样品中人体组织感染甲型HlNl流感病毒(2009变异株)的病人样品，必须能扩增出以上多个片段，并在毛细管电泳中显示正确的序列片段大小。这种检测方法保证了检测结果的特异性，并且使用者能直观地通过扩增的片段大小来查看和确认检测结果。因此，本发明的第一个目的是提供特异性强、灵敏度高的针对M和HA基因检测甲型HlNl流感病毒2009变异株的包含多组引物序列的检测试剂盒。
发明人选择甲型HlNl流感病毒(2009变异株)的M和HA基因核苷酸序列与其他A型流感病毒M和HA基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上进行引物设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50% -60%，引物内无二级结构和重复性，弓丨物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5°C。通过优化选择，最终获得包含如下多组引物的试剂盒:一组针对M基因检测所有甲型流感病毒的引物，其序列如下所示:1)5，-GAA TGG CTA AAG ACA AGA CC-3' (SEQ ID NO:1)2)5，-GCT GCA GTC CTC GCT CAC T-3，(SEQ ID NO:2)其中序列I)和2)分别为检测所有甲型流感病毒M基因的正义引物和反义引物，反义引物的5’端标记报告突光基团FAM(6-carboxy-突光素)；一组针对HA基因检测所有HlNl的流感的引物，其序列如下所示:3)5，-GCA GAT CAA AAG AGC ACA CAA AAT-3' (SEQ ID NO:3)4)5，-CCA AAG TTC TTT CAT TTT CCA AT-3，(SEQ ID NO:4)其中序列3)和4)分别为检测所有HlNl流感病毒HA基因的正义引物和反义引物，反义引物的5’端标记报告突光基团FAM(6-carboxy-突光素)；一组针对HA基因检测甲型HlNl流感病毒2009变异株的引物序列，其序列如下所示:5)5，-CAT TCG CAA TGG AAA GAA A~3' (SEQ ID NO:5)6)5，-TCC TCA ATC CTG TGG CCA G_3，(SEQ ID NO:6)其中序列5)和6)分别为检测甲型HlNl流感病毒(2009变异株)HA基因的正义弓丨物和反义引物，反义引物的5’端标记报告荧光基团FAM(6-carboxy-荧光素)；一组针对人类beta-2-microglobulin基因检测样品中人体组织的引物序列，其序列如下所示:7)5，-CCA GCA GAG AAT GGA AAG T-3' (SEQ ID NO:7)8)5，-GAT GCT GCT TAC ATG TCT CG-3’ (SEQ ID NO:8)其中序列7)和8)分别为检测人类beta-2-microglobulin基因的正义引物和反义引物，反义引物的5’端标记报告突光基团FAM(6-carboxy-突光素)。发明人采用RT-PCR和毛细管电泳检测技术建立了甲型HlNl流感病毒(2009变异株)多基因靶点检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物的筛选，Mg2+使用浓度的优化，引物浓度的优化，得到的多基因靶点检测甲型HlNl流感病毒(2009变异株)试剂盒进一步包括如下组分:(I)、RT-PCR 反应液，包括 1-10XRT 缓冲液、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:7正义引物混合、RT-PCR酶和dNTP;(2)、PCR反应液，包括1-10XPCR缓冲液、MgCl2、SEQ ID NO: 1-8共8种引物混合、Taq DNA聚合酶和dNTP ；(3)、纯水；( 4)、阴性对照:流感病毒阴性样品RNA ；(5)、阳性对照:甲型HlNl流感病毒2009变异株阳性样品RNA。上述试剂盒中，RT-PCR反应液根据需要进行稀释或配置。其中，RT缓冲液反应终浓度为IX;引物反应终浓度为0.05umol/L - 0.5umol/L ;RT_PCR酶反应终浓度为2U-10U(20ul/反应)；dNTP反应终浓度为0.lmmol/L - 0.6mmol/L。一种优选的配方如下所示:表IRT-PCR反应液配方
权利要求
1.一种用于检测甲型HlNl流感病毒变异株的试剂盒，该试剂盒含有如下的多组引物: 一组针对M基因检测所有甲型流感病毒的引物，其序列如下所示:1)5’-GAA TGG CTA AAG ACA AGA CC-3' (SEQ ID NO:1)2)5，-GCTGCA GTC CTC GCT CAC T-3，(SEQ ID NO:2) 其中序列I)和2)分别为检测所有甲型流感病毒M基因的正义引物和反义引物，反义引物的5’端标记报告突光基团FAM(6-carboxy_突光素); 一组针对HA基因检测所有HlNl的流感的引物，其序列如下所示:3)5，-GCAGAT CAA AAG AGC ACA CAA AAT-3' (SEQ ID NO:3)4)5’-CCA AAG TTC TTT CAT TTT CCA AT-3’ (SEQ ID NO:4) 其中序列3)和4)分别为检测所有HlNl流感病毒HA基因的正义引物和反义引物，反义引物的5’端标记报告突光基团FAM(6-carboxy_突光素)； 一组针对HA基因检测甲型HlNl流感病毒2009变异株的引物序列，其序列如下所示:5)5，-CATTCG CAA TGG AAA GAA A~3' (SEQ ID NO:5)6)5，-TCCTCA ATC CTG TGG CCA G_3，(SEQ ID NO:6) 其中序列5)和6)分别为检测甲型HlNl流感病毒(2009变异株)HA基因的正义引物和反义引物，反义引物的5’端标记报告突光基团FAM(6-carboxy-突光素)； 一组针对人类beta-2-microglobulin基因检测样品中人体组织的弓I物序列，其序列如下所示:7)5’-CCA GCA GAG AAT GGA AAG T-3' (SEQ ID NO:7)8)5，-GATGCT GCT TAC ATG TCT CG-3’ (SEQ ID NO:8) 其中序列7)和8)分别为检测人类beta-2-microglobulin基因的正义引物和反义引物，反义引物的5’端标记报告突光基团FAM(6-carboxy-突光素)。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有如下的成分: (1)、RT-PCR反应液，包括 1-10 X RT 缓冲液、SEQ ID NO: 1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7正义引物混合、RT-PCR酶和dNTP; (2)、PCR反应液，包括1-10XPCR缓冲液、MgCl2、SEQID NO: 1-8共8种引物混合、TaqDNA聚合酶和dNTP ； (3)、纯水； (4)、阴性对照:流感病毒阴性样品RNA； (5)、阳性对照:甲型HlNl流感病毒2009变异株阳性样品RNA。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中，RT-PCR反应液中RT缓冲液反应终浓度为IX ;引物反应终浓度为0.05umol/L - 0.5umol/L ；RT-PCR酶反应终浓度为 2U-10U (20ul/ 反应)；dNTP 反应终浓度为 0.lmmol/L - 0.6mmol/L。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中，10XRT缓冲液组成为750mmol/L KCl、30mmol/L MgC12、50mmol/L DTT、500mmol/L Tris-HCl(ρΗ8.3，25°C )。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中，RT-PCR反应液中PCR缓冲液反应终浓度为IX ;MgCl2反应终浓度为1.0mmol/L-3.0mmol/L ;引物反应终浓度为.0.05umol/L - 0.5umol/L ；PCR酶反应终浓度为0.2U-5U (20ul/反应)；dNTP反应终浓度为.0.lmmol/L - 0.Bmmol /I,η
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中，IOXPCR缓冲液的组成为:500mmol/L KClUOOmmol/LTris-HCl (pH9.0,25°C ) ,1.0% Triton X-100。
7.一种利用权利要求1-6任一项所述的试剂盒检测流感病毒的方法，包括如下步骤: (1)、从采集的样品中提取流感病毒RNA ； (2)、利用所述的检测试剂盒对流感病毒RNA进行RT-PCR和PCR扩增；将PCR反应产物进行电泳检测，读取产物样品的片段大小和信号强度； (3)、根据分析条件设定，读取检测结果并进行判定。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(I)中，流感病毒RNA的提取可用Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini试剂盒,或其他相应试剂盒,从采集的样品中提取，在样本处理区进行。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(3)的检测结果按如下方法进行判断:阴性对照，毛细管电泳结果只显示人类beta-2-miciOglobulin基因的扩增片段，表明样品中有人体组织RNA，无甲型HlNl (2009变异株)流感病毒；阳性对照，毛细管电泳结果显示人类beta-2-miciOglobulin基因扩增片段、M基因针对所有甲型流感的扩增片段，HA基因特异性针对甲型HlNl流感病毒(2009变异株)的扩增片段1、HA基因针对所有HlNl流感病毒的扩增片段2;如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。
10.一种制备权利要求1-6任一项所述试剂盒的生产工艺，包括如下步骤: .1、将4组引物合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检； .2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检； .3、将阴性和阳性对照标本制备，分装，抽样质检； .4、组装试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种可靠的多基因靶点检测甲型H1N1流感病毒变异株的方法和试剂盒。本发明设计了多组引物针对多个基因靶点，通过毛细管电泳荧光探测显示PCR序列片段大小，来直观地确定扩增的每个片段的准确性。多基因靶点层层确认阳性结果，确保了检测结果的特异性。另外。本试剂盒可以检测出非H1N1甲型流感感染和非甲型流感感染样品，为进一步诊断提供相关信息。
文档编号C12Q1/68GK103215387SQ201310169249
公开日2013年7月24日 申请日期2013年5月7日 优先权日2013年5月7日
发明者沈洁, 厉力华, 徐铭恩 申请人:杭州电子科技大学