专利名称：用于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.生产淀粉酶的培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及用于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.4j)生产淀粉酶的培养基及其制备方法。
背景技术：
嗜热海洋微生物是来源于地热含油地质层、深海火山泥、深海热液口等特殊环境的一类嗜热微生物资源。嗜热微生物因其对高温独特的适应性而备受人们关注，一般是指最适生长温度大于45°C的一类微生物。作为嗜热微生物，其主要应用之一是嗜热酶的开发应用。嗜热酶因其热稳定性高的优点而备受瞩目，其中最有名的就是Tag酶的发现和开发，使得PCR反应这一革命性的技术发展成为生命科学领域最为重要的技术之一。目前已知的从嗜热菌中分离出来的酶具高热稳定性、传质速率高、耐化学变性剂、易于纯化等特点。深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.4j，是由是由中国海洋第三研究所首次分离得到的、来源于深海、最适生长温度在60°C的一种中度嗜热微生物。由于其来源于深海这一极端环境，对溶氧、高盐、高温、高压等环境条件可能会有特殊的生理相应。在应用方面，Geobacillus sp.4j目前发现能够产生降解淀粉的淀粉酶。该种淀粉酶的活性和热稳定性等有待进一步探索，而能否用于工业化生产一种新型淀粉酶也值得研究。然而,嗜热菌Geobacillus sp.4j在原始培养基中生长淀粉酶的产量很低,成为各项研究的瓶颈，特别在其规模化发酵培养产酶的领域。如果不能提高淀粉酶的产量，就很难进行相应的酶学研究和工业化生产的探索。因此，通过优化其培养环境、改善其发酵工艺成为当务之急。培养基是微生物生长的基质，开发一种用于深海·海洋嗜热细菌Geobacillus sp.4j生产淀粉酶的新型培养基是目前工作的重要基础。
发明内容
本发明的目的在于提供用于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.生产淀粉酶的培养基，其制备方法及应用。在本发明的第一方面，提供一种深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的培养基，所述培养基包括以下组分:可溶性淀粉4-20 g/L;
酵粉2-12 g/L；
硝酸钠2-12 g/L;
汉化钠5-25 g/L;
i:水硫酸镁0」-4g/L;
氯化镤0.1-12 g/L；
鉍化街10.01-2 g/L；
M+化钙0.01-2 g/L;
磷酸氢二钾0.02-2 g/L
硫酸亚铁铵0.001 -0.1 g/L；和
Ilftflii0.000 卜 0.001 g/L O在一个优选例中，所述的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.是Geobacillussp.4 j。在另一优选例中，所述培养基包括以下组分:
溶性淀粉4-15 g/L；
酵叫:粉3-10 g/L；
硝酸钠3-10 g/L；
+ 化钠8-21 g/L；
水硫酸镁0.5-2J g/L；
+ 化铉0.2-10 g/L；
氯化钾0.1-1 g/L + (化钙0.05-1 g/L
!酸氣二卿0.1-1 g/Li
硫酸、IE铁鑛0.005-0.05 g/L! _
+ 化镍0.0003-0.00! g/L ο在另一优选例中，所述培养基包括以下组分:可溶性淀粉6 g/L;
酵付粉8 g/L;
硝酸钠5 g/L;
M化钠12.5 g/L；
无水硫酸钱1.67 g/L;
氯化镁0.32 g/L；
iiC化钾0.33 g/L；
誠化钙Cl6g/L;
磷酸氢二卿0.484 g/L；
硫酸亚铁铵0.01 g/L;和
氣化媒0.0005 g/L；其中，各组分在培养基中的含量可在±10%(更佳地±5%)范围内浮动。在另一优选例中，所述培养基中，还含有有效量(适于细菌生长的量)的微量元
素；较佳地，微量元素含量为:
氨三乙酸0.0128-0.256 g/L;
四水合氣化'IR铁0.001 -0.02 g/L；
四水合氯化猛0.0005-0.01 g/L；
m 水合就化钴0.0003-0.0( g/L ；:水介就化锕0.00005-0.001 g/L;
1.1 酸_0.00005-0,001 g/L；
碉酸().()()002-0.00()4 g/L； fi!
/\.水 fr Ul 化媒0.00002-0.0004 g/L O在另一优选例中，所述培养基中，各组分配制于水(较佳地，所述的水是去离子水)中；和/或所述培养基的pH值6±0.5。在本发明的另一方面，提供前面任一所述的培养基的用途，用于培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.,生产淀粉酶。在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的培养基的方法，所述方法包括: (a)将所述可溶性淀粉进行糊化，冷却；(b)将所述酵母粉、硝酸钠、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵混合；(c)将上述两步骤得到的溶液混合均匀，添加氯化镍溶液以及可选的微量元素；其中，各组分的用量按照前面任一所述。在另一优选例中，在步骤(a)中，所述糊化为用少量水(较佳地为去离子水)将所述可溶性淀粉制成悬浊液，然后缓慢倒入90-10(TC去离子水并不断搅拌，制成半透明状液体。在另一优选例中，步骤(C)之后，进一步包括:将pH调至6±0.5，在121°C灭菌20_30mino在本发明的另一方面，提供一种利用深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.生产淀粉酶的方法，所述方法包括:利用前面任一所述的培养基培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.,从而生产淀粉酶。在一个优选例中，将深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.按体积比1_5%的接种量接种入前面任一所述的培养基，60°C、静置状态下发酵培养72-96h，静置培养过程中每隔12h进行一次振荡处理，将培养菌液混匀；培养72h和96h后，离心分离发酵上清液，其中含有淀粉酶。在另一优选例中，用于接种的种子液的0D_为1.8-2.4，菌落数密度约为2.1Χ106-2.8X106CFU/ml。在本发明的另一方面，提供一种用于培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的试剂盒，所述试剂盒中包括:前面任一所述的培养基。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施例方式本发明人经过长期而深入的研究，研究开发了一种新的适合于培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.4j)使之高效生产淀粉酶的培养基配方。本发明的培养基，适合于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的生长，且可大大地提高淀粉酶的产量。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”;“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。术语“本发明的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的培养基”指含有可溶性淀粉、酵母粉、硝酸钠、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵、氯化镍和可选的微量元素的组合物；或基本上由可溶性淀粉、酵母粉、硝酸钠、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵、氯化镍和可选的微量元素组成的组合物。在组合物中，所述的可溶性淀粉、酵母粉、硝酸钠、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵、氯化镍和可选的微量元素占培养基总重量的80-100%，较佳地占 90-100%，更佳地占 95-100%，如 98%，99%。作为本发明的优选方式，用于配制本发明的深海海洋嗜热细菌Geobacillussp.(更佳地是Geobacillus sp.4j)培养基的各组分的用量如表I所示。
表权利要求
1.一种深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分: 可溶性淀 4-20 g/L； _母 2-12 g/L； Λ酸她2-12 g/L； 氣化钠5-25 g/L; 无水硫酸镁0.1-4 g/L； 氣化镁0.1-12 g/L; 鉍化钾0.01-2 g/L； 氯ftll0.01-2 g/L； 磷酸Μ —:钾0.02-2 g/L; 硫酸亚铁铵0.00〗 -0.1 g/L；和 氯化镍0.0001-0.001 g/L ο
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分: 可溶性淀粉4-15 g/L； 酵母粉3-10 g/L; 硝酸钠3-10 g/Li G(化钠8-21 g/L .尤水硫酸.0.5-2.5 g/L； 氯化钱0.2-10 g/L； ^ 化钾0.1-1 g/L； (,I(化钙0.05-1 g/L； 磷酸W:钾0.1-1 g/L; 硫酸《铁铵0.005-0.05 g/L;和 氯化镍0.0003-0.001 g/Lo
3.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分:可溶ft淀粉6 g/L;酵母粉8 g/L;硝酸钠5 g/L;iC化钠12.5 g/L；尤水硫酸镁1.67 g/L；氯化镁0.32 g/L；氯ft钾0.33 g/L；氯ft#50.6 g/L；鱗酸氢二卿0.484 g/L;硫Pt 德鑛0.01 g/L；和氣化镍0.0005 g/L； 其中，各组分在培养基中的含量可在±10%范围内浮动。
4.如权利要求1-3任一所述的培养基，其特征在于，所述培养基中，还含有有效量的微量元素；较佳地，微量元素含量为:氨二乙酸0.0128-0.256 g/L;水合 St 化 'IR铁0.001 -0.02 g/L；_ 水合 St 化錳0,0005-0.01 g/L;水合 St 化钴0.0003-0.006 g/L；———————:水合 St 化铜0.00005-0.001 g/L；钼酸钠0.00005-0.001 g/L；翻酸0.00002-0.0004 g/L；和六水合 IC化镍0.00002-0.0004 g/Lt!
5.如权利要求1-4任一所述的培养基，其特征在于，所述培养基中，各组分配制于水中；和/或 所述培养基的pH值6±0.5。
6.权利要求1-5任一所述的培养基的用途，用于培养深海海洋嗜热细菌Geobacillussp.，生产淀粉酶。
7.一种制备权利要求1-5任一所述的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的培养基的方法，其特征在于，所述方法包括: (a)将所述可溶性淀粉进行糊化，冷却； (b)将所述酵母粉、硝酸钠、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵混合； (C)将上述两步骤得到的溶液混合均匀，添加氯化镍溶液以及可选的微量元素；其中，各组分的用量按照权利要求1-5任一所述。
8.—种利用深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.生产淀粉酶的方法,其特征在于,所述方法包括:利用权利要求1-5任一所述的培养基培养深海海洋嗜热细菌Geobacillussp.，从而生产淀粉酶。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,将深海海洋嗜热细菌Geobacillussp.按体积比1-5%的接种量接种入权利要求1-5任一所述的培养基，60°C、静置状态下发酵培养72_96h,静置培养过程中每隔12h进行一次振荡处理,将培养菌液混勻；培养72h和96h后，离心分离发酵上清液，其中含有淀粉酶。
10.一种用于培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括:权利要求1-5任一所述的培养基。
全文摘要
本发明涉及用于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.生产淀粉酶的培养基。本发明的培养基，适合于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的生长，且可大大地提高淀粉酶的产量。
文档编号C12R1/01GK103232983SQ201310169378
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月9日 优先权日2013年5月9日
发明者周祥山, 蒋涛, 蔡孟浩, 张元兴 申请人:华东理工大学