专利名称：一种拟盾壳霉菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有抗肿瘤细胞活性及广谱抗菌活性的微生物菌株。
背景技术：
印楝indica A.Juss)属于楝科植物,常绿乔木,广泛种植于热带、亚热带地区，是一种重要的经济树种，具有昆虫拒食和杀虫活性、抑制致病真菌和细菌、消炎、抗肿瘤、免疫调节等多种生理活性。印楝由于其独有的生物特性，在世界各国引起了广泛的关注，印楝生物农药也成为国际商业性开发的热点之一。我国在印楝的种植和农药开发方面相对较晚，本世纪90年代开始引入云南干热河谷地区和湿热地区，试种获得成功并开始印楝农药的研制和利用。我们从生长在云南省元江县的印楝植物中分离获得了内生真菌，并研究了其种类组成和抗菌活性的筛选(邵士成，吴少华等，天rJf产数敕究与方7发，2007，19, 761;邵士成，吳少华等，生物多样性，2008, 16, 63)。印度研究人员曾经从生长在印度的印楝植物中分离和鉴定了内生真菌(Rajagopal K et al, Current Science, 2000, 78, 1375; MaheshB et al, Current Science, 2005, 88, 218; Verma VC et al, Microbial Ecology,2007，54, 119)。拟盾壳霉属iParaconiothyrium')隶属于腔孢纲(Coelomycetes)、球壳孢目(Sphaeropsidales)、球壳抱科(Sphaeropsidaceae)，是2004年描述并命名白勺新属(Verkley G J M et al, Studies in Mycology, 2004, 50, 323),至今该属报道的种只有十个。
发明内容
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本发明的目的在于提供一种分离自中国云南省元江县印楝indicaA.Juss)植物活体中具有抗肿瘤细胞活性和广谱抗菌活性的微生物菌株一拟盾壳霉菌。本发明所述的拟盾壳霉菌系从中国云南省元江县印楝植物活体中分离获得。现在国家知识产权局认可的保藏单位保藏，保藏单位名称:中国典型培养物保藏中心，简称:CCTCC，保藏单位地址:中国，武汉大学，邮政编码:430072。保藏日期为2013年4月10日，保藏编号为 CCTCC No: M 2013142。本发明所述的拟盾壳霉菌命名为拟盾壳霉菌YM311593 {Paraconi o thyri uni sp.YM311593)，现保藏在国家知识产权局认可的保藏单位，保藏编号为CCTCC No: M 2013142。菌株YM311593于室内自然环境中的培养特征:
1、在玉米粉琼脂(CMA)培养基上菌落呈圆形，培养10天直径4.5cm，2周后直径6cm，边缘整齐，菌丝稀少，紧贴培养基生长，近白色，边缘无色，背面无色。2、在燕麦琼脂(OA)培养基上菌落呈圆形，培养10天直径4.5cm，2周后直径7cm，边缘整齐，菌丝稀少，紧贴培养基生长；中心有少许气生菌丝直立，近白色，边缘微黄色，背面无色。3、在麦芽汁琼脂(MEA)培养基菌落呈圆形，边缘整齐，菌丝较厚，绒状，灰白色，背面褐色，培养10天直径4cm, 2周后达到5.5cm。4、在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上菌落呈圆形，毡状，培养10天菌落直径4.5cm，菌落较厚，肉色，边缘白色；2周后直径6.5cm，颜色变为灰白色，背面深褐色，中心有辐射状裂痕，菌落边缘的培养基中产生黄绿色分泌物，3周菌落长满整个平板。分生孢子器在3周后产生，深褐色到黑色，分散，埋生或半埋生。菌株YM311593的显微形态特征:(见图1、图2、图3、图4)
分生孢子器埋生或半埋生，分散，深褐色到黑色，单腔，近球形到坛形，直径
0.2-0.55mm，无孔口。分生孢子器壁由4_8层不规则细胞(30_70Mm)组成。产孢细胞近圆柱形，具瓶梗。分生孢子椭圆形或短圆柱形，两端钝圆或一端稍尖，单细胞，刚产生是透明的，之后变成红褐色，油球有或无，3-5.5 X 6-9.5 Mm。菌株YM311593的分子生物学特征:
采用分子生物学PCR技术，DNA序列测定分析，YM311593菌株ITS rDNA基因组由517个碱基(bp)组成。以ITS rDNA序列为基础构建的系统发育树(图5)显示，菌株YM311593与 ParaconiothyriumsiQ.JF502423 聚在一个分枝上，序列相似性为 97.8%, Bootstrap 值为 100%.,哀、丨fK与 Paraconiothyrium hawaiiense DQ885896 聚在一分枝上，Bootstrap 值为76%，序列相似性为95.8%，可确定该菌为拟盾壳霉属。菌株YM311593的发酵培养特征:
1、培养基:PDB培 养基。2、培养温度:28±21:。3、发酵时间:7天。4、发酵培养特征:培养第I天，有零星的白色菌丝点出现；培养第3天，发酵液中出现灰白色的小菌丝球；培养第5天，菌丝球增多且体积增大，菌丝球变为灰色，有少量菌丝帖壁，发酵液变为淡黄色；培养第7天，出现大量的菌丝球，体积继续增大，发酵液颜色逐渐变深，呈黄褐色。菌株YM311593的发酵工艺如下:
菌种——活化——一级种子(PDA培养基)——培养(28±2°C，6-7天)——接种——二级种子(PDB培养基，摇床200 r/min，28±2°C，3-4天)——接种(按5%接种量)——发酵(PDB培养基，摇床200 r/min，28±2°C，7天)——发酵物。上述发酵工艺中的发酵条件如下:
1、发酵方式:液体发酵。2、种子培养基:马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)。马铃薯葡萄糖液体培养基的制备:取新鲜马铃薯200克，去皮切成小块，加水I升煮沸30分钟，过滤，滤液加水补足至I升，加入葡萄糖20克，pH自然。上述培养基中加入15克琼脂，即为PDA培养基。3、发酵培养基:马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)。4、培养时间:菌种活化培养6-7天，种子摇床培养3-4天，发酵摇床培养7天。5、培养温度:种子和发酵培养温度均为28 ± 2 °C。
6、发酵完毕，加入等体积95%乙醇浸提48小时，过滤，将滤液浓缩至干，得发酵液制品。本发明所述的菌株YM311593的抗肿瘤细胞活性试验:
采用MTT法，选用对数生长期的贴壁人肺腺癌细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人结肠癌细胞HCT-8、人肝癌细胞Bel7402四种肿瘤细胞，分别用胰酶消化后，用10%小牛血清的RPMI1640培养液配成15000个/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种190 μ ，37°C，5%C02培养24h。实验组加浓度为100 Pg/ml的发酵液提取物样品10 μ ，每孔终体积为200 μ ，用1640培养液补足。37°C，5%C02培养3d。弃上清液，每孔加入100 μ 新鲜配制的0.5mg/ml MTT的无血清培养液，37°C继续培养4h。小心弃上清，并加入200 μ DMSO溶解MTT formazon沉淀,用微型超声振荡器混勻,在酶标仪上测定波长544 nm处的光密度值，计算肿瘤细胞生长抑制率(％)= (0D对照-OD实验)/ (0D对照-OD空白)X 100%ο结果显示，菌株YM311593的发酵液提取物样品对四种肿瘤细胞A549、Hela、HCT-8、Bel7402的生长抑制率分别为96.3%,87.5%、91.4%,93.8%。本发明所述的菌株YM311593的抗菌活性试验:
1.病原指示菌共9株:人体致病真菌包括:白色念珠菌{Candida albicans)、星^形石膏样毛癣菌、Trichophyton gypseum);植物病原真菌包括:稻痕霉iPyriculariaoryzae ) >trytis ciflerea )、禾谷键刀菌 QFusarium《raffiifleara )、燕麦键抱
{Fusarium avenaceum);细菌包括:金黄色葡萄球菌{Staphylococcus aureus)、枯草芽抱杆菌 iBacillus subtil is)lif {Escherichia coli) 02.病原指示菌培养基:人体致病真菌类指示菌采用沙氏培养基；植物病原真菌类指示菌采用PDA培养基；细菌类指示菌采用牛肉膏蛋白胨培养基。
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3.抗菌活性的测定:
在长有指示菌的固体斜面培养基中加入ImL无菌水，震荡片刻制成指示菌悬液。将发酵液提取物样品用无菌水溶解，配制成浓度为1000 Pg/mL的溶液，用PDB液体培养基将样品分别倍比稀释为 6 个浓度:1000 Pg/mL、500 Pg/mL、250 Pg/mL、125 Pg/mL、62.5 Pg/mL、31.25 Pg/mL。按每孔50μ 将样品分别加入到96孔板中，再向每孔中加入50μ 活性指示菌菌悬液，以不加菌液的孔为空白对照，设置3个平行处理。将96孔板置于28 ±1°C (真菌)或37±1°C (细菌)培养箱中培养24 h后，肉眼观测活性指示菌的生长状况，以没有指示菌生长的样品最低浓度为最小抑菌浓度(MIC)。结果显示，菌株YM311593的发酵液提取物样品对9种病原指示菌白色念珠菌、星形石膏样毛癣菌、稻瘟霉、灰葡萄孢、禾谷镰刀菌、燕麦镰孢、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的MIC值分别为31.25、500、125、62.5、250、125、500、125、62.5 M-g/mL 本发明首次从印楝植物(Azadirach ta indi ca)中分离获得内生真菌菌株YM311593，确定为拟盾壳霉菌 YM311593 (.Paraconiothyrium sp.YM311593)，发现该菌对 4种肿瘤细胞有明显的抑制生长活性，对2种人体致病真菌、4种植物病原真菌和3种细菌，共9种病原微生物具有比较明显的抑菌活性。本发明利用植物内生真菌资源，通过发酵获得新型天然抗肿瘤或抗菌药物活性成分。
图1为本发明所述的拟盾壳霉菌YM311593的分生孢子器的纵切面(400X)。图2为本发明所述的拟盾壳霉菌YM311593的分生孢子器壁(400X)。图3为本发明所述的拟盾壳霉菌YM311593的分生孢子梗(400X)。图4为本发明所述的拟盾壳霉菌YM311593的分生孢子(400X)。图5为本发明所述的拟盾壳霉菌YM311593基于ITS序列构建的系统发育树图。
具体实施例方式实施例:
拟盾壳霉菌YM311593菌株是通过发酵获得新型天然抗肿瘤或抗菌药物活性成分的微生物药源。取YM311593菌种，在无菌条件下用接种针挑取少量菌丝，接种于装有已灭菌的PDA培养基试管中，置培养箱内于28±2°C活化培养6-7天，备用。在无菌条件下，将活化好的菌种以相同方法接入已灭菌的一级种子PDB培养基中，在28±2°C培养3-4天，即为YM311593菌株的一级种子。将配制好的PDB培养基IOOml装入500ml三角瓶内，121°C灭菌30分钟备用。取YM311593菌株的一级种子，在无菌条件下接种于装有100ml PDB培养基的500ml三角瓶内，接种量按7-10% (v/v)计，置于28±2°C摇床(200 r/min)培养7天，期间注意检查有无染菌现象。
发酵完毕，向发酵液中加入等体积95%乙醇浸提48小时，过滤，将滤液浓缩至干，加入无菌水即制成抗肿瘤或抗菌发酵液样品。
权利要求
1.一种拟盾壳霉菌，其特征在于命名为拟盾壳霉菌YM311593 {Paraconiothyria sp.YM311593)，现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位，保藏编号为CCTCC No M 2013142。
2.按照权利要求I所述的拟盾壳霉菌，其特征是其ITSrDNA基因组由517个碱基组成，序列如下GGGCGGTAGAGGTAACACTCTCACGCGCCACGCGTTTGAATCCTTTTTTTTACGAGCACCTTTCGTTCTCCTTCGGTGGGGCAACCTGCCGTTGGAATCATACAAAAACCTTTTTTGCATCTAGCATTACCTGTTCCGATAACAAACAATCGTTACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATCTACACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGCGTCTGTCCCGCCTCGGCGCGCGGACTCGCCCCAAATTCATTGGCAGCGGTCTTTGCCTCCTCTCGCGCAGCACATTGCGCTTCTCGAGGTGCTTGCGAGGCCCGCGTCCACGAAGCATTACCAGTCTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATo
全文摘要
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有抗肿瘤细胞活性和广谱抗菌活性的微生物菌株。本发明所述的拟盾壳霉菌命名为拟盾壳霉菌YM311593(Paraconiothyrium sp.YM311593)，现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位，保藏编号为CCTCCNOM 2013142。本发明首次从印楝植物(Azadirachta indica)中分离获得拟盾壳霉类型的内生真菌，并发现拟盾壳霉菌YM311593对四种肿瘤细胞具有明显的抑制生长活性，对两种人体致病真菌、四种植物病原真菌、两种革兰氏阳性细菌和一种革兰氏阴性细菌，共九种病原微生物具有较明显的抑制生长作用。本发明目的是利用植物内生真菌资源，通过发酵以求获得新型天然抗肿瘤或抗菌药物活性成分。
文档编号C12R1/645GK103255068SQ20131023219
公开日2013年8月21日 申请日期2013年6月13日 优先权日2013年6月13日
发明者吴少华, 苗翠苹, 陈有为 申请人:云南大学