专利名称：具有1,3和1,4－β－葡聚糖酶活性的小盾壳霉菌株的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及具有β-葡聚糖酶活性的需氧真菌寄生性真菌小盾壳霉(Coniothyrium minitans)菌株。相关领域介绍影响动物生产量的一个主要因素是饲料利用的效率。有效的饲料利用需要有效消化存在于饲料中的复杂β-葡聚糖底物。β-葡聚糖是天然多糖中最为丰富的多糖之一。具有(1，3)、(1，4)、(1，6)和(1，2)键的β-葡聚糖已经在细菌和植物中鉴定到(Stone和Clark1992)，而具有(1，3)和(1，6)键的β-葡聚糖酶则富含于真菌细胞壁中(Wessels和Sietsma 1981)。饲料中的纤维和β-葡聚糖经常被动物，尤其是单胃动物消化不完全，从而导致浪费。含有某些形式的聚糖(如小麦和黑麦中的阿拉伯木聚糖，或大麦与燕麦中的β-葡聚糖)的饲料也可能对营养物的吸收具有有害作用并且可能通过肠道病原体而促发肠道疾病。
通过酶的补充可以改善家畜对饲料中纤维和β-葡聚糖的消化(Shutte 1995)。据认为聚糖水解酶饲料添加剂能增加纤维降解和/或降低胃肠道的粘滞性，继而增加饲料的摄入和通过的速率(Sears1993)。目前，饲料酶补充受到生产酶的高成本的限制。工业上依赖批量发酵来生产饲料酶并且局限于以一小类真菌(主要为曲霉、青霉和木霉)和细菌(凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、卷曲芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌变种)作为这些酶的来源(Sears 1993)。因此，愈来愈需要β-葡聚糖降解酶(β-葡聚糖酶)新的微生物来源。理想地，这样的微生物能够容易而廉价地通过液态或固态发酵来培养，并且将具有高水平的β-葡聚糖酶活性。在需氧的真菌寄生性真菌小盾壳霉中已报道有内切-和外切-1，3-β-葡聚糖酶活性(Jones等，1973)。然而，Jones等的文献没有讲述具有内切-1，3和内切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性的小盾壳霉。内切-1，3-和内切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性是对降解动物饲料中的β-葡聚糖最为有用的β-葡聚糖酶活性。此外，由于Jones等的培养小盾壳霉的培养基基本上由核盘菌的菌核(一种天然的β-葡聚糖来源)所组成，故Jones等的文献没有讲述在无β-葡聚糖来源的丰富培养基上的小盾壳霉的组成性β-葡聚糖酶活性。这样的培养基将优选用于工业发酵的应用中。由于既未讲述小盾壳霉的内切-1，3-和内切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性，又未讲述其组成性β-葡聚糖酶活性，故Jones等的文献没有提示用小盾壳霉作为β-葡聚糖酶的有用来源。
发明概述本发明提供在液态或固态发酵培养时具有高水平β-葡聚糖酶活性的需氧真菌寄生性真菌小盾壳霉的生物学纯的菌株(小盾壳霉菌株ATCC 74415、74416和74417)。通过对菌株ATCC 74415的诱变，也获得了具有高水平β-葡聚糖酶活性的其他小盾壳霉菌株(小盾壳霉菌株ATCC 74418、74419、74435和74436)。
也提供了制备具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉的方法，广义地说，该方法包括1. 提供多个小盾壳霉ATCC 74415细胞；2. 将这些细胞暴露于紫外线辐射以诱变这些细胞；3. 在培养基上或其中培养该诱变的细胞以制备小盾壳霉的多个培养物；4. 检测诱变细胞培养物的β-葡聚糖酶活性；5. 从步骤(d)中回收那些具有β-葡聚糖酶活性的培养物。
可以使用固体或液体培养基。所用的培养基可以是其中仅仅碳水化合物源为β-葡聚糖来源的基本培养基。这样的培养基将筛选出下面的突变体，它们具有增加β-葡聚糖酶活性的突变，因此可利用培养基中的β-葡聚糖作为碳水化合物来源，并且因此将把具有下调β-葡聚糖酶活性的突变或无突变的小盾壳霉竞争出去。另外，也可以使用含有淀粉和简单糖来源而无β-葡聚糖来源的丰富培养基。在丰富培养基上仍然表现出β-葡聚糖酶活性的诱变的小盾壳霉细胞具有组成性β-葡聚糖酶活性，因为无需β-葡聚糖来源来诱导β-葡聚糖酶活性，并且并未由于淀粉和简单糖的存在而使β-葡聚糖酶活性受到抑制。淀粉和简单糖类是一般在β-葡聚糖之前得到利用的容易代谢的营养物来源，因而会导致β-葡聚糖酶活性的抑制。
经过紫外诱变，获得了具有较母本源菌株小盾壳霉ATCC 74415平均高10倍β-葡聚糖酶活性水平的小盾壳霉突变菌株。这些突变体(ATCC 74435和74436)具有组成性β-葡聚糖酶活性，其无需β-葡聚糖底物来源的诱导，并且不受碳水化合物来源如淀粉或简单糖类存在的抑制。这些特征使本发明的小盾壳霉菌株成为商业β-葡聚糖酶生产的优良候选菌株，因为高β-葡聚糖酶活性菌株可培养于廉价的固体培养基如废土豆皮上。这样的培养基的简单糖类和淀粉含量高，并且不含有作为诱导物发挥作用的β-葡聚糖来源。固体生长培养基可用具有高的组成性β-葡聚糖酶活性的本发明小盾壳霉菌株的孢子或菌丝体进行接种，在培养物生长期间，生长培养基将由大量具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉菌丝体所消化和代替。此β-葡聚糖酶活性然后可通过冷冻干燥该菌丝体并将其研磨成粉末而加以回收。这样的培养条件较液体发酵系统要廉价得多并且更易于操作，特别是如果需要，仅仅含有β-葡聚糖作为碳水化合物来源的特化基本培养基来培养具有需要β-葡聚糖来源的存在作为诱导物，并且受简单糖类或淀粉存在抑制的β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉菌株时更是如此。
附图
简介附图为小盾壳霉野生型菌株和突变体遗传相关性的分枝图。该分枝图是仅仅用产生多态性片段和差异性强度片段的引物组合来使野生型和突变菌株之间的分离最大化而制做的。用数值分类系统软件(“NTSYS”)(Exeter Software，Setauket，纽约，美国)中的未加权对群方法产生相异度指数。
发明详述为了提供对本说明书和权利要求书(包括权利要求书的语言所限定的范围)清晰而一致的理解，提供下面的定义。
小盾壳霉“生物学纯的培养物”是其中的所有细胞来自单一孢子或单一菌丝顶端，并且因此在遗传上基本上是一致的小盾壳霉培养物。
“β-葡聚糖酶”是能够水解聚合底物β-葡聚糖的酶。β-葡聚糖酶包括但不限于水解β-1，3-键的内切-1，3-β-葡聚糖酶、水解β-1，4-键的内切-1，4-β-葡聚糖酶和既水解β-1，3又水解β-1，4-键的内切-1，3-1，4-β-葡聚糖酶。下面是由国际生化与分子生物学联合会(“IUBMB”)命名委员会命名为“β-葡聚糖酶”的酶，根据IUBMB和酶学委员会(“EC”)编号所建议的名称列出纤维素酶(EC 3.2.1.4)-别名包括内切葡聚糖酶、内切-1，4-β-葡聚糖酶和羧甲基纤维素酶。纤维素酶催化纤维素中1，4-β-D-糖苷键的内切水解。它也水解也含有1，3-键的β-D-葡聚糖中的1，4-键；内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)-别名包括内切-1，4-β-葡聚糖酶、内切-1，3-β-葡聚糖酶和昆布多糖酶。内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶在待水解键涉及还原性基团的葡萄糖残基本身在C-3处被取代时，催化β-D-葡聚糖中1，3-或1，4-键的内切水解。底物包括昆布多糖、地衣淀粉和禾谷d-葡聚糖。
葡聚糖内切-1，3-β-D-葡糖苷酶(EC 3.2.1.39)-别名包括(1→3)-β-葡聚糖内切水解酶、内切-1，3-β-葡聚糖酶和昆布多糖酶。葡聚糖内切-1，3-β-D-葡糖苷酶催化1，3-β-D-葡聚糖中1，3-β-D-糖苷键的水解，但是对混合键(1，3-1，4-)-β-D-葡聚糖的作用很有限。底物包括昆布多糖、副淀粉和茯苓多糖。
葡聚糖1，3-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.58)-别名包括外切-1，3-β-葡聚糖酶和外切-1，3-β-葡糖苷酶。葡聚糖1，3-β-葡糖苷酶催化β-D-葡萄糖单位从1，3-β-D-葡聚糖非还原末端的依次水解，释放出α-葡萄糖。葡聚糖1，3-β-葡糖苷酶作用于寡糖但对昆布二糖作用很慢。
葡聚糖内切-1，2-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.71)-别名包括内切-1，2-β-葡聚糖酶。葡聚糖内切-1，2-β-葡糖苷酶催化1，2-β-D-葡聚糖中1，2-糖苷键的随机水解。
地衣淀粉酶(EC 3.2.1.73)-别名包括地衣多糖酶(lichenase)、β-葡聚糖酶、内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶、1，3-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶和混合键β-葡聚糖酶。地衣淀粉酶催化含有1，3-和1，4-键的β-D-葡聚糖中的1，4-β-D-糖苷键的水解。地衣淀粉酶作用于地衣淀粉(也称为“地衣多糖”)和禾谷类β-D-葡聚糖，但对仅含1，3-或1，4-键的β-D-葡聚糖没有作用。
葡聚糖内切-1，6-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.75)-别名包括内切-1，6-β-葡聚糖酶。葡聚糖内切-1，6-葡糖苷酶催化1，6-β-D-葡聚糖中1，6-键的随机水解。底物包括lutean、石耳素和1，6-寡聚-β-D-葡糖苷。
从前面的内容，特别是提供的别名，很容易看出用于命名β-葡聚糖酶类型酶的命名法还不完全一致。这部分是由于早期的命名法用所水解的底物命名这些酶(例如，水解昆布多糖的酶为昆布多糖酶)，后来又被根据所催化的特定反应而命名酶的做法所取代。
为了一致性和明确性的目的，在本说明书和权利要求书中，β-葡聚糖酶活性用所水解的底物来命名，如在这里的实施例1所列举的情形，实施例1中各种多糖底物的水解通过将各种小盾壳霉部分或样品与各种多糖底物温育期间还原性糖(以葡萄糖测定)的释放加以测定。用于测定小盾壳霉菌株β-葡聚糖酶活性的底物包括羧甲基纤维素、地衣多糖、昆布多糖和大麦β-葡聚糖。因此，正如在本文和权利要求书中所使用的“纤维素水解活性”为催化纤维素水解从而释放还原性糖(以葡萄糖测定)的小盾壳霉菌株的β-葡聚糖酶活性；“地衣多糖水解活性”为催化地衣多糖水解从而释放还原性糖(以葡萄糖测定)的小盾壳霉菌株的β-葡聚糖酶活性；“昆布多糖水解活性”为催化昆布多糖水解从而释放还原性糖(以葡萄糖测定)的小盾壳霉菌株的β-葡聚糖酶活性；“大麦β-葡聚糖水解活性”为催化大麦β-葡聚糖水解从而释放还原性糖(以葡萄糖测定)的小盾壳霉菌株的β-葡聚糖酶活性。
上述的多糖底物可容易地从如下的商业来源得到纤维素-可获自Sigma-Aldrich公司(St.Louis.，Missouri，美国)的羧甲基纤维素(“CMC”)，Sigma目录号C 5013；地衣多糖-可获自Sigma，目录号L 6133，或可获自Megazyme爱尔兰国际有限公司(Bray Business Park，Bray，County Wicklow，爱尔兰)，Megazyme目录号P-LICHN；
昆布多糖-可获自Sigma，目录号L 9634；大麦β-葡聚糖-可获自Sigma，目录号G 6513，或可获自Megazyme，目录号P-BGBL、P-BGBM和P-BGBH。
CMC底物仅仅由1，4-β-D-葡聚糖所组成。昆布多糖底物仅仅由1，3-β-D-葡聚糖所组成。地衣多糖和大麦β-葡聚糖同时由1，3-和1，4-β-D-葡聚糖所组成，尽管其中具有不同比例的这两种类型键。由于这些底物的组成不同，因此已知水解CMC释放还原性糖的β-葡聚糖酶必定水解1，4-键。类似地，水解昆布多糖释放还原性糖的β-葡聚糖酶必定水解1，3-键。水解地衣多糖或大麦β-葡聚糖的β-葡聚糖酶可以水解1，3-键、1，4-键或同时水解这二种键。在本发明中，据信由于观察到这些酶的高活性，故本发明小盾壳霉菌株的水解地衣多糖和水解大麦β-葡聚糖的β-葡聚糖酶同时水解1，3-和1，4-键。预计仅仅水解这些键中其中一种键的酶将具有明显较低的活性。同样，本发明小盾壳霉菌株产生的β-葡聚糖酶的活性水平清楚地表明该β-葡聚糖酶具有内切-β-葡聚糖酶活性(水解多糖链内的内糖苷键)而不是外切-β-葡聚糖酶活性(仅仅水解多糖链末端单体的糖苷键)。预计外切-β-葡聚糖酶较本发明小盾壳霉菌株中观察到的酶具有明显较低的活性水平。
“具有β-葡聚糖酶活性”的小盾壳霉菌株为在适当的培养条件下显示至少一种上述β-葡聚糖水解活性的小盾壳霉菌株。这种β-葡聚糖酶活性可与培养基中的小盾壳霉菌丝体一起回收，或从用于提取菌丝体的溶剂或培养基中回收。β-葡聚糖酶活性可通过这里的实施例1中列出的不同分析方法加以定量，这些方法在此定义为“多孔板扩散分析”、“OBR-HEC分析”、“改良的还原糖分析”、和“β-葡聚糖酶平板清除分析”。实施例1提供了允许本领域技术人员定量测定小盾壳霉培养物β-葡聚糖酶活性的这些分析中每种分析可重复的分析条件。
具有“组成性”β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉菌株为当培养于富含简单糖类和淀粉(如土豆葡萄糖培养基)并且不含有β-葡聚糖来源(如干燥的核盘菌菌核)的培养基中时，显示β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉菌株。
“包括可吸收淀粉或糖类来源并且基本上无可吸收β-葡聚糖来源的培养基”为丰富培养基，如富含淀粉和简单糖类，但不含有β-葡聚糖来源(如，1％核盘菌干燥菌核或大麦β-葡聚糖)的土豆葡萄糖培养基。
“基本上无可吸收淀粉或糖类来源并且包括可吸收β-葡聚糖来源的培养基”为基本培养基，如含有β-葡聚糖来源如1％干燥核盘菌菌核的改良Czapek-Dox培养基。
至于本发明的小盾壳霉菌株，“其具有β-葡聚糖酶活性的突变体”为一种具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉菌株，该菌株来自本发明的小盾壳霉菌株并且在其DNA结构或组成变化上与本发明菌株不同，无论是由于正常的分离、遗传重组过程、自发突变还是由诱变剂诱导的突变的结果，但仍然保持β-葡聚糖酶活性。
“β-葡聚糖酶活性单位(“U”)”，包括但不限于羧甲基纤维素水解活性、地衣多糖水解活性、大麦β-葡聚糖水解活性或昆布多糖水解活性，为在37℃，pH4.5时每分钟导致1μmol葡萄糖当量的还原性糖释放的β-葡聚糖酶活性的量。
发现从加拿大大草原收集到的一种野生型菌株小盾壳霉菌株2134，为培养于液态或固态发酵中时，显示高水平的β-葡聚糖酶活性。该β-葡聚糖酶主要显示出昆布多糖水解活性，而具有较低水平的羧甲基纤维素水解活性。小盾壳霉菌株2134于1997年6月13日保藏于美国模式培养物保藏中心(“ATCC”)(10801 University Boulevard，Manassas，Virginia，20110-2209，美国)，保藏号为74415。小盾壳霉菌株2134的菌落具有黄棕色色素、平滑边缘并且产生孢子(这部分中所有的表型描述均是对在室温(20-22℃)光照下培养于土豆葡萄糖琼脂上14天的真菌菌落的描述)。
发现从加拿大大草原收集到的野生型菌株小盾壳霉菌株2130和2135具有β-葡聚糖酶活性，包括大麦β-葡聚糖酶水解活性、地衣多糖水解活性、昆布多糖水解活性和纤维素水解活性。菌株2130已于1997年6月13日以保藏号74417保藏于ATCC。小盾壳霉菌株2130的菌落具有橄榄绿的色素、平滑的边缘并且产生孢子。菌株2135已于1997年6月13日以保藏号74416保藏于ATCC。小盾壳霉菌株2135的菌落具橄榄棕色的色素、光滑的边缘并且产生孢子。
通过紫外线辐射诱导小盾壳霉菌株2134的突变。分离到数种显示出增加的β-葡聚糖酶活性的突变体，并且将这些突变体命名为菌株M11-3B2、A7-3D、A8-1和A10-4。发现突变菌株M11-3B2、A8-1和A10-4相对稳定。2种组成性突变体菌株A8-1和A10-4在无补充诱导物(β-葡聚糖底物)时表达大麦β-葡聚糖水解活性。培养于土豆葡萄糖培养液(“PDB”)中的A8-1和A10-4培养上清液具有平均比母本菌株高10倍的最高水平的β-葡聚糖酶活性。M11-3B2当在富含β-葡聚糖的底物存在下培养时具有低水平的组成性β-葡聚糖酶表达和增加的昆布多糖水解活性。
菌株M11-3B2为原初突变体M11在0.2％AZCL-β-葡聚糖琼脂培养基上8次传代后的子代。菌株M11-3是从原初M11突变体的单个孢子中分离到的姐妹菌落并于1997年6月13日以保藏号74418保藏于ATCC。小盾壳霉菌株M11-3的菌落具有黄棕色色素、光滑的边缘并且形成孢子。小盾壳霉菌株M11-3B2的菌落具有橄榄黄棕色色素、平滑的边缘并且形成孢子。
菌株A8-1于1998年3月31日以保藏号74436保藏于ATCC。小盾壳霉菌株A8-1的菌落具有黄白色色素、锯齿状边缘并且产生很少的孢子。菌株A10-4已于1998年3月31日以保藏号74435保藏于ATCC。小盾壳霉菌株A10-4的菌落具有黄白色色素、锯齿状边缘并且产生很少的孢子。
也发现小盾壳霉菌株A7-3D具有β-葡聚糖酶活性，虽然该活性随着时间推移而下降。菌株A7-3D已于1997年6月13日以保藏号74419保藏于ATCC。菌株A7-3D的菌落具有黄棕色色素、锯齿状边缘并且产生孢子。
突变 小盾壳霉菌株M11-3B2、A7-3D、A8-1和A10-4是通过紫外线辐射而对本说明书实施例1中所述小盾壳霉孢子悬液进行诱变而从小盾壳霉野生型菌株2134制得的。在一种方法中，含有0.2％大麦β-葡聚糖的改良Czapek-Dox(“MCD”)培养基用作选择性生长培养基。MCD是不提供碳水化合物来源的基本培养基。加入β-葡聚糖作为碳水化合物来源(例如大麦β-葡聚糖)。具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉菌株可利用大麦β-葡聚糖作为碳水化合物来源。在该方法中，具有上调β-葡聚糖酶活性的突变的突变孢子培养物将具有更高的β-葡聚糖酶活性，并且应该因此生长更快，并将来自具有下调β-葡聚糖酶活性的突变或无β-葡聚糖酶活性突变的孢子的菌丝体竞争出去。然而，该方法没有鉴定出在没有作为诱导物的β-葡聚糖来源存在时具有β-葡聚糖酶活性的组成性突变体。此外，使用基本培养基如MCD不能区分其中的β-葡聚糖酶活性受到简单糖类如葡萄糖或其它单糖或二糖、或淀粉的存在抑制的菌株与其中的β-葡聚糖酶活性不受到抑制的菌株。
为了对具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉菌株进行大规模经济发酵，需要具有无需β-葡聚糖来源诱导并且不受简单糖类存在抑制的组成性β-葡聚糖酶活性。虽然β-葡聚糖的天然来源可以得到，如在本说明书的实施例中所述的“诱导物”就是从真菌核盘菌的菌核制得的一种β-葡聚糖来源，但许多廉价且易得的生长培养基，如土豆皮，不提供β-葡聚糖来源。优选不必添加β-葡聚糖来源至培养基中。
在大规模发酵中，由于至少两个原因而还优选使用具有不受简单糖类或淀粉存在抑制的β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉菌株。首先，优选能够使用廉价培养基如富含淀粉和简单糖类的土豆皮而不是使用非天然存在的基本培养基如MCD。其次，即使使用基本培养基如MCD并且提供β-葡聚糖作为碳水化合物来源，小盾壳霉培养物的β-葡聚糖酶活性对β-葡聚糖的降解也将导致简单糖类的积累，而这些糖类必须去除以避免β-葡聚糖酶活性的抑制。
因此，在优选的诱变方法中，将诱变的孢子培养于不提供β-葡聚糖来源并且富含简单糖类的培养基如PDB中，以筛选具有不受淀粉或简单糖类存在抑制的组成性β-葡聚糖酶活性的突变体。
无论将培养物培养于0.2％大麦β-葡聚糖MCD培养基还是PDB中，使用本说明书实施例1中详述的多孔板扩散分析都能有效地筛选出多个来自诱变孢子的小盾壳霉培养物。多孔板扩散分析包括同时将从源自诱变孢子的小盾壳霉培养物中采集的多个样品与固体分析培养基接触，使每个样品都与所述固体分析培养基的部分表面之间流体相通，但与每个其他样品都流体分离。固体分析培养基含有一种分析组合物，它在其中一种小盾壳霉培养物样品中的β-葡聚糖活性存在下，以与该样品的β-葡聚糖酶活性成比例的量释放扩散至该样品中的可定量的标记。优选该分析组合物为用于同时检测内切-1，3-β-葡聚糖酶活性和内切-1，4-β-葡聚糖酶活性的组合物，如天青色苯胺染料交联的β-葡聚糖(“AZCL-β-葡聚糖”)(如上所述，大麦β-葡聚糖底物同时包括1，3-和1，4-键，因此预计显示出高的大麦β-葡聚糖水解活性的β-葡聚糖酶既具有内切-1，3-β-葡聚糖酶活性又具有内切-1，4-β-葡聚糖酶活性)。由内切-1，3-β-葡聚糖酶活性或内切-1，4-β-葡聚糖酶活性对AZCL-β-葡聚糖的降解释放出可定量的标记，即天青蓝染料。由于降解的AZCL-β-葡聚糖的量与样品中的β-葡聚糖酶活性水平成比例，故释放至该样品中的天青蓝染料的量与该样品的β-葡聚糖酶活性成比例。
标准的96孔板(或其它多孔板)既可用于培养诱变的孢子悬液样品又可用于进行多孔板扩散分析。将培养于第一个多孔分析板中的每个小盾壳霉培养物的样品转移到第二个多孔分析板的小孔中。该分析板的盖子内部衬有含有AZCL-β-葡聚糖分析组合物的固体琼脂分析培养基。将一层干酪布置于分析培养基的顶部以加固该分析培养基，并且在酶促消化期间维持其完整性。将盖子置于平板上，使固体分析培养基封住每个孔的顶部，从而分离每个孔，然后将盖好盖子的平板小心倒置。温育该平板使该样品中的β-葡聚糖酶活性裂解AZCL-β-葡聚糖分析组合物，释放出天青蓝染料至该样品中，从而得到可见的蓝色，可通过用自动平板读数器测定该样品的光密度而加以定量。扩散至该样品中的天青蓝染料的量愈大，则该样品的β-葡聚糖酶活性愈高。通过传代培养得自该生长中的菌丝体的单个菌丝顶端可进一步纯化具有高β-葡聚糖酶活性的突变小盾壳霉菌株。
诱变和分离具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉菌株的优选方法如下进行。提供具有约10ml体积和大约1×104个孢子/ml密度的小盾壳霉孢子悬液，然后暴露于紫外光足以杀死该悬液中大约97-99％孢子的时间。然后将辐射过的孢子悬液样品以大约10-30个活孢子/孔的量培养于96孔板(或其它多孔板)的每个小孔中，通过分析法如本说明书的实施例1中所述的多孔平板扩散分析来筛选β-葡聚糖酶活性。将具有最高活性的孔铺于0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂板上。然后挑取来自培养于0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂平板上的菌落的单个菌丝顶端，并培养于丰富培养基如土豆葡萄糖琼脂(“PDA”)上。从突变培养物中取出菌丝体块并培养于MCD+1％菌核“诱导物”(β-葡聚糖来源)培养基中，然后通过多孔板扩散分析检测β-葡聚糖酶活性。将来自具有最高β-葡聚糖酶活性的培养物的单个菌丝顶端传代培养于PDA/0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂上并将培养物保存于液氮中。通过在MCD+β-葡聚糖来源培养基中培养来自该培养物的菌丝体块并通过多孔板扩散分析检测β-葡聚糖酶活性而测定该培养物的β-葡聚糖酶活性。将具有最高β-葡聚糖酶活性的培养物保存于液氮中，并在摇瓶中进行放大试验。用本说明书实施例1中所述的改良还原性糖分析法测定放大培养物的β-葡聚糖酶活性。将放大培养物的样品保存于液氮中。如上所述，当用该诱变和分离方法筛选具有组成性，不受抑制的β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉菌株时，用丰富培养基如富含简单糖类但不含β-葡聚糖来源的PDB代替基本培养基MCD+β-葡聚糖来源。
在本说明书实施例1中讨论的另一种方法中，可将小盾壳霉的培养物培养于暴露于诱变剂的固体培养基上，并且随后直接在固体培养基上，通过例如实施例1中所述的β-葡聚糖酶平板清除分析法测定该培养物的β-葡聚糖酶活性。
本说明书的表3显示当培养于PDB(富含简单糖类和淀粉，无β-葡聚糖诱导物来源)上时组成性突变体A10-4和A8-1与母本野生型菌株2134的内切-1，3-β-葡聚糖酶和内切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性(大麦β-葡聚糖水解活性)。β-葡聚糖酶活性单位(“U”)定义为导致在37℃时每分钟释放1μmol葡萄糖当量的还原性糖类的β-葡聚糖酶活性的量。在表3中很明显，在三次测试中，突变体A10-4和A8-1显示出7.3到13.8倍于母本菌株2134的组成性、不受抑制的大麦β-葡聚糖水解活性，其中的突变菌株是通过本发明的诱变方法而从该母本菌株中获得的。平均起来，突变体A10-4和A8-1显示出大约10倍于母本菌株2134的组成性、不受抑制的大麦β-葡聚糖水解活性。在表3中也很明显，菌株A10-4和A8-1的15天PDB培养物通过多孔板扩散分析而测定出分别具有大于2.0U/ml和2.5U/ml大麦β-葡聚糖水解活性。
表4总结了本发明小盾壳霉菌株的其它优越特性。表4比较了小盾壳霉母本菌株2134和突变体A8-1、A10-4和M11-3B2的细胞外羧甲基纤维素水解活性。检测各种培养条件，包括PDB(受简单糖类的抑制，无β-葡聚糖诱导物来源)、PDB+诱导体(受简单糖类的抑制，有β-葡聚糖诱导物来源)、和MCD+诱导物(无抑制性简单糖的来源但具有β-葡聚糖诱导物来源的基本培养基)。主要结果为PDB的结果。如前面所讨论的，PDB类似于将优选用于商业发酵设备中的粗培养基。在PDB上具有β-葡聚糖酶活性的菌株具有不受简单糖类的存在抑制的组成性β-葡聚糖酶活性。正如表4中的第3栏中所见到的，虽然菌株2134在PDB上没有显示羧甲基纤维素水解活性，但突变体M11-3B2、A10-4和A8-1中都在PDB上显示出显著的羧甲基纤维素水解活性。在表4中也很明显，当通过OBR-HEC分析进行测定时，菌株A10-4和A8-1的15天PDB培养物分别具有大于0.4U/ml和0.7U/ml的纤维素水解活性。β-葡聚糖酶活性在表4中表示为每ml测定的酶溶液的单位数。即，对每种菌株测定等体积的培养上清。
在表5中显示了本发明小盾壳霉菌株的大麦β-葡聚糖水解活性、地衣多糖水解活性、昆布多糖水解活性和纤维素水解活性。总结于表5中的结果相应于培养在提供了1％核盘菌菌核作为诱导物(一种天然β-葡聚糖来源)的MCD上的菌株。因此，这些结果就在MCD+诱导物培养基上筛选的突变体M11-3B2而言特别重要，而对于在PDB上筛选的突变体A8-1和A10-4则提供较少的信息。在一个15天培养物中，突变体M11-3B2显示出比母本菌株2134高8％的大麦β-葡聚糖水解活性，高46％的地衣多糖水解活性，即平均比母本非诱变菌株(2134)高25％的内切-1，3-和内切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性。如前所述，由于大麦β-葡聚糖和地衣多糖两者均受内切-1，3-β-葡聚糖酶活性和内切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性最为有效的水解，故这些结果表明M11-3B2突变体的内切-1，3-β-葡聚糖酶与内切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性较母本2134菌株提高。如表5中所显示的，突变体M11-3B2显示出宽范围的β-葡聚糖酶活性，即，当对培养于含有1％核盘菌菌核的MCD培养基中的15天培养物通过改良的还原糖分析法测定时，具有高于7.0U/ml的昆布多糖水解活性、6.0U/ml的大麦β-葡聚糖水解活性、6.0U/ml的地衣多糖水解活性和2.0U/ml的纤维素水解活性。
表5a显示对培养于含有1％核盘菌菌核的MCD培养液中的9天培养物测得的小盾壳霉菌株2130和2135相对于菌株2134、2132和2136的昆布多糖水解活性、大麦β-葡聚糖水解活性、地衣多糖水解活性和纤维素水解活性。菌株2132和2136是从加拿大大草原中收集到的其它小盾壳霉菌株，并且保藏于Lethbridge研究中心培养物保藏中心(Lethbridge Research Centre Culture Collection)。尽管对每种测试的底物都较菌株2134显示出更低的β-葡聚糖酶活性，但是菌株2130和2135对四种底物都一致具有强的β-葡聚糖酶活性。
描述于本说明书实施例2中的扩增片段长度多态性(“AFLP”)分析测得野生型菌株2134和突变体M11-3、M11-3B2、A7-3D、A8-1和A10-4(通过诱变获得)聚集在一个密组中，它们的相异度指数小于0.50，表明它们高水平的遗传相关性，尽管有些突变体相对于母本菌株2134的β-葡聚糖酶活性有实质性的增加。因此很明显，源自小盾壳霉菌株2134(ATCC 74415)的小盾壳霉突变菌株可保持β-葡聚糖酶活性，尽管具有可以识别的(通过AFLP或其它形式的分析)结构或组成上的基因组变化，本领域技术人员将会认识到，源自小盾壳霉ATCC 74415的这种突变菌株可容易地通过本说明书实施例1中给出的分析方法测定其β-葡聚糖酶活性，并且应当明白，具有β-葡聚糖酶活性的这种菌株属于本发明的范围和精神之内。
本发明通过下面的非限制性实施例进一步加以说明。
实施例1小盾壳霉的β-葡聚糖酶活性真菌及培养条件从加拿大Manitoba(Huang 1981)和Alberta收集到的小盾壳霉菌株保藏于Lethbridge研究中心模式培养物保藏中心。突变菌株M11-3B2、A10-4和A8-1来自紫外辐射后的母本菌株2134(野生型)。诱变方案的细节描述如下。所有的原种培养物保存于液氮中的10％甘油中。在PDA(Difco Laboratories，Detroit，Michigan，美国)上短时间维持工作培养物。通过可见的自发突变如形态或颜色连续筛选PDA上的培养物中的培养变异体。下面详细描述真菌特征分析的方法。振荡液体培养物中胞外酶的制备测定培养于MCD+1％“诱导物”液体培养基中的小盾壳霉培养物上清液的胞外β-葡聚糖酶活性。培养基中含有以下成分(每升蒸馏水)NH4H2PO4，2.0g；K2HPO4，1.0g；MgSO4·7H2O，0.5g；KCl，0.5g；FeSO4，0.01g；“诱导物”(富含β-葡聚糖的核盘菌菌核干粉)，10.0g；1％ZnSO4，1ml；0.5％CuSO4，1ml。测定培养于PDB(Difco)中的小盾壳霉培养物上清液中的酶组成性表达。将培养物在20℃连续光照(12.5μmole m-2s-1)并且振荡条件(振速200rpm)下培养。小盾壳霉的干重收集在PDB、PDB+1％“诱导物”和MCD+1％“诱导物”中培养15天后的真菌培养物固体物质(取样后45ml)，并且以5,000×g离心10分钟。将菌丝体沉淀物转移到铝箔测量皿中并于90℃加热48小时。称量每只平板中剩余的干物质。酶分析用下面的方法测定样品上清液中小盾壳霉的胞外酶活性1)多孔板扩散分析；2)OBR-HEC分析；3)改良的还原糖分析；4)β-葡聚糖酶平板清除分析。对培养于PDB中培养物的上清液进行多孔板扩散分析、β-葡聚糖酶平板清除分析和OBR-HEC分析。β-葡聚糖酶平板清除分析也可适用于直接测定生长中的培养物的β-葡聚糖酶活性。由于培养基中大量的已还原糖的存在而导致高背景，不能用改良的还原糖分析法来分析培养于PDB中的培养物。然而，OBR-HEC分析仅可测定内切-1，4-β-葡聚糖酶活性，并且多孔板扩散分析受到商业上制备的不溶性AZCL底物(Megazyme国际爱尔兰有限公司，Bray，County Wicklow，爱尔兰)来源的限制。改良的还原糖分析可用任何高质量的底物如可得自Sigma-Aldrich公司(St.Louis，Missouri，美国)的β-葡聚糖、昆布多糖、地衣多糖或纤维素进行。多孔板扩散β-葡聚糖酶分析正如在本说明书和权利要求书中所使用的，在该部分中描述的β-葡聚糖酶分析应该定义为“多孔板扩散分析”。
在该分析以及下文所述的每种β-葡聚糖酶分析中，将β-葡聚糖酶活性表示为每ml小盾壳霉培养上清液中β-葡聚糖酶活性的单位数(“U”)。如前面所讨论的，一单位的β-葡聚糖酶活性定义为在37℃每分钟导致1μmol葡萄糖当量的还原糖释放的β-葡聚糖酶活性的量。
为了进行这里所述的每种β-葡聚糖酶活性分析，将用于β-葡聚糖酶活性测定的真菌培养物以三份培养于250ml锥形瓶中的50ml培养液中。用3个采自PDA上旺盛生长菌落(4-5日龄)边缘的菌丝体块(用3号打孔器)接种每只锥形瓶。将培养物于20℃在持续光照(12.5μmol m-2s-1)以及200rpm的摇床中温育。在接种后3、6、9、12和15天从每只瓶中取出1ml生长培养基而取真菌培养物样品。将样品收集于1.5ml的Eppendorf管中并于5000×g离心5分钟。
用于通过多孔板扩散分析筛选产生高水平β-葡聚糖酶的真菌分离物的分析培养基，含有溶解于25mM pH4.5乙酸钠中的0.2％AZCL-β-葡聚糖和2.0％琼脂。将该分析培养基高压灭菌并且冷却至55℃，在倾倒前搅拌以确保AZCL-β-葡聚糖颗粒的均匀分布。小心地准确吸取20ml的分析培养基移至位于水平表面上96孔板的盖子中。一旦固化后，将切成与该96孔板匹配的单层灭菌干酪布小心置于该分析培养基上，从而将盖子衬上。加入干酪布是为加强基质分析培养基，继而强化在酶消化后易于降解的琼脂分析培养基层。
将50μl每种标准的内切葡聚糖酶样品加入96孔扩散分析板的第一排孔(1a-f)和剩余的孔中，从96孔诱变板中将50μl每种测试真菌培养上清液转移到96孔扩散分析板的相应小孔中。然后向该扩散分析板中的所有孔中加入25mM乙酸钠(pH4.5)至350μl的终体积。然后将衬有分析培养基的盖子小心置于填充有样品的96孔分析板的顶部，并在将此盖与平板紧压在一起的同时倒置。紧压平板底部而去除所有的气泡(迫使所有气泡升至倒置小孔的底部)，以确保酶样品与分析培养基之间直接接触。在室温将分析平板温育数小时(通常过夜)。为了增加酶反应速度，该分析平板可在更高的温度(即，37℃-40℃)温育，从而缩短进行此分析所需的时间长度。虽然天青色苯胺染料交联的β-葡聚糖在缓冲液中是不溶的，然而，该分析培养基对底物的快速水化将形成可被内切葡聚糖酶消化的可溶性凝胶颗粒。内切-1，3-β-葡聚糖酶或内切-1，4-β-葡聚糖酶的消化释放出蓝色染料片段至该培养基中，从而导致可见的蓝色。将商业上可得到的内切葡聚糖酶(或是对大麦β-葡聚糖具有测得比活为76.5U/mg的纤维素酶(EC 3.2.1.4)，Megazyme，或是对大麦β-葡聚糖具有测得比活为118U/mg的地衣淀粉酶(EC 3.2.1.73))在25mM乙酸钠(pH4.5)中稀释至终浓度为2、1、0.5、0.25、0.125、0.06及0.00U/ml。因此，蓝色染料渗透性地从固体琼脂分析培养基中扩散至96孔平板小孔中接触的样品/酶溶液中。结果，在含有较高β-葡聚糖酶活性的样品孔中将显现较强的蓝色。为了测定酶活性，将平板小心地立起来，并小心地取下盖子。于590nm处在自动平板读数器上读取样品的吸收值。根据由每个小孔中标准内切葡聚糖酶样品相对光密度制作的标准曲线预测样品的活性。为了使染料与酶在样品孔间的扩散最少，在分析平板孔中一见到蓝色就立即取下盖子而终止酶反应温育步骤。将分析平行进行两次。Ostazin亮红羟乙基纤维素(OBR-HEC)分析正如本说明书及权利要求书中所使用的，在该部分中描述的β-葡聚糖酶分析应该定义为“OBR-HEC分析”。
用于β-葡聚糖酶活性测定的小盾壳霉培养物的制备与多孔板扩散β-葡聚糖酶分析中相同。
在25mM pH4.5的乙酸钠中制备8mg/ml的OBR-HEC(Sigma-Aldrich目录号O-6879)底物溶液。将样品上清液(酶溶液)适当稀释于25mM pH4.5的乙酸钠中。将底物与酶溶液均平衡至37℃5分钟。将100μl的底物与100μl的酶溶液在1.5ml Eppendorf小管中混合。将酶反应液于37℃水浴中温育120分钟。通过加入0.8ml冰冷的乙醇-丙酮(2∶1)而终止反应。将样品混合并于室温静置30分钟。将样品以12,000×g在小型离心机中离心2分钟。在550nm处在0.5ml的比色杯中测定上清液的光密度。每个样品与背景对照一起平行测定2次。对照如上所述制备，但是在用乙醇-丙酮终止温育后将底物加入到酶溶液中。通过减去背景对照值而校正样品测试值。由用商业上可得到的纤维素酶(EC 3.2.1.4)(Megazyme)制做的标准曲线估计酶活性在0.1到1U/ml的范围。改良的还原糖分析正如在本说明书和在权利要求书中所使用的，在该部分中描述的β-葡聚糖酶分析应该定义为“改良的还原糖分析”。
用于β-葡聚糖酶活性测定的小盾壳霉培养物制备与多孔板扩散β-葡聚糖酶分析中相同。
分析在96孔滴定板中进行。将50μl的样品上清液/酶加入到每小孔中并平衡至37℃。然后，将50μl在25mM，pH4.5的乙酸钠中以5mg/ml的浓度稀释并平衡至37℃的羧甲基纤维素(#C-5013 Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，美国)、地衣多糖(Sigma #L-6133)、昆布多糖(Sigma，9634)和β-葡聚糖(Megazyme P-BGBH)加入到该酶中。使分析物在37℃反应15分钟并通过加入在使用前混合的100μl冷溶液B(0.3％二硝基苯二酸)和溶液C(1.8M K2CO3+0.1M Na2S2O31∶1 v/v)而终止。将样品在95℃加热45分钟直到反应完成。用平板读数器测定410nm光密度的吸收。背景吸收通过对照样品加以测定并从样品吸收中减去。按照与上面概述的无温育测试分析相同的方法，制备每种样品的对照反应物，在加入底物到对照样品中后立即加入终止液B+C。根据用从50μg/ml到500μg/ml的一系列葡萄糖浓度制做的标准曲线估计酶活性。除了用100μl葡萄糖标准物代替50μl底物+50μl上清液混合物之外，标准物的制备与上述用于测试分析的方法相同。将得到大于3.0光密度的样品稀释并且再次测定。样品如下进行稀释第3天的样品不稀释，第6天的样品以1∶2稀释，第9和第12天的样品以1∶5稀释，第15天的样品以1∶10稀释。一单位酶活性定义为在37℃每分钟释放1μmol葡萄糖当量的还原糖所需的酶量。β-葡聚糖酶平板清除分析正如本说明书及权利要求书中所使用的，在该部分中描述的β-葡聚糖酶分析应该定义为“β-葡聚糖酶平板清除分析”。
用于β-葡聚糖酶活性测定的小盾壳霉的制备与多孔板扩散分析相同。
可直接在AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂培养基上筛选小盾壳霉培养物的β-葡聚糖酶活性。AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂培养基含有以下组分(每升蒸馏水中)NH4H2PO4，2.0g；K2HPO4，1.0g；MgSO4·7H2O，0.5g；KCl，0.5g；FeSO4，0.01g；AZCL-β-葡聚糖(Megazyme)，0.2g；1％ZnSO4，1ml；0.5％CuSO4，1ml；琼脂，20.0g。由于AZCL-β-葡聚糖颗粒是不溶性的，故在高压灭菌后冷却培养基至55℃并且在临倾倒前搅拌从而确保AZCL-β-葡聚糖颗粒的均匀分布是很重要的。通过测定真菌菌落周围由于不溶性AZCL-β-葡聚糖颗粒水解和蓝色染料释放而导致的清亮区来监测0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂培养基上的β-葡聚糖酶活性。
也可用对上述方法稍作调整的这种平板清除方法分析液体培养物上清液的胞外酶活性。为了建立小孔，将无菌的不锈钢环(1.0cm直径)置于高压灭菌的溶解于25mM pH4.5乙酸钠中的0.2％AZCL-β-葡聚糖和2％琼脂的顶部。将50μl体积测试液(酶)置于小孔中并让其扩散入培养基中过夜(18小时)。一旦所有的溶液都被吸收入培养基中，则取下该环。于37℃温育24小时后，测定并记录清亮区直径。用商业上可得到的稀释于25mM乙酸钠(pH4.5)中至终浓度0.25、0.5、1.0、2.5和5U/ml的内切葡聚糖酶(或者为对大麦β-葡聚糖具有76.5U/mg测得比活的纤维素酶(EC 3.2.1.4)(Megazyme)，或者为对大麦β-葡聚糖具有118U/mg测得比活的地衣淀粉酶(EC 3.2.1.73))的结果制做标准曲线。小盾壳霉的表型特征分析在0.2％大麦β-葡聚糖MCD琼脂、0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂、MCD+1％“诱导物”琼脂和PDA上，对小盾壳霉培养物进行表型特征分析。大麦β-葡聚糖MCD琼脂、0.2％AZCL-β-葡聚糖琼脂和PDA的制备与上述相同。通过再加入20.0g琼脂到1升上述的MCD液体培养基中制备MCD琼脂。还在补充0.2％AZCL-β-葡聚糖的PDA上筛选β-葡聚糖酶的组成性表达。
为了对小盾壳霉母本和突变培养物表型进行特征分析，用3号打孔器(6mm直径)从PDA上的4到5日龄培养物边缘的菌丝体垫上切下琼脂块。将菌丝体块接种于PDA、0.2％大麦β-葡聚糖MCD琼脂和0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂上，其中将1个菌丝体块置于每个培养平板的中央。将培养物在光照和20℃下温育。接种后14天记录菌落颜色、培养物形状、生长速度和孢子形成的表型变化。同时用75％乙醇清洗培养物15分钟以从真菌菌落中提取有色物质(Huang，1981)。小盾壳霉突变体的诱变与分离方法A在琼脂上对孢子进行紫外辐射将来自菌株2134的小盾壳霉孢子划线接种到PDA上并使其在20℃萌发48小时。然后分别挑取萌发的孢子并转移至AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂培养基中。将萌发的孢子(9个培养平板)置于距短波(254nm)紫外灭菌灯(782 L30型，Westinghouse电子公司，Pittsburgh，Pennsylvania，美国)30cm距离处。取下培养平板盖，对萌发的孢子进行紫外辐射1分钟、2.5分钟或5分钟。将未暴露至紫外光的一平板萌发孢子用作对照。辐射后，将平板于20℃置于黑暗中48小时，然后于20℃置于光照下。辐射后，每天监测真菌的生长和β-葡聚糖酶的表达。由于辐射过的孢子已接种于AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂培养基上，可通过β-葡聚糖酶平板清除分析方法直接监测β-葡聚糖酶的活性。从在菌落周围形成最大清亮区的那些菌落中获取单个菌丝顶端培养物。将产生高活性酶的培养物在补充了0.2％AZCL-β-葡聚糖、0.2％大麦β-葡聚糖或0.2％“诱导物”作为唯一碳水化合物来源的基本选择培养基(MCD)上反复传代培养。在20℃光照下温育5-7天后，由最初暴露于紫外光的原初0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂平板上的存活辐射孢子培养物，在PDA和0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂上建立单个菌丝顶端培养物。
方法B在悬液中对孢子进行紫外辐射在含有以下成分(每升蒸馏水中)的0.2％大麦β-葡聚糖MCD液体培养基中制备孢子悬液(～10ml，1×104个孢子/ml)NH4H2PO4，2.0g；K2HPO4，1.0g；MgSO4·7H2O，0.5g；KCl，0.5g；FeSO4，0.01g；大麦β-葡聚糖，0.2g(Megazyme)；1％ZnSO4，1ml；0.5％CuSO4，1ml。将孢子悬液置于距短波(254nm)紫外光灭菌灯(Westinghouse 782 L30)10cm距离处的开口培养皿中。在暴露于紫外光之前从该平板中取出对照样品(1ml)。暴露于紫外光1、3和5分钟后取出处理后的样品。调整紫外光辐射时间长度至3分钟，从而杀死大约97-99％悬液中的孢子。辐射后，将200μl孢子悬浮转移至96孔板中的每孔中(或者1×103个辐射孢子/孔或大约10-30个活孢子/孔)。将第一排留作对照排，其中含有200μl未辐射的孢子。头48小时中将平板置于20℃黑暗中以防止光复活，然后再转移到20℃完全光照下14天。为了筛选组成性突变体的β-葡聚糖酶活性，除了将孢子悬浮于PDB中以外，如上所述用紫外光辐射小盾壳霉孢子。产生高活性β-葡聚糖酶的小盾壳霉的初步筛选通过上述的多孔板扩散分析筛选含有具有高β-葡聚糖酶活性的突变小盾壳霉培养物的孔。在96孔板中，将50μl浓度为2、1、0.5、0.25、0.125、0.06和0.00U/ml(稀释于25mM乙酸钠(pH4.5)中)的纤维素酶标准物加入到第一排(孔1a-g)中。用八管微加样器，将该96孔培养板每孔中的50μl培养物无菌转移至96孔扩散分析板的相应孔中(注在培养板中的对照第1排不转移至用于酶标准物的分析平板中)。
用Mohler等所述的方法(1996)在波长650nm处读取光密度，从而估计培养板每孔中存在的菌丝体的量。将具有低菌丝体量但具有高酶活性的孔列为分离的目标。具有增加的β-葡聚糖酶活性的遗传纯小盾壳霉系的分离将具有最高酶活性的孔中的菌丝体转移至0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂平板上。3-4天后，从菌落中分离单个菌丝顶端(～10个/板)，转移至培养平板中的PDA上，并于20℃光照下温育4-5天。选择表型不同的单个菌丝顶端培养物并测定其酶产量。用3号打孔器从PDA上突变培养物的边缘取出菌丝体块，并以3块/试管将其置于15ml试管中的3ml MCD+1％“诱导物”液体培养基中。将试管以一定的角度置于摇床中的试管架中，并于20℃温育，同时以200rpm振摇。在第7和第14天，用上述的快速扩散平板分析测定培养物的酶活性。将产生最高β-葡聚糖酶的小盾壳霉系保存于液氮中，并传代培养单个菌丝顶端，再转移至PDA/0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂中。将二次分离的这些突变培养物再次培养于PDA上，并按上述在3ml MCD+1％“诱导物”液体培养物中再次测定β-葡聚糖酶的产量。在这2次分离步骤后，第三次测定具有最高β-葡聚糖酶产量的所得真菌培养物的β-葡聚糖酶产量。将真菌培养物培养于装有10ml MCD+1％“诱导物”培养液的较大的50ml培养瓶中7到14天，并用优化的还原糖分析进行测定。比较突变菌株的酶产量与母本菌株的酶活性。源自诱变及分离方法A和B的小盾壳霉突变体的酶分析测定小盾壳霉母本菌株2134及其衍生突变体M11-3B2、A10-4与A8-1的胞外酶产量。将培养物培养于土豆葡萄糖培养基(PDB)、PDB加上1％“诱导物”(核盘菌菌核干粉)和含有以下成分(每升蒸馏水中)的MCD+1％“诱导物”培养液中NH4H2PO4，2.0g；K2HPO4，1.0g；MgSO4·7H2O，0.5g；KCl，0.5g；FeSO4，0.01g；“诱导物”，10.0g；1％ZnSO4，1ml；0.5％CuSO4，1ml。PDA与PDB由可从Difco Laboratories(Detroit，Michigan，美国)供应的商业培养基加以制备。将真菌培养物以三份平行培养于250ml锥形瓶中的50ml培养液中。每只瓶中接种采自PDA上旺盛生长菌落(4-5日龄)边缘的3个菌丝体块(用3号打孔器)。将培养物于20℃连续光照(12.5μmol m-2s-1)下于200rpm摇床中温育。接种后3、6、9、12和15天通过从每只瓶中取出1ml生长培养基而从真菌培养物中取样。将样品收集于1.5ml Eppendorf管中并于5000×g离心5分钟。用下面的方法测定样品上清液中的胞外酶活性1)多孔板扩散分析；2)OBR-HEC分析；3)改良的还原糖分析。对培养于PDB上的培养物的上清液进行多孔板扩散分析和OBR-HEC分析。酶谱-CMC通过酶谱分析研究母本小盾壳霉菌株2134的纤维素酶(羧甲基纤维素水解活性)。用在灌胶过程中掺入0.5％羧甲基纤维素(“CMC”)的Laemmli凝胶，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(“SDS-PAGE”)检测纤维素酶条带。下面的样品于该凝胶中电泳A道，20μl上清液；B道，20μl浓缩上清液(10X)；C道，低分子量标记；D道，20μl浓缩上清液(10X)；E道，15μl浓缩上清液(10X)；F道，20μl上清液；G道，20μl来自菌株#2314的浓缩上清液(10X)。电泳后将凝胶于室温浸泡于1％TritonX-100中1小时(换3次，每次清洗200ml)以去除SDS，于4℃浸泡于50mM磷酸缓冲液(pH6.5)中1小时以使酶复性，并且在37℃浸泡于50mM磷酸缓冲液(pH6.5)中1-18小时以引发酶活性。通过银染色观察蛋白。通过用1％刚果红染色凝胶1小时并用1M NaCl清洗而观察酶条带。用绿色Wratten # 58滤光镜(Eastman Kodak公司，Rochester，纽约，美国)(用宝丽来系统和宝丽来556正/负胶片(Polaroid Corporation，Cambridge，Massachusetts，USA)，焦距5.6，曝光0.25秒)对凝胶拍照。结果与讨论诱变与突变体的分离方法A.琼脂上孢子的紫外光辐射紫外光辐射1分钟后大约88％的小盾壳霉孢子维持存活，而辐射2.5分钟后67％的孢子维持存活，辐射5分钟后50％的孢子维持存活。大约50％存活的辐射真菌培养物在培养于0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂培养基上7天后具有相对较大的清亮区(＞3mm)。通过单个菌丝顶端分离而进一步遗传纯化具有大于3mm清亮区的培养物。将单个菌丝顶端转移至PDA及0.2％AZCLβ-葡聚糖MCD琼脂上。同时反复在0.2％AZCLβ-葡聚糖上传代培养小盾壳霉突变体以强制突变体在β-葡聚糖上生长，并分析β-葡聚糖酶活性的自发上调。在PDA上光照培养14天后，根据表型改变如菌落颜色、生长速度、孢子形成及形状，区分突变体与母本菌株2134(野生型)。
通过紫外光辐射从母本菌株2134中获得大约50个菌落的小盾壳霉突变体。将这些突变体分离物随后培养于0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂培养基上。除了表型特征分析外，还测定了突变体的酶产量。将小盾壳霉培养物培养于125ml锥形瓶中的20ml MCD+1％“诱导物”培养液中，并在第3天和第5天通过改良的还原糖方法分析胞外酶活性。产生高水平β-葡聚糖酶的突变体迅速利用“诱导物”底物，从而导致早在接种后4-5天培养基就出现清亮。将产生高水平β-葡聚糖酶的2种突变体(M11和M11-3，姐妹培养物)的酶水平与原初母本2134野生型进行比较。M11培养物是由紫外光辐射1分钟后在0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂培养基上进行筛选而产生的初级突变体。从原初M11突变体的单个孢子中分离M11-3。开始的酶产量实验表明，突变体M11-3(1.88U/ml)到培养于MCD+1％“诱导物”培养液中5天时，β-葡聚糖酶表达大约较母本菌株2134高5X(0.33U/ml)。为了增加该突变体的β-葡聚糖酶产量，将其连续传代培养于0.2％AZCL-β-葡聚糖琼脂培养基上。突变体M11-3B2是原初突变体M11在0.2％AZCL-β-葡聚糖琼脂培养基上传代8次后的子代。在20℃光照下培养于PDA上14天的培养物中突变体M11-3B2与母本菌株2134之间的形态特征差异明显。这些突变体的表型特征分析也总结于表1中。同时也发现，源自突变体M11的突变培养物当培养于PDA上时不稳定，因为在PDA上长期培养导致酶活性下降，因此，在基本限制培养基如0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD琼脂培养基上的传代对于培养物的维持似乎是必需的。
方法B悬液中孢子的紫外光辐射用0.2％β-葡聚糖MCD培养液作为小盾壳霉的选择性培养基的策略是为了限制来自具有下调β-葡聚糖酶产量的突变的孢子的菌丝体生长，同时选择性地促进来自具有上调β-葡聚糖酶活性的突变的孢子的菌丝体生长。假设具有高β-葡聚糖酶活性的突变孢子培养物将以比低β-葡聚糖酶产量的突变孢子培养物更快的速度生长并且产生更多的β-葡聚糖酶，则产生高水平β-葡聚糖酶的突变体将在相同的孔中把产生低水平β-葡聚糖酶的突变体竞争出去。
用0.2％β-葡聚糖MCD培养液作为起始培养基，用方法B筛选出大约6000个小盾壳霉菌株2134的活紫外光辐射孢子。从用多孔扩散平板分析测得具有相对较高β-葡聚糖酶活性的孔中得到的小盾壳霉培养物中，通过单个菌丝顶端分离而分离到大约75个突变培养物。通过培养于3ml MCD+1％“诱导物”培养液中而测定这些突变体的β-葡聚糖酶产量2次。在这些突变体中，通过在50ml锥形瓶中更大的10ml体积的MCD+1％“诱导物”培养液中培养培养物，第三次测定26个突变体的酶产量。产生最高水平酶的突变体似乎为突变体菌株A7-3D。光照下培养于PDA上的A7-3D 14日龄培养物的表型特征描述于表1中。然而，当进一步分析A7-3D培养物的酶活性时，该活性似乎下降，并且未能将突变体M11-3竞争出去。
使用基本限制性培养基0.2％β-葡聚糖MCD作为选择培养基不能区分显示出诱导性或组成性β-葡聚糖酶生产的突变孢子。同样，0.2％β-葡聚糖MCD培养基将不能区分β-葡聚糖酶产量受或不受简单糖类如葡萄糖存在抑制的突变孢子，使用PDB作为选择培养基将允许活孢子无论在有上调还是下调β-葡聚糖酶产量的突变时都能生长。PDB将提供富含简单糖类的环境，因此一般将抑制母本菌株2134中的β-葡聚糖酶表达。PDB也将不会诱导β-葡聚糖酶的表达，因为该培养基中将存在很少的β-葡聚糖底物来诱导表达。因此，任何含有产生β-葡聚糖酶的菌丝体的孔都将表明，得到的突变为组成性的或者至少该真菌菌丝体β-葡聚糖酶的表达部分地不受葡萄糖存在和/或β-葡聚糖缺乏的影响。
同时认为，每孔中菌丝体的生长量影响该孔中β-葡聚糖酶的活性。与较高的β-葡聚糖酶活性相关的更多的菌丝体生长并不表明β-葡聚糖酶的表达增加。因此，为了估计菌丝体的生长，在650nm处读取96孔培养板的光密度。在解剖显微镜下目测证实菌丝体培养物的光密度。与较少菌丝体相关的更高的酶活性表明有强上调β-葡聚糖酶活性的突变。
将大约4000个紫外光辐射的小盾壳霉菌株2134的活孢子培养于PDB中，并且筛选β-葡聚糖酶活性。在352个筛选的孔中，2个孔得到相对较高的β-葡聚糖酶活性，但孔中有相对较低量的菌丝体。将这些孔的菌丝体转移至并培养于PDA上。从该菌落中制备单个菌丝顶端分离物以在PDA上建立纯培养物。将来自这2个孔的培养物培养于3mlPDB试管培养物上，并通过多孔板扩散分析筛选β-葡聚糖的表达。通过测定PDB中的β-葡聚糖酶活性，鉴定组成性表达的β-葡聚糖酶培养物。鉴定出菌株A8-1和A10-4为产生组成性β-葡聚糖酶的突变体。在光照下培养于PDA上的A8-1和A10-4的14日龄培养物的表型特征描述于表1中。液体培养物中小盾壳霉突变体M11-3B2、A8-1和A10-4的酶产量。
小盾壳霉菌株2134及其突变体在液体培养物中的生长在每5ml培养物中培养15天后用干菌丝体量来测定小盾壳霉在PDB、PDB+1％“诱导物”或MCD+1％“诱导物”培养液中的生长。菌丝体平均干重表明，四种小盾壳霉菌株中都在PDB+1％“诱导物”中生长最好，其次是PDB，再次是MCD+1％“诱导物”培养液(表2)。PDB富含营养物(淀粉和简单糖类)。1％“诱导物”是碳水化合物(主要由β-葡聚糖所构成)的天然来源(Saito 1977)。正如所预期的，由于更大量的简单碳水化合物的存在，培养物在PDB+1％“诱导物”中生长最好。母本菌株2134在PDB中比突变菌株生长快(表2)，这与菌株2134在PDA上的生长速度相关(表1)。
培养于PDB中的小盾壳霉菌株2134、M11-3B2、A8-1和A10-4的β-葡聚糖酶的产量通过多孔板扩散分析测定当培养于PDB中15天时小盾壳霉母本菌株2134与突变菌株M11-3B2、A8-1及A10-4的胞外酶产量。当培养于PDB中时，母本菌株2134的大麦β-葡聚糖水解活性大大受到抑制，培养15天后产生不到0.25U/ml的活性(表3)。在这三个平行实验的每个实验中，突变体A10-4与A8-1的大麦β-葡聚糖水解活性显著较高，大约在1.8-3.5U/ml的范围。突变体A8-1似乎较A10-4产生略高的大麦β-葡聚糖水解活性(表3)。当培养于补充0.2％AZCL-β-葡聚糖的PDA上时，母本菌株2134相对于突变体A10-4、A8-1和M11-3B2的大麦β-葡聚糖水解活性的抑制可以由培养于补充0.2％AZCL-β-葡聚糖的PDA上时真菌菌落周围的清亮区观察到。PDA富含抑制β-葡聚糖酶表达的淀粉和简单糖类。当培养于补充0.2％AZCL-β-葡聚糖的PDA上时，母本菌株2134直到淀粉和简单糖类已被用尽后才产生β-葡聚糖酶。因此，具有组成性表达的突变菌株(A10-4，A8-1)在真菌菌落周围有一个可见的清亮区(大约5-7mm宽)，而母本菌株与其它无组成性表达的突变体菌落则没有清亮区。突变体M11-3B2也似乎具有一定的组成性表达，并且有一个较小的清亮区(大约3mm宽)。
小盾壳霉母本菌株2134和突变体M11-3B2、A10-4和A8-1的纤维素水解活性用OBR-HEC分析测定小盾壳霉母本菌株2134和突变菌株M11-3B2、A8-1和A10-4的细胞外纤维素水解活性。当培养于PDB中时母本菌株2134具有不显著量的纤维素水解活性，而突变菌株M11-3B2、A10-4和A8-1具有不同水平的纤维素水解活性(表4)。A8-1和A10-4显示出最高水平的纤维素水解活性，测得产生的酶活性大约为0.5-0.9U/ml，而M11-3B2产生较低水平的酶活性，产生活性大约为0.2U/ml。当母本菌株2134培养于含1％诱导物的PDB中6到9天后，该菌株开始缓慢产生一些纤维素酶，到15天时显示出大约0.2U/ml的纤维素水解活性(表4)。到15天时，在相同的条件下突变体M11-3B2产生大约2U/ml的纤维素水解活性，而突变菌株A8-1和A10-4到6天时，分别产生大约0.5和0.2U/ml的活性。当母本菌株2134培养于MCD+1％“诱导物”培养液中时，具有最高的纤维素水解活性，到15天时大约为3U/ml。当培养于MCD+1％“诱导物”培养液中时，突变体A10-4和A8-1均具有不显著的纤维素水解活性，而突变体M11-3B2具有大约0.6U/ml的纤维素水解活性(表4)。
用改良的还原糖分析测得的小盾壳霉内切-1，3-β-葡聚糖酶和内切-1，4-β-葡聚糖酶活性只有培养于MCD+1％“诱导物”培养液中的培养物才可用改良的还原糖分析法加以分析，因为培养于基于PDB的培养基中的培养物导致高水平的还原糖背景。用昆布多糖(a)、大麦β-葡聚糖(b)、地衣多糖(c)和CMC(d)作为底物的改良还原糖分析的结果示于表5中。CMC底物仅由β-1，4-D-葡聚糖构成。昆布多糖底物仅由β-1，3-D-葡聚糖构成。地衣多糖和大麦β-葡聚糖由1，3-和1，4-β-葡聚糖组成。到15天时母本菌株2134产生最高水平的纤维素水解活性(～3.4U/ml)，而突变体M11-3B2产生最高水平的昆布多糖水解活性(～7.2U/ml)。同时，M11-3B2突变菌株较母本菌株2134产生更高的地衣多糖水解活性(～6.5U/ml)和类似量的大麦β-葡聚糖水解活性(～6.5U/ml)(母本菌株分别为～4.5U/ml和～6.5U/ml)。底物地衣多糖较大麦β-葡聚糖具有更高的β-1，3对β-1，4键的比例，因而解释了菌株2134略微增加的大麦β-葡聚糖水解活性。突变体A10-4和A8-1较母本菌株2134产生不显著量的纤维素水解活性，但产生略少量的昆布多糖水解活性(分别为～4.3U/ml和～5.3U/ml)。酶谱-CMC对小盾壳霉菌株2134纤维素水解活性的酶谱分析显示出一条具有很高纤维素水解活性的66kDa的条带和具有较低活性的50和35kDa两个条带，这表明有多种酶或酶亚单位。最适pH测得培养于PDB上的小盾壳霉菌株A10-4的纤维素水解活性的最适pH为4.5。
测得培养于有β-葡聚糖来源的基本培养基上的小盾壳霉菌株2134的昆布多糖水解活性的最适pH为5.5。最适温度测得培养于PDB上的小盾壳霉菌株A10-4的纤维素水解活性的最适温度为45℃。
实施例2小盾壳霉野生型菌株和突变体的DNA指纹分析在该研究中选择四种野生型小盾壳霉菌株2130、2134、2135和2137以及五种源自野生型菌株2134的突变菌株M11-3、M11-3B2、A7-3D、A8-1和A10-4进行DNA指纹分析。所有的小盾壳霉菌株都收集自加拿大大草原(Huang 1981)并保藏于Lethbridge研究中心模式培养物保藏中心，这些菌株在该保藏机构中一直处于保密状态，尚未向公众公开。小盾壳霉菌株和突变体的原初培养物保存于液氮中的10％甘油中，工作培养物维持于PDA培养基上。
将每种小盾壳霉菌株或突变体的三个菌丝体内块接种到50mlPDB液体培养基中，并在20℃光照下于旋转摇床(200rpm)上温育。2周后，过滤收集菌丝体并且冻干备用。用改良的蛋白酶K和苯酚-氯仿方法(Laroche等，1995)从该菌丝体样品中分离基因组DNA。用分光光度计(Beckman Coulter公司，Fullerton，California，美国，DU-65型)在260nm处测定提取物中的DNA浓度(50μg/ml DNA/光密度单位)。用0.8％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实每种样品DNA的大小。重复接种、温育和从所有9个菌株或突变体中分离DNA。
用适于小基因组物种如大多数真菌的原初AFLP技术(Vos 1995)的改进方法，对小盾壳霉菌株及突变体进行DNA指纹分析。将总基因组DNA(0.5μg)在37℃用5U的BglII和5U的MseI在40μl体系中消化1小时。然后，加入含有5pmol BglII-衔接子(表6)、50pmolMseI-衔接子(表6)、1U T4 DNA连接酶的10μl混合物，并在37℃温育进行限制性消化和连接反应3小时。
用下面的方式以35轮循环的逐渐降温(touch-down)方法进行聚合酶链反应(“PCR”)DNA在94℃变性30秒，DNA退火步骤1分钟，在72℃ DNA延伸2分钟。第一轮循环中的退火温度为65℃，然后在以后的10轮循环中每轮循环降低1℃，最后在56℃继续进行剩下的25轮循环。用含有4μl模板DNA(来自限制性消化和连接反应混合物的1∶10稀释液)、一对寡核苷酸引物(每种50ng)、0.5U Taq DNA聚合酶、2mM MgCl2和Tris-HCl缓冲液(pH8.3)中的2mMdNTP的20μl混合物进行此反应。
根据BglII-衔接子和MseI-衔接子的序列设计并合成AFLP引物(表6)，在每个引物的3′末端也含有一个或两个额外的选择性核苷酸。总共64种引物组合用于该研究中，包括四个MseI-引物(PMseA、PMseC、PMseG和PMseT)和16个BglII-引物(PBglAA、PBglAC、PBglAG、PBglAT、PBglCA、PBglCC、PaglCG、PBglCT、PBglGA、PBglGC、PBglGG、PBglGT、PBglTA、PBglTC、PBglTG和PBglTT)。将在该菌株和/或突变体中产生多态性DNA条带图案的引物组合重复至少两次以确认AFLP标记。
将PCR扩增的产物首先通过2.0％琼脂糖凝胶电泳(TAE缓冲液，pH8.0)进行大小分级分离，并通过溴化乙锭染色观察DNA条带。将这些产物也通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行大小分级分离并通过银染色加以观察。将每次PCR反应的等份试样(10μl)上样于1×TBE缓冲液(50mM Tris、50mM硼酸、1mM EDTA，pH8.0)中的7.0％聚丙烯酰胺凝胶(29∶1比例的丙烯酰胺∶双丙烯酰胺)中。将凝胶在恒定电压(100V)下电泳并用Promega的DNA银染色系统(Promega公司，Madison，Wisconsin，美国，目录号DQ 7050)染色凝胶中的DNA片段。
在本研究中进一步用GeneScan荧光测定仪(Perkin Elmer公司，Foster City，California，美国)进行分子长度的测定和小盾壳霉菌株与突变体间DNA片段的相对定量。将以5-羧基荧光素荧光染料标记以进行大小检测的5μM dUTP在PCR扩增过程中随机掺入DNA片段中。将体积为0.5μl的ROX染料(GeneScan-2500)加入到每个上样样品中作为内道大小标准物。用GeneAmp检测胶(Perkin Elmer公司，Foster City，California，美国，目录号F 2252)在Applied BiosystemsDNA测序仪(373 A型)上进行大小分级分离电泳。用GeneScan672软件(1993)收集和分析在电泳中检测到的DNA片段的数据。
用数值分类法和多变量分析系统(Rohlf 1992)对小盾壳霉菌株和突变体AFLP标记进行群集分析。根据DNA扩增片段的不存在(0)或存在(1-3)，对每个菌株和/或突变体的间隔数据用Dist系数进行相似性距阵配对。根据依次、簇集、分级和嵌套群集方法进行相应的群集分析，并用不同群集间算术平均连锁(linkage)的未加权对群方法(“UPGMA”)制做它们的遗传相关性的分枝图(Rohlf 1992)。结果和讨论用合成的寡核苷酸引物在PCR扩增方法中筛选9个小盾壳霉菌株(四种野生型菌株和五种突变体)的AFLP标记。虽然大多数引物组合产生容易记录的带型，但仅有一部分扩增DNA片段是明显独特的并且是多态性的(表8和9)，这些片段用于DNA指纹分析。在此研究中，在测试的64种引物组合中，测得12种组合能提供信息，在琼脂糖凝胶中检测到多于160个DNA片段，仅选择其中19个独特且多态性的片段作为AFLP标记(表7)。在该研究中，PCR扩增片段的大小分级分离在用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶与银染色的聚丙烯酰胺凝胶之间产生类似的DNA带型(数据未给出)。虽然用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳产生较低的分辨率，但可清楚地鉴别出多态性DNA片段。虽然银染色的聚丙烯酰胺凝胶对100到600bp范围的DNA片段具有更高的分辨率，但是难以检测大于600bp的多态性片段。GeneScan对检测不同样品间DNA的多态性是很灵敏的，并且该计算机软件也大大改进了数据分析和结果的显示(表8和9)。
根据琼脂糖凝胶中的DNA带型，仅用PMseA和PBglCT引物组合鉴定在该研究中选择的四个小盾壳霉菌株(表7和8)。例如，用A/CT 1和A/CT 2标记，将四个菌株首先分成2组(1)菌株2130和2134；(2)菌株2135和2137。由此出发，可进一步用A/CT 4或A/CT 5对菌株2130和2134进一步再分组和鉴定；菌株2135和2137可用A/CT 3或A/CT 4进一步再分组和鉴定。用其它AFLP引物组合区分这些小盾壳霉菌株也是可能的(表7)。
与四种小盾壳霉菌株相反，五种小盾壳霉突变体间的DNA多态性要小得多。在该研究中，在测试的64种引物组合中，在3种突变体M11-3、M11-3B2和A7-3D之间没有观察到DNA带型的差异。然而，2种AFLP标记A/TA和G/CC产生可将A8-1和A10-4与其它三种突变体区分的多态性DNA片段(表7和9)。例如，用PMseA和PBglTA引物组合扩增出的低强度448bp DNA片段在突变体M11-3、M11-3B2和A7-3D中见到，而突变体A8-1中观察到更高强度，在突变体A10-4中检测到强得多的强度(表9)。
对9个小盾壳霉菌株和突变体的19个AFLP的标记的群集分析得到了与其推断的系谱良好吻合的遗传相关性分枝图(图)。在该分枝图中没有区分三种突变体(M11-3、M11-3B2和A7-3D)，因为在它们之间没有检测到AFLP多态性。菌株2134及其5个突变体群集于一个密组中，相异性指数(ID)小于0.50，表明它们之间有高水平的遗传相关性。例如，菌株2134与三种连锁突变体(M11-3、M11-3B2和A7-3D)群集在一起，其ID为0.23，A8-1与A10-4之间的ID仅为0.32。然而，四个菌株2130、2134、2135和2137具有大于0.56的ID，表明它们的基因型可能具有一定的多样性。当所有的AFLP片段用于群集分析时，所有的9个小盾壳霉菌株都群集在一起，难以彼此区分，因此表明小盾壳霉菌株彼此间高度相关。
我们的结果表明，AFLP技术是鉴定小盾壳霉菌株和突变体的强有力的方法。在本研究中检测到的AFLP标记是可靠的、可重复的，并且对于不同的小盾壳霉基因型是独特的，因此很适于DNA指纹分析。由于所有的5个突变体都源自母本菌株2134，并且其基因型可能几乎一致，在DNA水平上区分不同突变体较区分不同菌株更为困难。理论上，AFLP指纹分析技术可用不同的引物组合研究不同DNA之间的任何多态性。因此，如果更多的AFLP引物组合得到进一步检测，则检测不同突变体的独特DNA指纹应该是可能的。表1.小盾壳霉野生型菌株2130、2134和2135以及突变菌株M11-3、M11-3B2、A7-3D、A8-1和A10-4的表型特征分析。菌株 生长a(cm) 菌落特征分析色素边缘孢子2130 8.2橄榄绿 平滑有(ATCC 74417)2134 7.5黄棕色 平滑有(ATCC 74415)2135 8.3橄榄棕色平滑有(ATCC 74416)M11-3 7.4黄棕色 平滑有(ATCC 74418)M11-3B2 8.2橄榄黄棕色 平滑有A7-3D 6.5黄棕色 平滑有(ATCC 74419)A8-1 7.2黄白色 锯齿状 很少(ATCC 74436)A10-4 6.8黄白色 锯齿状 很少(ATCC 74435)a于室温光照下在PDA上培养14天时三个平行真菌菌落的平均直径。表2.在不同培养基上x液体培养时小盾壳霉菌株2134(ATCC74415)和突变菌株M11-3B2、A10-4(ATCC 74435)和A8-1(ATCC 74436)菌丝体干重z的比较
xPDB(土豆葡萄糖培养液)、PDB+I(土豆葡萄糖培养液+1％“诱导物”)或MCD+I(改良的Czapek-Dox+1％“诱导物”)。z二次平行实验的平均菌丝体干重。表3.小盾壳霉突变体A10-4和A8-1的组成性细胞外大麦β-葡聚糖水解活性(内切-1，3-和内切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性)。<
z培养于PDB中15天时2134(ATCC 74415)和突变菌株A10-4(ATCC 74435)和A8-1(ATCC74436)。培养物A、B和C代表培养于PDB上三次平行实验结果。x酶活性用AZCL-β-葡聚糖作为底物以多孔扩散平板分析加以测定。a表示为每ml上清液中活性单位数的酶活性。表4.小盾壳霉母本菌株2134和突变体A8-1、A10-4和M113B2的细胞外纤维素水解活性(β-1，4-内切葡聚糖酶)的比较。
*小盾壳霉菌株培养于PDB、PDB+1％“诱导物”(PDB+I)或MCD+1％“诱导物”(MCD+I)培养液中。通过OBR-HEC分析方法测定PDB和PDB+I的纤维素水解活性，通过改良的还原糖分析测定MCD+I的纤维素水解活性。“诱导物”是由核盘菌菌核制成的富含β-葡聚糖的底物。a酶活性表示为每ml上清液中的活性单位数。表5.培养于MCD+1％“诱导物”培养液中时小盾壳霉菌株2134、M11-3B2、A10-4和A8-1的β-葡聚糖酶活性z的比较。
z给出的酶活性为2次平行实验的平均值。培养物上清液对下列底物的酶活性通过改良的还原糖分析加以测定a用于昆布多糖水解活性(内切-1，3-β-葡聚糖酶活性)的昆布多糖。b用于大麦β-葡聚糖酶活性(内切-1，3-和内切-1，4-β-葡聚糖酶活性)的大麦β-葡聚糖。c用于地衣多糖水解活性(内切-1，3-和内切-1，4-β-葡聚糖酶活性)的地衣多糖。d用于纤维素水解活性(内切-1，4-β-葡聚糖酶活性)的纤维素。e表示为每ml上清液中活性单位数的酶活性。表5a.培养于MCD+1％“诱导物”培养液中时小盾壳霉菌株z2130、2132、2134、2135和2136对不同底物的β-葡聚糖酶活性y的比较。
y给出的酶活性为三次平行实验的平均值(avg)及其标准差(std)代表由该培养物在培养的11天内达到的最大活性。酶活性表示为U/ml上清液，用改良的还原糖分析法测得。除了2134连续增加外，所有的培养物都在9天后到达其最大酶活性。z所有小盾壳霉菌株都为从加拿大大草原中收集的并保藏于Lethbridge研究中心模式培养物保藏中心的野生型菌株。a用于昆布多糖水解活性(内切-1，3-β-葡聚糖酶活性)的昆布多糖。b用于大麦β-葡聚糖水解活性(内切-1，3-和内切-1，4-β-葡聚糖酶活性)的大麦β-葡聚糖。c用于地衣多糖水解活性(内切-1，3-和内切-1，4-β-葡聚糖酶活性)的地衣多糖。d用于纤维素水解活性(内切-1，4-β-葡聚糖酶活性)的纤维素。表6.AFLP衔接子和引物z的DNA序列。BglII-衔接子5′CTC GTG GAC TGC GTA C 3′(SEQ ID NO1)3′CAC CTG ACG CAT GCT AG 5′(SEQ ID NO2)MseI-衔接子 5′GAC GAT GAG TCC TGA G 3′(SEQ ID NO3)3′TA CTC AGG ACT CAT 5′(SEQ ID NO4)BglII引物 5′GGA CTG CGT ACG ATC TNN 3′(SEQ ID NO5)MseI引物5′GAT GAG TCC TGA GTA AN 3′(SEQ ID NO6)z根据衔接子的序列设计并合成引物，引物3′末端的字母N为四种核苷酸A、C、G和T中的一种。表7.小盾壳霉菌株和突变体z的AFLP标记。
z小盾壳霉菌株2130、2134、2135和2137为野生型，菌株M11-3、M11-3B2、A7-D、A8-1和A10-4为源自母本菌株2134的突变体。AFLP标记根据琼脂糖凝胶加以筛选和检测，并通过所选的扩增DNA片段的不存在(0)和存在(1-3)对其计分(1＝较低强度的片段；2＝较高强度的片段；3＝强得多的强度的片段)。表8.小盾壳霉野生型(菌株2130、2134、2135和2137)用AFLP引物组合A/CT得到的DNA指纹。不同片段的分子大小获自GeneScan图形。
表9.小盾壳霉菌株(2134)及其突变体(A8-1和A10-4)用AFLP引物组合A/TA得到的DNA指纹。不同片段的分子大小获自GeneScan图形。
参考文献表GeneScan 672 software.1993.User’s Manual.Applied Biosystems.Perkin ElmerCorporation.
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在本说明书中提到的所有出版物均表明本发明涉及领域的技术水平。所有出版物在此列为参考，其参考程度等同于指明每篇单独的出版物被具体地分别列为参考。
尽管为了清楚和理解的目的将前述的发明通过举例说明和实施例的方式进行了较细致的描述，但应当明白在不偏离由下面的权利要求书所限定的本发明范围或精神的情况下可作一些改变和修改。序列表<110>Huang，Hung C.
Cheng，Kuo J.
Zantinge，Jennifer L.
Laroche，Andre J.<120>具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉菌株<130>37015<140>US<141>1998-07-10<150>US 60/052，278<151>1997-07-11<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述BglII-AFLP衔接子<400>1ctcgtggact gcgtac16<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述BglII-AFLP反向衔接子<400>2gatcgtacgc agtccac 17<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述MseI-AFLP衔接子<400>3gacgatgagt cctgag16<210>4<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述MseI-AFLP反向衔接子<400>4tactcaggac tcat 14<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述BglII-AFLP引物<400>5ggactgcgta cgatctnn 18<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述MseI-AFLP引物<400>6gatgagtcct gagtaan 1权利要求
1.一种具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉(Coniothyriumminitans)菌株的生物学纯培养物，其中所述的小盾壳霉菌株为a.具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉ATCC 74415或其突变体；b.具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉ATCC 74416或其突变体；c.具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉ATCC 74417或其突变体；d.具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉ATCC 74418或其突变体；e.具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉ATCC 74419或其突变体；f.具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉ATCC 74435或其突变体；或g.具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉ATCC 74436或其突变体。
2.一种制备具有β-葡聚糖酶活性的小盾壳霉菌株的方法，该方法包括以下步骤a.提供多个小盾壳霉74415细胞；b.将所述细胞暴露于紫外光辐射以诱变这些细胞；c.在培养基中或培养基上培养诱变细胞以产生多个小盾壳霉培养物；d.检测所述诱变细胞培养物的β-葡聚糖酶活性；e.从步骤(d)中回收具有β-葡聚糖酶活性的培养物。
3.权利要求2所述的方法，其中步骤(d)包括检测所述培养物的组成性β-葡聚糖酶活性，步骤(e)包括从步骤(d)中回收具有组成性β-葡聚糖酶活性的培养物。
4.权利要求3所述的方法，其中步骤(e)包括回收步骤(d)中具有至少10倍于步骤(a)中提供的小盾壳霉菌株组成性β-葡聚糖酶活性的培养物。
5.权利要求2所述的方法，其中步骤(d)包括检测所述培养物大麦β-葡聚糖水解活性、地衣多糖水解活性、昆布多糖水解活性或纤维素水解活性中的至少一种活性，步骤(e)包括回收步骤(d)中具有大麦β-葡聚糖水解活性、地衣多糖水解活性、昆布多糖水解活性或纤维素水解活性的培养物。
6.权利要求2所述的方法，其中步骤(d)包括检测所述培养物的内切-1，3-和内切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性，步骤(e)包括回收步骤(d)中较步骤(a)中提供的小盾壳霉菌株具有更高的内切-1，3-和内切-1，4-β-葡聚糖酶活性的培养物。
7.权利要求6所述的方法，其中步骤(e)包括回收步骤(d)中较步骤(a)中提供的小盾壳霉菌株具有至少高25％的内切-1，3-和内切-1，4-β-葡聚糖酶活性的培养物。
8.权利要求2所述的方法，其中步骤(d)包括同时检测每个诱变细胞培养物的β-葡聚糖酶活性。
9.权利要求2所述的方法，其中所述的步骤(c)中的培养基基本上不含可吸收的淀粉或糖类来源，并且含有可吸收的β-葡聚糖来源。
10.权利要求2所述的方法，其中所述的步骤(c)中的培养基包括可吸收的淀粉或糖类来源，并且基本上不含可吸收的β-葡聚糖来源。
全文摘要
制得了具有高水平β－葡聚糖酶活性的需氧真菌寄生性真菌小盾壳霉的菌株。优选菌株已保藏于美国模式培养物保藏中心,保藏号为74415、74416、74417、74418、74419、74435和74436。提供了诱变小盾壳霉74415和制备具有β－葡聚糖酶活性的菌株的方法。
文档编号C12N9/42GK1272880SQ98807117
公开日2000年11月8日 申请日期1998年7月10日 优先权日1997年7月11日
发明者黄鸿章, K·J·程, J·L·赞廷格, A·J·拉洛彻 申请人:加拿大农业及农业食品部