具有多拷贝目的基因和可筛选标记而不具选择性标记的产蛋白质细胞的制作方法

专利名称：：具有多拷贝目的基因和可筛选标记而不具选择性标记的产蛋白质细胞的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种构建不含有插入选择性标记基因的微生物多拷贝产蛋白质细胞的方法；通过该方法可获得的微生物多拷贝产蛋白质细胞；以及使用这种微生物多拷贝产蛋白质细胞生产目的蛋白质的方法。
背景技术：
：本领域描述了大量制备能够表达高产量目的蛋白质的微生物菌株的方法。这些方法通常是基于多拷贝菌株的构建，即该菌株含有多于一个拷贝的编码目的蛋白质的基因。这些多拷贝菌株通常按如下策略构建1)将一段序列导入微生物细胞的染色体中，由此使该细胞染色体含有DNA结构A-P-M-A，其中A表示同源DNA序列，P表示编码目的蛋白质的DNA序列，M表示编码选择性标记的DNA序列(如抗生素抗性)，2)在对选择性标记增加的选择压力下增殖所述细胞；3)鉴定通过同源序列A的同源重组获得了增加的抗性的细胞。构建的多拷贝菌株然后含有结构---A-P-M-A-P-M-A-P-M-A---专利US4959316，US5695976，US5733753和WO94/14968，描述了这些构建多拷贝菌株的方法，此外引入的参考提供了更多的细节。发明概述基于环境的考虑，在蛋白质工业生产中选择性标记尤其是抗生素抗性标记用于细胞中，在各种方法中不是优选的。因此，本发明要解决的问题是提供一种在实际多拷贝分离过程中不使用任何选择性标记的多拷贝细胞构建新方法，由此提供了获得不含有插入选释性标记基因，尤其是没有插入抗生素抗性标记基因的多拷贝细胞的可能性。问题的解决基于本发明人证实，可以使用可筛选蛋白质(screenableprotein)作为标记替代本领域中已知的使用选择性蛋白质(selectableprotein)作为标记来构建多拷贝菌株。因此，本发明第一部分涉及一种构建不含有插入选择性标记基因的微生物多拷贝产蛋白质细胞的方法，包括a)将一段序列导入微生物细胞的染色体中，由此使该细胞染色体含有DNA结构A-P-S-A，其中A表示同源DNA序列，P表示编码目的蛋白质的DNA序列，S表示编码可筛选蛋白质的DNA序列b)增殖所述细胞；c)筛选产生增加量的选择性蛋白质的细胞；以及c)回收c)所鉴定的细胞；以及任选地d)使用步骤d)中回收的细胞作为起始材料重复步骤b-d。术语“可筛选蛋白质”表示一种蛋白质不是细胞生长所必需的，即如果它被从细胞中去除，那么在类似的生长条件下，与所述细胞中包含可筛选蛋白质时相比，该细胞仍然能够以基本上相同的生长速率生长。一个合适的“可筛选蛋白质”可以是在适宜暴露下发荧光的蛋白质，比如绿色荧光蛋白质(GFP)或其变体(更多细节见下)。这一术语是与此处定义为“选择性蛋白质”的蛋白质相对应而言的；“选择性标记蛋白质”或“选择标记蛋白质”表示一种是细胞生长所必需的蛋白质，即如果它被从细胞中去除，那么那么在类似的生长条件下，与所述细胞中包含“选择性蛋白质”相比，该细胞将不能在以基本上相同的生长速率生长。这种“选择性标记蛋白质”通常可以是一种抗生素抗性蛋白质。因此，当一个细胞生长于含相应抗生素的培养基中时，细胞内抗生素抗性蛋白质的量可以基本上影响细胞的实际生长速率。术语“不含有插入选择性标记基因的多拷贝产蛋白质细胞”表示一个细胞不含有在制备多拷贝产蛋白质细胞过程中被插入细胞的选择性标记基因。本领域中制备含有这种插入选择性标记基因多拷贝产蛋白质细胞的已知方法的讨论见上述“背景”部分。术语“基因”表示编码具特异活性的多肽的DNA序列，即术语“选择性标记基因”表示编码具选择性标记活性的多肽的DNA序列。根据本发明的方法鉴定的多拷贝细胞，通过同源序列“A”的自发同源重组在染色体中获得了增加数目的可筛选蛋白质“S”基因。自发同源重组通常是相当稀有的事件。然而，通过根据本发明的方法筛选合适数量的细胞(优选多于105个细胞)，本发明人证实可以鉴定出这种细胞。根据本发明所最终构建的多拷贝细胞，含有---A-P-S-A-P-S-A-P-S-A---结构，由此含有多拷贝的目的蛋白质“P”。根据本发明的方法制备的多拷贝细胞的一个好处是，它不含有插入的选择性标记基因“M”(本领域中已知方法的描述见“背景”部分，其中最终构建的多拷贝细胞的特征是含有这种插入的选择性标记基因)。这些基因特别是抗生素抗性基因的存在，从环境角度和产品获准角度考虑是不希望有的。本发明的第二部分涉及通过本发明的任一种方法可获得的微生物多拷贝产蛋白质细胞，其特征是该细胞含有多拷贝表达的目的蛋白质的基因(“P”)和表达可筛选蛋白质的基因(“S”)。术语“多拷贝表达目的蛋白质的基因(“P”)”表示所述细胞含有至少2个拷贝的表达该目的蛋白质的基因；更优选所述细胞含有至少4个拷贝表达该目的蛋白质的基因；最优选所述细胞含有至少7个拷贝表达该目的蛋白质的基因。术语“多拷贝表达可筛选蛋白质的基因(“S”)”表示所述细胞含有至少2个拷贝的表达该可筛选蛋白质的基因；更优选所述细胞含有至少4个拷贝表达该可筛选蛋白质的基因；最优选所述细胞含有至少7个拷贝表达该可筛选蛋白质的基因。本发明的第三部分涉及在微生物细胞中产生至少一个目的蛋白质基因的方法，方法包括1)在许可产生目的蛋白质的条件下培养的根据权利要求9)微生物多拷贝产蛋白质细胞；及2)从获得的培养液或微生物多拷贝产蛋白质细胞中回收该目的蛋白质。本发明的实施方案仅通过实施例描述如下。附图这些图显示了根据本发明，在工作实施例1和工作实施例2中，通过构建微生物多拷贝产蛋白质细胞的方法，制备多拷贝产蛋白质细胞时使用的质粒。随后在实施例1和实施例2中提供了对该质粒的更多描述。发明详述将序列导入微生物细胞的染色体中以使细胞染色体含有DNA结构A-P-S-A将序列导入微生物细胞的染色体中以使细胞染色体含有DNA结构A-P-S-A(步骤a))可以通过本领域中已知的将含有A-P-M-A(“M”是选择性标记基因)结构的DNA结构构建到微生物细胞染色体中的类似策略进行。将这种DNA结构构建到微生物细胞染色体中可以进行如下，将含有结构A-P-S-A，或更优化含有结构A-P-S的载体，导入微生物细胞，随后该结构整合入该微生物细胞的染色体中。或可以以类似的方法将一个含有可筛选蛋白质“S”的DNA片段直接导入已含有A-P-A结构的染色体中，以在染色体上产生DNA结构A-P-S-A。对本领域中的技术人员来说，选择一个特别合适的策略将A-P-S-A结构导入微生物细胞的染色体中是常规工作。WO94/23073，US5695976，US5733753，和US4959316非常详尽地描述了这些策略，这些文献此处引入作为将这种DNA结构导入微生物细胞染色体的详细描述。再者，此处的工作实施例描述了合适策略的例子(见下文)。另外，术语“将序列导入微生物细胞的染色体中以使细胞染色体含DNA结构A-P-S-A”可以定义为“将含有结构A-P-S-A的DNA构造导入微生物细胞的染色体中”。筛选产生增加量的可筛选蛋白质的细胞根据本发明为了鉴定多拷贝细胞，优选筛选大量细胞。优选(在步骤c)中)至少筛选105个细胞，更优选筛选至少106个细胞，以及更优选筛选107至少个细胞。在本发明的一个实施方案中，在步骤c)中的可筛选蛋白质是一种在合适暴露下发荧光的蛋白质，该荧光蛋白质特别是绿色荧光蛋白质(GFP)或其变种。本领域描述了绿色荧光蛋白质(GFP)或其变种在本领域中已有描述，更多细节见Crameri等，NatureBiotechnology14315-319(1996)；Cormack等，GENE17333-38(1996)；WO97/11094。GFP在合适曝光下发荧光。另一例可供选择的合适的可筛选蛋白质是β-半乳糖苷酶，可以根据本领域已知方法，用合适的发荧光酶底物检测它。筛选可以使用任何可测定荧光蛋白质量的标准筛选系统进行。基于实施这一方法的高筛选能力和商业上可获得的仪器，优选使用具细胞分选能力的流式细胞计通过已知的流式细胞计技术进行步骤C)的筛选(Cormack等，“FACS-优化的绿色荧光蛋白质(GFP)突变体”GENE17333-38(1996))。这种流式细胞计的一个例子是BectonDickinsonand公司生产的FACSCalibur流式细胞计。因此，在本发明进一步的实施方案中，通过使用有细胞分选能力的流式细胞计完成步骤c)的筛选，筛选具增加量的发荧光可筛选蛋白质的细胞，此处该发荧光蛋白质特别是绿色荧光蛋白质(GFP)或其变种，在筛选过程中，GFP或其变种在合适的曝光下发出荧光。在本发明更进一步的实施方案中，本发明的微生物细胞是细菌细胞，特别地此处该细菌细胞是芽孢杆菌属(Bacillus)的细胞，特别是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，缓慢芽孢杆菌(Bacilluslentus)，短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)，嗜热芽孢杆菌(Bacillusstearothermophus)，嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophlus)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)，环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)，灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，幽闭芽孢杆菌(Bacillusclausii)或地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenifomis)的细胞。在本发明更进一步的实施方案中，目的蛋白质(步骤a)中的“P”)是一种酶，特别是蛋白质酶，脂酶，淀粉酶，半乳糖苷酶，支链淀粉酶(pullanase)，纤维素酶，葡萄糖异构酶，蛋白质二硫键异构酶，环化糊精葡萄糖基转移酶(CGTase，cyclodextringluconotransferase)，肌醇六磷酸酶，葡萄糖氧化酶，葡糖基转移酶，漆酶，或木聚糖酶。根据本发明的任何方法可获得的微生物多拷贝产蛋白质细胞如上所述，该多拷贝产蛋白质细胞的特点是含有多个拷贝的表达目的蛋白质(P)的基因和多个拷贝表达可筛选蛋白质(“S”)的基因。如上所进一步显示的，该多拷贝产蛋白质细胞进一步的特征是它不含有在制备多拷贝产蛋白质细胞过程中插入细胞的选择性标记基因。在微生物细胞中产生至少一个目的蛋白质的方法培养微生物多拷贝产蛋白质细胞的培养基可以是任何传统的适于所研究的细胞生长的培养基。表达的目的蛋白质可常规地分泌到培养基中，然后通过众所周知的方法从中回收，包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，通过硫酸铵等盐沉淀蛋白质性物质，接着通过诸如离子交换层析，亲和层析等层析方法分离蛋白质。本发明通过下面的非限制性实施例作进一步说明。再者，该申请要求优先权的丹麦专利申请DK0792/97的内容，和伴随该申请的摘要此处引入作为参考。材料和方法普通分子生物学方法除非另外提及，DNA操作和转化按照标准的分子生物学方法进行(Sambrook等，(1989)分子克隆---实验手册，冷泉港实验室，冷泉港NY；Ausubel，F.M.等(eds)，“currentprotocolsinMolecularBiology”.JohnWileyandSons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(eds)，芽孢杆菌的分子生物方法.JohnWileyandSons1990).除非另外提及，PCR操作使用标准方法和PCR反应数据进行，可参见例如教科书(PCR实用方法IRL出版社，(1991))。DNA操作所用的酶根据供应商的说明等使用。DNA操作所用的酶除非另外提及，所有的酶，例如限制性内切酶，连接酶等，均获自新英格兰Biolabs公司。流式细胞计流式细胞术使用BectonDickinson公司生产的FACSCalibur流式细胞计进行。在FACSCalibur流式细胞计上根据供应商的指导，例如1996年8月的FACSCaliburTM系统用户指导的描述进行流式细胞术。流式细胞术术语学依该FACSCaliburTM系统用户指导使用。培养基TY，BPX和LB琼脂已在EP0506780中描述，LBPSG琼脂是添加了磷酸盐(0.01MK3PO4)，葡萄糖(0.4％)和淀粉(0.5％)的LB琼脂。实施例1含有可扩增盒的细菌菌株的构建，该盒包含有经典的抗生素抗性标记基因，和编码绿色荧光蛋白的可筛选基因。质粒的构建A)pSJ2773美国专利57333753描述了质粒pSJ2059和它作为产生插入地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenifomis)的amyL位点的基因扩增的工具。为使质粒能通过接合而转移，质粒pUB110的oriT区被插入pSJ2059以产生质粒pSJ2773(图1)。如WO96/23073所描述的，pUB110的转移依赖于位于5’到(orfβ)的顺式作用区oriT(Selinger，L.B.，McGroger，N.F.，Khachatourians，G.G.，和Hynes，M.F.(1990)等，通用芽孢杆菌质粒pXO503密切相关的质粒pUB110和pBC16的转移需要反式作用开放读框β.J.Bacteriol.，172，3290-3297)。使用引物LWN5232和LWN5233进行PCR扩增pUB110序列中pos.1020到pos.1575的550bp的片段(McKenzie，T.，Hoshino，T.，Tanaka，T.，Sueoka，N.(1986).pUB110的核苷酸序列一些突出的与复制和其调节有关特征.Plasmid，15，93-103)。LWN52325’-GTCGGAGCTCATTATTAATCTGTTCAGCAATCGGGC-3’LWN52335，-GTCGGAGCTCTGCCTTTTAGTCCAGCTGATTTCAC-3’扩增的片段用SacI酶消化，先克隆到大肠杆菌质粒(pUC19衍生物)的SacI位点。接着又用SacI酶切下该片段，克隆到pUC19衍生物pDN3000SacI位点(Diderchsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjoholm，C.(1990).编码一个从短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)来的胞外酶，乙酰乳酸脱羧酶的aldB的克隆J.Bacteriol.，172，4315-4321)上，得到pSJ2742(图2)。然后OriT片段被从质粒pSJ2742上以0.5kb的BamHI-BglII片段切下，连接到BamHI酶消化的pSJ2059质粒上，连接混合物转化入枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DN1885的感受态细胞中，在30℃筛选对红霉素(5μg/ml)和卡那霉素(10μg/ml)的抗性。获得的一个转化体是含有pSJ2773的SJ2773。B)pSJ4574如WO97/11094所述获得编码“F64L-S65T-GFP”，一个绿色荧光蛋白突变品种的基因。该基因是使用引物#109563和#128360经PCR扩增的。#1095635’-GACTGCATGCGGGGAGGAGAATCATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’#1283605’-CGTGAATTCGAGCTCTGCAGATCCCTTTAGTGTCAATTGG-3’用EcoRI和BspHI酶消化PCR扩增的片段。使用从解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因amyQ的启动子和核糖体结合位点以使“F64L-S65T-GFP”的编码基因得以表达，使用引物LWN8741和LWN8742从解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)染色体DNA上通过PCR扩增amyQ启动子。LWN87415’-GTCACTGATCAATCGATTGTTTGAGAAAAGAAG-3’LWN87425’-GTCACTCATGAGTTTCCTCTCCCTCTC-3’用BclI和BspHI酶消化获得的PCR片段，将该片段克隆到pUB110衍生的芽孢杆菌(Bacillus)载体上。对插入片段进行测序，发现该序列与发表的amyQ启动子序列一致(Palva，I.，Pettersson，R.F.，Kalkkinen，N.，Lehtovaara，P.，Sarvas，M.，Soderlund，H.，Takkinen，K.，Kaariainen，L.(1981)解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因启动子和NH2-未端的信号肽区的核苷酸序列。Gene15，43-51)。接着再将启动子现在以ClaI-BspHI片段从这个载体上切下。用AccI和EcoRI酶消化克隆载体pUC19，载体片段在三片段连接中与含amyQ启动子的ClaI-BspHI片段及含有“F64L-S65T-GFP”编码基因的BspHI-EcoRI片段相连接。用此连接混合物转化大肠杆菌SJ2(Diderichsen等，1990)获得的转化体具很强的绿色荧光。其中一个转化体是含有pSJ4574的SJ4574。C)pSJ4621通过下列步骤将从amyQ启动子表达的“F64L-S65T-GFP”编码基因插入到扩增载体质粒pSJ2773中(i)用HindIII和AflIII酶消化pSJ2773质粒，纯化3.95bp的片段。(ii)用AflIII和EcoRI酶消化pSJ2773质粒，纯化4.25bp的片段。(iii)用EcoRI和HindIII酶消化pSJ4574质粒，纯化1.0bp的片段。连接三个纯化的片段，将混合物转化到枯草芽孢杆菌(B.subtilis)DN1885中，在30℃选择对卡那霉素(10μg/ml)和红霉素(5μg/ml)的抗性。保存的两个发荧光的转化体是含有pSJ4621的SJ4621菌株(图4)和含有pSJ4622的SJ4622菌株。接合供体菌株的构建将如WO96/23073实施例4所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株PP289-5制成感受态并用质粒pSJ4621(得到菌株SJ4623和SJ4624)和pSJ4622(得到菌株SJ4625和SJ4626)转化。在含有D-丙氨酸(100μg/ml)的平板上在30℃选择对红霉素(5μg/ml)和四环素(5μg/ml)的抗性。质粒向地衣芽孢杆菌(Blichenifomis)的转移菌株SJ4623和SJ4625被用作接合过程的供体菌株以将扩增质粒载体转入地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenifomis)受体菌株中，接合过程基本上按WO96/23073所述进行。这些受体菌株含有一个染色体拷贝的α-淀粉酶基因amyL。获得的转化接合子具有对红霉素(5μg/ml)和卡那霉素(10μg/ml)的抗性，转化接合子菌落的绿色荧光显示出表达了F64L-S65T-GFP基因。扩增盒的染色体整合将转化接合子菌落在含红霉素(10μg/ml)的LBPSG平板上划线，在50℃培养，长出扩增载体质粒整合入染色体的菌落。然后将这些50℃平板上的单菌落接种到不含抗生素的TY培养基(10ml)中，在30℃生长过夜，以使质粒复制恢复，结果是质粒从染色体上的最终切除，在缺少选择压力的情况下，切下的质粒将从细胞中丢失。重复一次在不含抗生素的TY培养基中的生长，将细胞涂布于含卡那霉素(10μg/ml)的平板上。这些细胞然后影印涂布于含红霉素(5μg/ml)的平板上，分离出具卡那霉素抗性而对红霉素敏感的菌落。这些菌落一些天后表现出明显的绿色荧光。具有几个基因拷贝的菌株的分离从上述构建的菌株中分离含有多个拷贝编码α-淀粉酶，“F64L-S65T-GFP”和卡那霉素抗性基因的地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenifomis)菌株。这些菌株是在生长培养基中存在的卡那霉素浓度增加时，通过前面描述的增殖方法分离的，该方法筛选的存活菌株具有多个基因拷贝(见US5,733,753)。因此，筛选的是能在10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml，40μg/ml，50μg/ml，100μg/ml和200μg/ml时生长的菌株。测定所获菌株在摇瓶培养中的淀粉酶产量。同时测定这些培养物细胞“F64L-S65T-GFP”蛋白质的细胞含量，建立起卡那霉素抗性，α-淀粉酶产量和细胞荧光的相关性。在本发明的实验程序中，分离具有多个基因拷贝的菌株的方法不依赖于基于卡那霉素抗性基因的直接存活选择，而依赖于对较一般细胞显示出更高细胞荧光的细胞的物理分离。如果细胞含有的“F64L-S65T-GFP”表达基因的拷贝数增加，该细胞就会具有较高的细胞荧光，因而这种方法就会使具有多个基因拷贝的细胞得以分离。如果用作多基因拷贝细胞分离起点的细胞中不存在抗生素抗性标记基因，那么获得的细胞将含有多拷贝的目的基因(如淀粉酶基因)，以及“F64L-S65T-GFP”编码基因，但是不含有抗生素抗性基因。更多细节见此文实施例2后一部分(见后)。依照如上描述的实验程序，构建这种细胞的方法是使用一种扩增载体质粒，其中的卡那霉素抗性基因处于位点专一性重组酶识别位点，如质粒pAMbetal的res位点的侧翼。一旦细胞获得整合的扩增盒(由卡那霉素抗性，F64L-S65T-GFP的表达和红霉素抗性的缺失显示)，就通过将编码pAMbetal解离酶蛋白的载体导入细胞来去除卡那霉素抗性基因。WO96/23073详细描述了使用res位点和解离酶介导整合的抗生素抗性标记基因去除的技术。构建这种细胞的另一个方法在下面的实施例2中描述。实施例2内含扩增盒具有编码绿色荧光蛋白的可筛选基因，而不具抗生素抗性标记基因的扩增盒的细菌菌株的构建这个实施例中的策略是构建一个扩增载体质粒，其中无启动子的GFP基因紧随插入在解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)amyL基因编码序列的下游，再接着是一个拷贝的amyL启动子区。质粒构建A)pSJ4284和pSJ4285使用引物#109561和#109562通过PCR从解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)染色体DNA扩增编码AmyLC-未端部分的一个大约400碱基对的amyL基因的片段。#1095615’-GACTGAATTCCAAACATGGTTTAAGCC-3’#1095625’-GACTAAGCTTGGATCCGCATGCCTATCTTTGAACATAAATTG-3’扩增的片段用EcoRI和HindIII酶消化，连接到EcoRI和HindIII酶消化的质粒pUC19上，产生质粒pSJ4284和pSJ4285(图5)。B)pSJ4286和pSJ4285使用引物#109564和#109565通过PCR从解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)染色体DNA扩增从紧接着amyL基因编码区下游起始的大约200碱基对的一个片段。#1095645’-GACTGAATTCGGATCCGCAGAGAGGACGGATTTCC-3’#1095655’-GACTAAGCTTCGATACCGTCATTTTCG-3’扩增的片段用EcoRI和HindIII酶消化，连接到EcoRI和HindIII酶消化的质粒pUC19上，产生pSJ4286和pSJ4287(图6)。C)pSJ4294和pSJ4295这些质粒(图6)通过将从pSJ4286切下的0.2kb的BamHI-HindIII片段插入BamHI+HindIII消化的质粒pSJ4285而创建。C)pSJ4313和pSJ4314编码“F64L-S65T-GFP”的基因。使用引物#109563和#18842通过PCR扩增该基因。#1095635’-GACTGCATGCGGGGAGGAGAATCATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’#188425’-CGTGCTCGAGAATTCGGATCCCTTTAGTGTCAATTGG-3’扩增的片段用BamHI和SphI酶消化，连接到BamHI+SphI酶消化的质粒pSJ4295上，产生质粒pSJ4313和pSJ4314(图8)。E)pSJ4530应用下列步骤构建实际的扩增载体质粒(i)用BglII和HindIII消化PSJ1985(见US5,737,753，实施例1和图4所描述)，分离1.7kb的片段。(ii)用BamI和HindIII消化pSJ4313，分离3.9kb片段。(iii)将这两个片段然后混合起来并连接，连接混合物然后EcoRI和HindIII酶消化，从琼脂糖凝胶电泳中分离2.9kb的片段。(iv)然后将分离的片段连接到PSJ2739(见WO96/23073，实施例6所描述)的5.4kb的EcoRI-HindIII片段上，连接混合物转化进枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DN1885菌株中，在30℃选择红霉素(5μg/ml)。如此分离到含有质粒pSJ4530(图9)的菌株SJ4530。接合供体菌株的构建将如WO96/23073实施例4所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株PP289-5被制成感受态并用质粒pSJ4530转化，得到菌株SJ4541和SJ4542。在含有D-丙氨酸(100μg/ml)的平板上在30℃筛选对红霉素(5μg/ml)和四环素(5μg/ml)的抗性。质粒向地衣芽孢杆菌(B.lichenifomis)的转移菌株SJ4541和SJ4542被用作接合过程的供体菌株以将扩增载体质粒转入地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenifomis)受体菌株中，接合过程基本上按WO96/23073所述进行。这些受体菌株含有一个染色体拷贝的α-淀粉酶基因amyL。获得的转化接合子具有对红霉素(5μg/ml)的抗性。扩增盒染色体整合将转化接合子菌落在含红霉素(5μg/ml)的LBPSG平板上划线，在50℃培养，长出扩增载体质粒整合入染色体的菌落。然后将这些50℃平板上的单菌落接种到不含抗生素的液体生长培养基中，在30℃增殖，以使质粒复制恢复，结果是质粒从染色体上的最终切除，在缺少选择压力的情况下，切下的质粒将从细胞中丢失。在此过程中发生了所需的重组事件，即Amy-LC-未端编码区的整合和在更下游区的切除(或相反)，这些细胞含有紧随amyL基因编码区的下游插入的F64L-S65T-GFP基因，能够基于F64L-S65T-GFP蛋白质的表达而鉴定。这些细胞传统上使用具细胞分选功能的流式细胞计，比如FASCalibur流式细胞计从其他细胞中分离出。具有几个基因拷贝的菌株的分离从如上构建的菌株中分离含有几个拷贝的编码α-淀粉酶和F64L-S65T-GFP基因的地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenifomis)菌株。以如上构建的菌株作为起始培养物在F64L-S65T-GFP可以表达的生长培养基中增殖。从培养物中取样，适当稀释，通常至5×105和5×106细胞/毫升之间。在FASCalibur流式细胞计上分析稀释的样品，其中颗粒由氩离子激光器在488nm处的暴露明。调整FASCalibur流式细胞计以便能够根据其前向光散射(FSC)，侧向光散射(SSC)，和在大约530nm处绿色/黄绿荧光(FL1)信号检测细胞。以FSS或SSC为一轴，FL1为另一轴建立点图。相应于比普通细胞具较高FL1荧光的细胞建立起分选门(sortgate)，而带有的流式细胞计信号在这个分检门内的细胞被从全部细胞群中分选出。将分选出的细胞涂布于LBPSG平板上，在37℃培养1-2天。将细胞刮去平板上并收集。这构成了新的中间细胞群。使用新的中间细胞群作为起始材料，整个增殖过程，具有将FL1荧光比普通细胞较高的细胞分选出能力的流式细胞术，培养分选出的细胞以产生另一个中间细胞群体，重复一定次数直至用FASCalibur流式细胞计可测出比起始培养物具显著高的FL1细胞荧光的细胞群。从这些比起始培养物具显著高的FL1细胞荧光的细胞群体中分选细胞，在LBPSG平板上涂板，在37℃培养1-2天，分离单菌落。在允许α-淀粉酶和F64L-S65T-GFP表达的生长培养基中培养菌株，单菌落与原起始培养物比较。当FASCalibur上测定的FL1细胞荧光和α-淀粉酶产量都比原起始培养物增加时，就获得了含有几个基因克隆的菌株。权利要求1.一个构建不含有插入选择性标记基因的微生物多拷贝产蛋白质细胞的方法，包括a)将一段序列导入微生物细胞的染色体中，由此使该细胞染色体含有DNA结构A-P-S-A，其中A表示同源DNA序列，P表示编码目的蛋白质的DNA序列，S表示编码可筛选蛋白质的DNA序列b)增殖所述细胞；c)筛选产生增加量的选择性蛋白质的细胞；以及d)回收c)所鉴定的细胞；以及任选地e)使用步骤d)中回收的细胞作为起始材料重复步骤b-d。2.根据权利要求1的方法，其中该可筛选蛋白质是在合适暴露下发荧光的蛋白质。3.根据权利要求2的方法，其中该发荧光蛋白质是绿色荧光蛋白(GFP)或其变种。4.根据权利要求2或3的方法，其中的筛选步骤C)是通过使用具细胞分选能力的流式细胞计，筛选发荧光可筛选蛋白质的量增加的细胞进行的。5.根据权利要求4的方法，其中该发荧光蛋白质是绿色荧光蛋白(GFP)或其变种，在筛选步骤中，在合适的暴露下使GFP或其变种发出荧光。6.根据权利要求1-5的任意方法，其中该微生物细胞是细菌细胞。7.根据权利要求6的方法，其中的细菌细胞是芽孢杆菌(Bacillus)属的细胞，特别是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，缓慢芽孢杆菌(Bacilluslentus)，短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)，嗜热芽孢杆菌(Bacillusstearothermophus)，嗜碱芽孢杆菌(Baci′lusalkalophlus)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)，环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)，灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，幽闭芽孢杆菌(Bacillusclausii)或地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenifomis)的细胞。8.前述任何权利要求的方法，其中该目的蛋白质是一种酶，特别是蛋白质酶，脂酶，淀粉酶，半乳糖苷酶，支链淀粉酶，纤维素酶，葡萄糖异构酶，蛋白质二硫键异构酶，环化糊精葡萄糖基转移酶(CGTase，cyclodextringluconotransferase)，肌醇六磷酸酶，葡萄糖氧化酶，葡糖基转移酶，漆酶，或木聚糖酶。9.根据权利要求1-8任何方法可获得的微生物多拷贝产蛋白质细胞，其特征是该细胞含有多个拷贝表达目的蛋白质(“P”)的基因和多个拷贝表达可筛选蛋白质(“S”)的基因。10.在微生物细胞中产生至少一个目的蛋白质的方法，这一方法包括(i)在允许目的蛋白质产生的条件下培养根据权利要求9的微生物多拷贝产蛋白质细胞；以及(ii)从获得的培养液或微生物的多拷贝产蛋白质细胞中回收该目的蛋白质。全文摘要一个构建不含有插入选择性标记基因的微生物多拷贝产蛋白质细胞的方法;由此法获得的微生物多拷贝产蛋白质细胞;以及用该微生物多拷贝产蛋白质细胞产生目的蛋白的方法。文档编号C12N15/90GK1261918SQ9880687公开日2000年8月2日申请日期1998年7月2日优先权日1997年7月3日发明者斯蒂恩·T·乔根森,基姆·B·佩德森申请人:诺沃挪第克公司