专利名称：向横纹肌中转移核酸的改进方法和用于实施该方法的组合的制作方法
技术领域：
本发明涉及向横纹肌中体内转移核酸或与提高转移效率的物质结合之核酸的显著改善的方法，还涉及用于基因治疗应用的核酸与本发明转移方法的组合。
基因向特定细胞中的转移是基因治疗的基础。然而，一个问题是向待处理的宿主细胞中引入足量的核酸；实际上该核酸(一般为目的基因)应在转染的细胞中表达。在此方面采用的一种方法是核酸在病毒载体中、尤其在反转录病毒、腺病毒或腺伴随病毒中的整合。这些系统利用病毒发展的细胞侵入机制，以及对抗降解的保护。然而，该方法也存在问题。特别是产生易于在宿主生物中传播的传染性病毒颗粒的危险，以及对于反转录病毒载体而言，插入诱变的危险。此外，治疗性基因或疫苗基因在病毒基因组中的插入能力仍然是有限的。
在任何情况下，要发展可用于基因治疗的病毒载体必需借助于缺陷病毒及互补细胞系的复杂技术。
另一种方法(Wolf等人，科学(Science)247，1465-68，1990；Davis等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93，7213-18，1996)包括向肌肉或血流中施用一种质粒型核酸，无论其是否与利于其转染的化合物连接，如蛋白质、脂质体、荷电脂或阳离子聚合物如聚乙烯亚胺，它们是很好的体外转染剂(Behr等人，美国国家科学院院报86，6982-6，1989；Felgner等人，美国国家科学院院报84，7413-7，1987；Boussif等人，美国国家科学院院报92，7297-301，1995)。
自从Wolff等人的最初发表内容显示肌肉组织中摄入以游离质粒形式注射的DNA的能力(Wolf等人，科学(Science)247，1465-68，1990)，许多研究者设法改进该方法(Manthorpe等人，1993，人类基因治疗(Human Gene Ther.)4，419-431；Wolff等人，1991，生物技术(BioTechniques)11，474-485)。从这些试验中已显现某些趋势，特别是·机械手段的应用，其通过将DNA吸附于球上然后推动至组织(“基因枪”)使DNA进入细胞内(Sanders Williams等人，1991，美国国家科学院院报88，2726-2730；Fynan等人，1993，生物技术11，474-485)。已证明这些方法在接种策略中是有效的，但只接触表面组织层。对于肌肉而言，其应用需要外科方法来提供与肌肉的接近，因为颗粒不能穿过皮肤组织；·DNA的注射，其不再为游离质粒形式，但与能用作载体的分子连接，以利于复合物进入细胞。在其它许多转染方法中使用的阳离子脂迄今为止已清楚在对肌肉的应用中是令人失望的，因为那些已试验的脂证明抑制转染(Schwartz等人，1996，基因治疗(Gene Ther.)405-411)。对于阳离子肽和聚合物同样如此(Manthorpe等人，1993，人类基因治疗4，419-431)。有利组合的唯一例子似乎是聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮与DNA的混合物。这些组合产生的增强相对于裸DNA注射只达到10倍以下(Mumper等人，1996，药物研究(Pharmaceutical Research)13，701-709)；·对注射溶液的组织的预处理，试图增强DNA扩散和/或稳定性(Davis等人，1993，人类基因治疗4，151-159)或促进核酸的进入，例如，细胞增殖或再生现象的诱导。该处理尤其涉及局部麻醉剂或心脏毒素、血管收缩剂、内毒素或其它分子的应用(Manthorpe等人，1993，人类基因治疗4，419-431；Danko等人，1994，基因治疗1，114-121；Vitadello等人，1994，人类基因治疗5，11-18)。这些预处理方案难以控制，尤其是丁哌卡因，为了有效必须以非常接近致死剂量的浓度使用。试图增强扩散的高渗蔗糖的预注射不能提高肌肉中的转染水平(Davis等人，1993)。
电穿孔，或者用来透化细胞的电场的应用，通常在体外使用以促进培养细胞中的DNA转染。但迄今认为该现象的产生依赖于一种阈值依赖性效应，而且对于动物细胞，在大约800-1200伏特/cm的相对高强度的电场下才能观察到电透化作用。也建议在体内进行该技术，以便增强抗肿瘤剂如博来霉素在人实体瘤中的效能(美国专利号5,468,228，L.M.Mir)。应用极短持续时间(100微秒)的脉冲，这些电条件(800-1200伏特/cm)很好地适用于小分子的细胞内转移。应用这些条件(100微秒的脉冲)不引起核酸向肝脏中体内转移的增强，与无电脉冲时的DNA注射相比，证明低于1000伏特/cm的电场完全无效甚至是抑制性的(专利WO 97/07826和Heller等人，FEBSLetters，389，225-8，1996)。
此外，对于体内应用，该技术存在困难，因为如此强度的电场的使用能引起或多或少的组织损伤，这在肿瘤组织的治疗中不是一个问题，但当向非肿瘤组织的组织中、尤其是向横纹肌中施用核酸时就可能是一种主要缺点。
尽管引用的所有研究提到需要高电场(大约1000伏特/cm)才能在体内有效，但最意外地和引人注目地，申请者现在证明，通过对组织施以低强度(如100-200伏特/cm)及相对长持续时间的电脉冲，充分提高了核酸向组织中的体内转移，而没有不当的影响。此外，申请者发现，根据本发明的方法显著降低了在DNA向肌肉中转移的现有技术中观察到的转基因表达的高变异性。
因此，本发明涉及一种向横纹肌中进行体内核酸转移的方法，其中通过向组织中直接施用或通过局部或全身施用使肌肉细胞接触待转移的核酸，并且通过对所述肌肉施加一次或多次强度为1-800伏特/cm的电脉冲来确保转移。
优选地，场强在4-400伏/cm之间，施加的总持续时间大于10毫秒。所用的脉冲数例如为1-100000个脉冲，脉冲频率在0.1-1000赫兹之间。优选脉冲频率在0.2-100赫兹之间。还可以以不规则的方式发送脉冲，描述场强随时间变化的函数可以是可变的。例如，发送的电场可以是如下组合的结果强度＞400V/cm(优选500-800V/cm之间)、单位持续时间短(＜1msec)的至少一个电场，接着是一个或多个较弱强度(例如＜400V/cm，优选＜200V/cm)、单位持续时间较长(＞1msec)的脉冲。描述场强随时间变化的函数的积分大于1kV×msec/cm。根据本发明的一个优选方案，该积分大于或等于5kV×msec/cm。
根据本发明的一种优选实施方案，脉冲的场强为30-300伏特/cm。
电脉冲选自方波脉冲、产生指数衰减波、短时振荡单极波、短时振荡双极波或其它波形的电场。根据本发明的一种优选实施方案，电脉冲为方波脉冲。
可通过本领域已知的任何方法来进行电脉冲的施用，例如·置于待处理的组织两侧的外部电极系统，特别是，与皮肤接触的非侵入性电极，·植入组织中的电极系统，·支持核酸和电场的同时施用的电极/注射器系统。
在本发明范围内，术语“应用一个或多个电脉冲的DNA或核酸转移”、以及术语“电转移”或“电转染”应认为是等同的，都指通过施加电场或在电场存在下核酸或DNA的转移。
对于体内进行的施用，有时必须借助于中间产物以确保非侵入性外部电极的电连续性。例如，这包括一种凝胶形式的电解质。
核酸能通过任何合适的方法施用，但优选地是直接向肌肉中体内注射，或通过另一种局部的或全身的途径施用，该途径使核酸出现在施加电场的部位。如前所述，可用容许或有利于转移的试剂施用核酸。特别地，这些核酸可游离于溶液中或与合成试剂连接或由病毒载体携带。合成试剂可以是专业人员所知的脂类或聚合物，乃至使在靶组织膜上的固定成为可能的导向元件。在这些元件中，可提及携带糖、肽、抗体或激素受体。
可以想象，在本发明的这些条件下，核酸的施用可以先于、同时乃至晚于电场的施加。
因此本发明也涉及一种核酸和一种强度为1-800伏特/cm的电场的组合产品，体内向横纹肌中同时、分开或时间上交错地施用。场强优选地为4-400伏特/cm，更优选地，场强为30-300伏特/cm。
根据本发明的方法可用于基因治疗，即，其中转移基因的表达且基因的调节或阻断可以确保特定疾病的治疗。
优选地以基因治疗为目的处理肌肉细胞，它使以下方面成为可能·肌细胞自身功能异常的矫正(例如，用于与遗传缺陷有关的肌疾病)；·转基因产生的营养因子、神经营养因子和血管生成因子，对肌肉和其他肌肉或器官的血管形成或神经分布的保护和/或再生；·肌肉向分泌器官的转化，该器官分泌导致治疗效果的产物，如基因自身的产物(例如，血栓形成和止血调节因子、营养因子、激素如胰岛素等等)，或者如通过加入治疗性基因在肌肉中合成的活性代谢物；或·疫苗或免疫刺激剂的应用。
本发明的另一个目的在于将电场的电脉冲与为了任意施用方式而配制的含有核酸的组合物相结合，使之可以通过局部、皮肤、口、阴道、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼内、经皮途径等进入横纹肌。优选本发明的药物组合物含有一种药学可接受的载体，其用于可注射的制剂，特别是，用于对希望的器官直接注射，或者用于其它任何施用方式。它尤其可包括无菌等渗溶液或干燥的特别是冻干的组合物，视情况而定，在后者中加入无菌水或生理血清可产生可注射溶液。用于注射的核酸剂量以及施用次数和注射体积适应于不同的参数，特别适应于施用方法、有关病理学、待表达的基因乃至寻求的治疗持续时间。
核酸可以是合成或生物合成来源的，或者从病毒或原核细胞或源于单细胞生物(例如酵母)或多细胞生物的真核细胞中提取。它们可完全地或部分地与来源生物和/或合成系统的成分一起施用。
核酸可以是脱氧核糖核酸或核糖核酸。它可包括天然或人工来源的序列，特别是基因组DNA、cDNA、mRNA、tRNA和rRNA、杂交序列或合成或半合成的寡核苷酸序列，无论修饰与否。这些核酸的获得可通过专业人员已知的任何方法，特别是通过筛选文库、通过化学合成乃至通过混合方法，包括经筛选文库获得的序列的化学或酶修饰。它们可被化学修饰。
特别地，核酸可以是有义或反义的或具有催化性质的DNA或RNA，如核酶。“反义”是指一种核酸具有与靶序列互补的序列，例如，通过与靶序列杂交而阻断其表达的mRNA序列。“有义”是指一种核酸具有与靶序列同源或相同的序列，例如，与蛋白质转录因子连接并且参与特定基因表达的序列。根据一种优选实施方案，核酸含有一种目的基因和支持该目的基因表达的元件。核酸片段便利地为质粒的形式。
脱氧核糖核酸可以是单链或双链，如短寡核苷酸或较长的序列。它们可携带治疗性基因、调节转录或复制的序列或与其它细胞成分结合的区域，等等。根据本发明，“治疗性基因”特别是指编码一种RNA或编码一种具有治疗效果的蛋白质产物的任何基因。编码的蛋白质产物可以是蛋白质、肽，等等。该蛋白质产物可与靶细胞同源(即，当不表现病理时在靶细胞中正常表达的产物)。在此情况下，例如，转基因表达可能克服细胞中的不充分表达或由于修饰引起的无活性或弱活性蛋白质的表达，或者也可能超量表达该蛋白质。治疗性基因也可编码具有提高的稳定性、改进的活性等的细胞蛋白质突变体。此蛋白质产物同样可与靶细胞异源。在此情况下，例如，表达的蛋白质可以完善或引入一种在细胞中缺陷的活性(肌病或酶缺陷的治疗)，或者有可能对抗一种病理，或者刺激免疫应答。
在本发明意义下的治疗性产品中，更特别地可以举出编码下列产品的基因-酶，如α-1-抗胰蛋白酶、蛋白酶(金属蛋白酶、尿激酶、uPA、tPA…链激酶)、裂解前体并释放活性物质的蛋白酶(ACE、ICE等)、或它们的拮抗剂(TIMP-1，组织纤溶酶原激活物抑制剂PAI、TFPI)，-血衍生物，如参与凝血的因子第VII、VIII、IX因子、补体因子、凝血酶，-激素、或参与激素合成途径的酶、或参与激素合成或排泄或分泌之调节的因子，如胰岛素、胰岛素样因子(IGF)、或生长激素、ACTH、性激素合成酶，-淋巴因子和细胞因子白介素，趋化因子(CXC和CC)，干优素，TNF，TGF，趋化性因子或激活物如MIF、MAF、PAF、MCP-1，eotaxine、LIF等(法国专利No.9203120)，-生长因子，例如IGF、EGF、FGF、KGF、NGF、PDGF、PIGF、HGF、增殖蛋白，-血管生成因子，如VEGF或FGF、促血管生成素(angiopoietine)1或2、内皮素，-神经递质合成中的酶，-营养因子，特别是用于治疗神经变性疾病、损及神经系统的创伤或视网膜变性的神经营养因子，例如神经营养蛋白家族的成员如NGF、BDNF、NT3、NT4/5、NT6、它们的衍生物和相关基因，CNTF家族的成员如CNTF、axokine、LIE及它们的衍生物，IL6和其衍生物，心营养蛋白(cardiotrophine)及其衍生物，GDNF及其衍生物，IGF家族的成员如IGF-1、IFGF-2和其衍生物，FGF家族的成员如FGF1、2、3、4、5、6、7、8、9和它们的衍生物，TGFβ，-骨生成因子-造血因子，如促红细胞生成素、GM-CSF、M-CSF、LIF等，-细胞骨架蛋白，如肌营养不良蛋白或小肌营养不良蛋白(法国专利No.9111947)，自杀基因(胸苷激酶、胞苷脱氨酶、细胞色素P450的酶)，血红蛋白或其他转运蛋白的基因，-参与脂类代谢的蛋白质的相应基因，选自载脂蛋白A-I、A-II、A-IV、B、C-l、C-II、C-III、D、E、F、G、H、J和apo(a)的一种载脂蛋白类型，代谢酶，例如脂肪酶、脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶、卵磷脂胆固醇酰基转移酶、7-a-胆固醇羟化酶、磷脂酸磷酸酶，乃至脂类转移蛋白质，如胆固醇酯转移蛋白质和磷脂转移蛋白，HDL结合蛋白，乃至选自例如LDL受体、乳糜微粒残余物受体和清除子受体等的一种受体。可进一步加入瘦素(leptin)来治疗肥胖症，-调节血压的因子，如参与NO代谢的酶，血管紧张素，缓激肽，加压素，ACE，肾素，编码前列腺、血栓烷或腺苷合成或放大机制的酶，腺苷受体，激肽释放酶，kallistatine，ANP，ANF，利尿剂或尿分泌抑制剂，参与组胺、5-羟色胺、儿茶酚胺、神经肽等介质的合成、代谢或放大的因子，-抗血管生成因子，如Tie-1和Tie-2的配体、制管张素、ATF因子、纤溶酶原衍生物、内皮素、血小板反应蛋白1和2、PF-4、干扰素α或β、白介素12、TNFα、尿激酶受体、flt1、KDR、PAI1、PAI2、TIMP1、催乳素片段，-抗凋亡的保护因子，如AKT家族，-可诱导细胞死亡的蛋白质，它们可以是本身作为caspase的活性形式，或是需要由其他因子激活的“前药”形式，或激活前药从而引起细胞死亡的蛋白质，如疱疹病毒的胸苷激酶，脱胺酶，特别可用于抗癌的治疗，-参与细胞间接触和粘着的蛋白质VCAM、PECAM、ELAM、ICAM、整联蛋白、cathenine，-细胞外基质的蛋白质，-参与细胞迁移的蛋白质，-信号传导型蛋白质，FAK类、MEKK、p38激酶、酪氨酸激酶、丝氨酸-苏氨酸激酶，-参与细胞周期调节的蛋白质(p21，p16，细胞周期蛋白等)可阻断细胞周期并有时可诱导凋亡的显性失活突交或衍生蛋白质，
-转录因子jun，fos，AP1，p53…及p53信号级联中的蛋白质，-细胞结构的蛋白质，如中间丝(波形蛋白、结蛋白、角蛋白)、肌营养不良蛋白、参与收缩和控制肌肉收缩的蛋白质，特别是参与钙代谢和细胞中钙流动的蛋白质(SERCA等)。
在通过配体受体系统起作用的蛋白质中，预期使用配体或受体(例如FGF-R，VEGF-R等)。还可以举出编码配体或受体蛋白(特别是上述蛋白)的片段或突变体的基因，其具有高于整个蛋白的活性，或具有拮抗活性，甚至相对于原蛋白是“显性失活的”(例如抑制循环蛋白出现的受体片段，与诱导这些片段分泌(相对于细胞膜中的锚)的序列相连或否，或改变这些配体受体系统的细胞内运输以使某元件无法出现的其他系统)，或甚至具有与全蛋白完全不同的活性(例如ATF)。
在可由肌肉分泌的其它蛋白质或肽中，重要地是强调抗体、单链抗体的可变片段(ScFv)或具有识别能力的其它任何抗体片段，用于免疫治疗，例如，传染病、肿瘤和自身免疫病如胰岛硬化症(抗独特型抗体)的治疗，以及与促炎细胞因子如IL1和TNFa结合的ScFv，用于类风湿性关节炎的治疗。非限制性的其它目的蛋白质是可溶性受体，例如，用于抗HIV治疗的CD4可溶性受体或TNF可溶性受体、用于治疗类风湿性关节炎的可溶性TNFa受体或IL1可溶性受体和用于治疗肌无力的乙酰胆碱可溶性受体；底物肽或酶抑制剂，乃至受体激动剂或拮抗剂肽或粘着蛋白，例如，用于治疗哮喘、血栓症、再狭窄、转移瘤或炎症；以及人工的、嵌合的或截短的蛋白质。在重要的目的激素中，可以举出对于糖尿病的胰岛素，生长激素和降钙素。还可以举出能够诱导抗肿瘤免疫或刺激免疫应答的蛋白质(IL2，GM-CSF，IL12等)。最后可以举出减弱TH1细胞应答的细胞因子如IL-4、IL-10和IL-13。
上述和下述的众多实例说明本发明电场应用的潜在范围。
治疗性核酸也可以是一种基因或反义序列，其在靶细胞中的表达使可以控制细胞的基因表达和mRNA转录。例如，根据欧洲专利号140,308所述的方法，这些序列可在靶细胞中转录成与细胞mRNA互补的RNA，从而阻断其蛋白质翻译。治疗性基因也包括编码核酶的序列，其能选择性地破坏靶RNA(欧洲专利号321,201)。
如上所述，核酸也可含有一种或多种编码抗原性肽的基因，它能在人或动物中引起免疫应答。在该特定实施方案中，本发明因而可应用于人或动物、尤其针对微生物、病毒或癌症进行疫苗接种或免疫治疗性治疗。特别地，可包括EB病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(欧洲专利号185,573)、伪狂犬病毒、“合胞体形成病毒”、其它病毒的特异抗原肽，乃至特异的肿瘤抗原如MAGE蛋白(欧洲专利号259,212)或能刺激抗肿瘤反应的抗原，如细菌热激蛋白。
核酸优选地也包括支持和/或有助于治疗性基因和/或编码抗原肽的基因在肌肉中表达的序列。它可包含这样的序列，当这些序列能在转染的细胞中起作用时，天然地负责所考虑的基因表达的序列。也可包含不同来源的序列(负责其它蛋白质的表达，乃至合成的序列)。特别地，它可含有真核或病毒基因启动子序列。例如，可含有来源于希望转染的细胞基因组的启动子序列。在真核启动子中，可使用诱导或阻抑基因转录的任何启动子或衍生序列，其可为特异性或非特异性的，强或弱的。特别涉及普遍存在的启动子(HPRT、波形蛋白、α-肌动蛋白、微管蛋白等)，治疗性基因的启动子(MDR，CFTR等型)，组织特异性启动子(结蛋白、肌球蛋白、肌酸激酶、磷酸甘油酸激酶基因的启动子)或激素起反应的启动子(如类固醇激素受体、视黄酸受体等)，或由抗生素(四环素、纳巴霉素等)调节的启动子，对饮食制度起反应的启动子如对纤维食物(fibrate)反应的启动子或对其它天然或合成分子反应的其它启动子。同样可含有来源于病毒基因组的启动子序列。就此而论，例如，可提到腺病毒EIA基因、MLP基因的启动子，或来自病毒CMV、RSV、SV40等基因组的启动子。可以是可诱导的或可抑制的启动子。此外，通过添加活化、调节、允许条件性表达、暂时表达、组织特异性表达或集中表达等的序列，可修饰这些表达序列。
此外，尤其在治疗性基因之上游，核酸也可含有引导合成的治疗性产物进入靶细胞分泌管的信号序列。该信号序列可以是治疗性产物的天然信号序列，但也可包括其它任何功能性信号或人工信号序列。核酸也可含有引导合成的治疗性产物进入特定细胞区室的信号序列，如过氧化物酶体、溶酶体、线粒体，用于治疗例如线粒体遗传病。
McKusic k，V.A.(《人类孟德尔式遗传，常染色体显性、常染色体隐性和X-连锁表型目录》(Mendelian Inheritance in man，catalogs of autosomal dominant，autosomal recessive，andX-linked phenotypes)第8版，Johns Hopkins University Press(1988))和Stanbury，J.B.等人(《遗传性疾病的代谢基础》(The metabolic basis of inherited disease)第5版，McGraw-Hill(1983))已经叙述了其它目的基因。这些目的基因包括与氨基酸、脂类和其它细胞成分代谢有关的蛋白质。
因而可非限定性地提及与糖类代谢疾病有关的基因，例如果糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1，6-二磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶、溶酶体α-1，4-葡糖苷酶、淀粉-1，6-葡糖苷酶、淀粉-(1，4∶1，6)-转葡糖苷酶、肌磷酸化酶、肌果糖磷酸激酶、磷酸化酶-b-激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、丙酮酸脱氢酶复合体的所有酶、丙酮酸羧化酶、2-酮戊二酸乙二醛酶羧化酶和D-甘油酸脱氢酶。
也可提及-与氨基酸代谢疾病有关的基因，例如苯丙氨酸羟化酶、二氢生物蝶呤合成酶、酪氨酸氨基转移酶、酪氨酸酶、组氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸酶、谷胱甘肽合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、鸟氨酸-δ-氨基转移酶、氨甲酰磷酸合成酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、L-赖氨酸脱氢酶、L-赖氨酸酮戊二酸还原酶、缬氨酸转氨酶、亮氨酸异亮氨酸转氨酶、支链2-酮酸脱羧酶、异戊酰辅酶A脱氢酶、酰基辅酶A脱氢酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶、乙酰乙酰辅酶A 3-酮硫解酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、ATP钴胺素腺苷转移酶、二氢叶酸还原酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、胱硫醚β-合成酶、肌氨酸脱氢酶复合体、属于甘氨酸分解系统的蛋白质、β-丙氨酸转氨酶、血清肌肽酶和大脑高肌肽酶。
-与脂肪和脂肪酸代谢疾病有关的基因，例如脂蛋白脂肪酶、载脂蛋白C-II、载脂蛋白E、其它载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶、LDL受体、肝甾醇羟化酶和“植烷酸”α-羟化酶。
-与溶酶体缺陷症有关的基因，例如溶酶体α-L-艾杜糖醛酸酶(iduronidase)、溶酶体艾杜糖醛酸硫酸酯酶、溶酶体肝素N-硫酸酯酶、溶酶体N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶、乙酰辅酶A溶酶体α-葡糖胺N-乙酰基转移酶、溶酶体N-乙酰基-α-D-葡糖胺6-硫酸酯酶、溶酶体半乳糖胺6-硫酸硫酸酯酶、溶酶体β-半乳糖苷酶、溶酶体芳基硫酸酯酶B、溶酶体β-葡糖醛酸酶、N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶、溶酶体α-D-甘露糖苷酶、溶酶体α-神经氨酸酶、溶酶体天冬氨酰氨基葡糖苷酶、溶酶体α-L-岩藻糖苷酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酸性神经酰胺酶、溶酶体鞘磷脂酶、溶酶体葡糖脑苷脂酶和溶酶体半乳糖脑苷脂酶、溶酶体半乳糖苷神经酰胺酶、溶酶体芳基硫酸酯酶A、α-半乳糖苷酶A、溶酶体酸性β-半乳糖苷酶和溶酶体氨基己糖苷酶A的α链。
也可非限制性地提及与类固醇和脂类代谢疾病有关的基因、与嘌呤和嘧啶代谢疾病有关的基因、与卟啉和血红素代谢疾病有关的基因、与结缔组织、肌肉和骨代谢疾病有关的基因，以及与血液和生血器官、肌肉(肌病)、神经系统(神经退化病)或循环系统(例如，局部缺血和狭窄的治疗)疾病有关的基因，和参与线粒体遗传病的基因。
在根据本发明的方法中，核酸可与可以增强基因转移的任何类型的载体或这些载体的任意组合相连接，例如，非限制地，连接至载体如病毒、合成或生物合成的物质(例如，脂类、多肽、糖苷或聚合物)，或抛射射或否的球上。也可将核酸注射入肌肉中，该肌肉已经受一种目的在于增强基因转移的处理，例如，在局部或全身应用中药理学性质的处理，或酶、透化(表面活性剂的使用)、外科、机械、热或物理处理。
在基因治疗中使用肌肉的优点在于以下许多因素·转基因表达的显著稳定性，超过几个月，因此使肌肉内或分泌型治疗性蛋白质的稳定和持续产生成为可能，·容易进入肌肉组织，可以在非关键器官中直接、快速和安全地施用，·肌肉块的大体积，可以多个施用部位，·充分证明的肌肉的分泌能力。
补充的一个优点是与使用局部和靶向电场有关的局部处理所提供的安全性。
由于所有这些优点和与使用弱电场有关的安全性，可对心肌应用本发明进行心脏病的治疗，例如，同时使用适配的除颤仪。通过抑制平滑肌细胞增殖的基因的表达，如GAX蛋白，本发明也可用于再狭窄的治疗。
尤其对肌肉体内施加的低强度、长持续时间的电场组合，可增强核酸的转染，而不引起明显的组织恶化。这些结果提高了使用核酸的基因治疗中DNA转移的效率。
因此，与本发明方法有关的肌肉组织优点是，第一次可以预期在基因治疗中产生生理性和/或治疗性剂量的物质，在肌肉细胞中或分泌在邻近组织中，或在血流或淋巴循环中。此外，本发明第一次使表达的转基因有效量的精细调节和控制成为可能，这是根据调节被转染组织的体积的可能性，通过调节待转染肌肉组织体积的可能性，例如利用多个施用位点，或通过调节电极数量、形状、表面和排列的可能性。补充控制元件起因于调节转染率的可能性，这种调节是通过改变场强、脉冲的数量、持续时间和频率以及根据现有技术对核酸施用的量和体积的改变。于是能获得与希望的组织内产生或分泌相当的转染水平。最后，与体内基因转移的化学或病毒方法相比，该方法使得安全性提高，在化学或病毒方法中无法完全消除和控制到达非靶器官的器官中。实际上，根据本发明的方法使得可以控制被转染组织的局部化(与经受局部电脉冲组织的体积密切相关)，并因此带来通过组织的完全或部分切除而回到原始状态的可能性，这是可能的，因为该组织不是必需的或能再生。使用上的这种较大灵活性使根据动物种(人和兽医应用)、患者年龄及他或她的生理和/或病理状况优化方法成为可能。
与病毒法相比，根据本发明的方法进一步第一次使转染大的核酸成为可能，就转基因的大小而言，病毒法受壳体大小的的限制。这种可能性对于极大型基因如肌营养不良蛋白或含内含子和/或大型调节元件的基因的转移是必要的，例如，对于激素的生理调节性产生是必要的。这种可能性是酵母附加体或人工染色体或微型染色体的转移所必需的。
下列实施例用于以非限制性方式说明本发明。
在这些实施例中参照下列附图
图1高场强电脉冲对小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNA pXL2774转染的影响；平均值±SEM。
图2中场强电脉冲对小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNA pXL2774转染的影响；平均值±SEM。
图3弱场强及不同持续时间的电脉冲对小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNA pXL2774转染的影响；平均值±SEM。
图4弱场强及不同持续时间的电脉冲对小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNA pXL2774转染的影响；平均值±SEM。
图5低电场强度时小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNA pXL2774电转移的效率；平均值±SEM。
图6萤光素酶在小鼠颅侧胫骨肌中表达的动力学。有(■)和无(×)电转移时质粒pXL2774的施用；平均值±SEM。
图7有(●)和无(□)电转移时随施用DNA的剂量而变化的表达水平。
图8不同类型电极对电转移效率的影响。
图9分泌型碱性磷酸酶血清浓度的动力学。有(■)和无(◆)电转移时质粒pXL3010的施用；平均值±SEM。
图10有(空心直方条)或无(实心直方条)电转移时FGF1在肌肉中表达的动力学。
图11质粒pXL3179和pXL3212的图谱。
图12质粒pXL3388和pXL3031的图谱。
图13质粒pXL3004和pXL3010的图谱。
图14质粒pXL3149和pXL3096的图谱。
图15质粒pXL3353和pXL3354的图谱。
图16质粒pXL3348的图谱。
实施例1现有技术条件下进行的实验，其中电场显示对转染的抑制试验了标准电穿孔条件，例如已在上文讨论的文献中所用的条件，发现其引起横纹肌中核酸(质粒DNA)转移的低效率甚至抑制。
材料与方法一般操作条件在本实施例中使用了下列产品DNA pXL2774(专利PCT/FR96/01414)是含有萤光素酶报道基因的质粒DNA。其它产品可在市场供应商处获得氯胺酮、噻拉嗪、生理盐水(NaCl 0.9％)。
使用一种示波器和一种商品化电脉冲发生器(矩形或方形)(Electropulsateur PS 15，Jouan，法国)。所用的电极是间距1-15mm的不锈钢板式电极。
在C57Bl/6小鼠中进行本实验。在实验前随机分配来自不同笼子的小鼠(“随机化”)。
用氯胺酮和噻拉嗪的混合物麻醉小鼠。借助于Hamilton注射器纵向穿过皮肤向左爪和右爪的颅侧胫骨肌中注射质粒溶液(30μl的0.9％NaCl中的500μg/ml溶液)。用导电凝胶覆盖两个电极，将注射的爪置于电极之间并与后者接触。
注射一分钟后通过方形脉冲发生器垂直于肌肉轴施加电脉冲。示波器控制所释放脉冲的单位为伏特的强度(实施例中所示的值代表最大值)、单位为毫秒的持续时间和单位为赫兹的频率，该频率为1Hz。释放8次连续脉冲。
为了评价肌肉的转染，质粒施用7天后使小鼠安乐死。然后取下左爪和右爪的颅侧胫骨肌，称重，置于裂解缓冲液中并研磨。离心获得的悬液以便获得澄清的上清液。借助于商品化发光计对10ml上清液进行萤光素酶活性的测定，该发光计中自动向溶液中加入底物。对于施用总容量悬液的肌肉，发光反应的强度以RLU(相对发光单位)表示(1×106RLU相当于30pg萤光素酶)。每个条件实验10个点5只动物双侧注射。用非参数检验进行统计学比较。
结果与讨论标度为线性或对数的两幅图说明了结果。
在第一种实验中，测试了800-1200伏特/cm的电场的作用，这是用于肿瘤电穿孔的条件(Mir等人，欧洲癌症杂志(Eur.J.Cancer)27，68，1991)。
根据图1观察到，相对于无电脉冲时注射DNA的对照组·有1200伏特/cm和0.1msec持续时间的8次脉冲时，萤光素酶活性的平均值低得多；·有1200伏特/cm和1msec的脉冲时，三只动物死亡，萤光素酶活性的平均值低得多；·有800伏特/cm和1msec的脉冲时，萤光素酶活性的平均值也显著降低。
大多数经受电场作用的肌肉都有可见的改变(脆并且外观苍白)。
实施例2中等电场下核酸的电转移用C57Bl/6小鼠进行本实验。除脉冲的电场强度及其持续时间外，实验条件同实施例1。
结果显示于图2中。再现了实施例1的结果，即，在肌肉中检测到800伏特/cm、1msec持续时间的一系列8次脉冲对萤光素酶活性的抑制作用。应用600伏特/cm的电场，观察到肌肉组织的相同抑制与相同变化。然而，十分明显和惊人地，电压的降低有可能不再明显地改变肌肉，而且，在400和200伏特/cm时，肌肉的转染水平平均高于对未经受电场的肌肉所获得的水平。应当指出，与对照组(不经受电场)相比，在200伏特/cm时萤光素酶活性值的离散显著降低(SEM＝平均值的20.59％，相比而言无电场时为43.32％(图2A))。
实施例3利用弱场强脉冲的核酸点转移实验，显示对转基因表达的很强刺激用C57Bl/6小鼠进行本实验。除脉冲的电场强度及其持续时间及在DNA注射后释放脉冲25秒这一事实外，实验条件同前述实施例。
结果显示于图3中。由200伏特/cm下5msec的脉冲持续时间开始，用100伏特/cm下20msec的脉冲持续时间，转基因表达的萤光素酶平均值明显增高。
本实验也清楚地显示，当使用200和100伏特/cm的电压时，通过肌肉中的DNA电转染获得的萤光素酶活性平均值是电脉冲持续时间的函数。也发现，对于电转染的肌肉组，值的离散显著降低(图3A)。无电脉冲时(对照)，SEM为平均值的77.43％，而在5msec的脉冲时间、200伏特/cm的电场条件下，相对SEM降至14％，在20msec的脉冲时间、200伏特/cm的电场条件下降至41.27％，对于100伏特/cm时的电转移为30％-48％。
在本实验的最佳条件下，与无电脉冲时注射的对照相比，转基因表达增强了89.7倍。
实施例4在200V/cm下肌肉中的核酸电转移实验，显示转基因表达增强200倍。
应用可变持续时间的200伏特/cm的电脉冲，在DBA2小鼠中进行本实验。本实验的其它条件与实施例3相同。
本实施例证实，在200伏特/cm下，当脉冲持续时间从5msec延长到更长持续时间时，萤光素酶活性的转染增强(图4和图5)。同样，观察到SEM所表示的个体间变异性相对于未电转染的对照的降低。对于对照，SEM的相对值等于35％，对于1、5、10、15、20和24msec的脉冲系列，分别为25％、22％、16％、18％和26％。
在本实验所用的最佳条件下，与无电脉冲时注射的对照相比，转基因表达增强了205倍。因此，所释放每个脉冲的持续时间的变化看来是调节核酸转移效率和调节转基因表达水平的工具。
实施例5根据“脉冲次数×场强×每个脉冲的持续时间”乘积变化的核酸电转移效率。
图5例证了相当于“脉冲数×场强×每个脉冲持续时间”乘积的参数的重要性。实际上，该参数对应于依赖时间的描述电场变化的函数的积分。
图5中的数据来自实验2、3和4的过程中获得的结果，评价了200V/cm和100V/cm的电场强度或无电场。数据显示，转染效率随暴露于电场的总持续时间与场强的乘积而升高。“电场×脉冲总持续时间”乘积的值超过1kV×msec/cm时，获得核酸转移的刺激效果。根据一种优选实施方案，“电场×脉冲总持续时间”乘积的值超过或等于5kV×msec/cm时，得到刺激。
实施例6电脉冲持续时间提高的影响本实施例证明可以在实施例4的实验值范围内延长脉冲的单位持续时间。
本实验在C57Bl/6小鼠中进行。所用质粒是质粒pXL2774，施用的DNA量为15μg。用于发送持续时间大于20毫秒的电脉冲的电脉冲仪是一种商品电脉冲仪(Gentronics，T820型，美国，San Diego，CA)。电脉冲的次数和持续时间是可变的，但场强为恒定的200V/cm；本实验的其他条件与实施例1所述的相同。结果示于表1中。
表1萤光素酶活性的均值+/-SEM，单位为百万RLU/肌肉，每组N＝10。电转移条件200V/cm场强，8或4次脉冲(单位持续时间可变)，1Hz频率。
随着延长脉冲的单位持续时间提高了转基因的表达(对于200V/cm的场强，8个脉冲的系列至少可达40毫秒，4个脉冲的系列至少可达50毫秒)。本实施例表明最佳脉冲持续时间依赖于所用的脉冲数，脉冲的单位持续时间可达到至少80毫秒，这一持续时间值不是限制性的。
实施例7随脉冲数而变的电转染效率本实施例证明增加脉冲数对核酸转染效率的影响。
本实验在C57B1/6小鼠中进行。所用质粒是质粒pXL2774，施用的DNA量为15μg。电脉冲的次数是可变的，每个脉冲的持续时间为20毫秒，场强为200V/cm。本实验的其他条件与实施例1所述的相同。结果示于表2中。
表2平均萤光素酶表达±S.E.M.，单位为百万RLU每一肌肉；每一组N＝10。条件200V/cm场强；20毫秒，1Hz频率，脉冲数可变。
观察到，施加单一脉冲就大大提高萤光素酶的表达，随着脉冲数继续提高。因此，所释放每个脉冲的数量变化看来是调节核酸转移效率和调节转基因表达水平的工具。
还证实反应的变异性降低，相对于施加电转移的所有组的均值SEM值的降低证明了这一点。
实施例8电脉冲频率提高的影响本实施例显示，提高脉冲频率可意外地增强转染效率。另外从临床角度看，提高频率应可以提高患者的舒适度，缩短总的治疗时间。
本实验在C57Bl/6小鼠中进行。所用质粒是质粒pXL2774，施用的DNA量为15μg。电脉冲的频率是可变的(从0.1到4赫兹)，每个脉冲的持续时间为20毫秒，场强为200V/cm。本实验的其他条件与实施例1所述的相同。结果示于表3中。
表3单位为百万RLU每一肌肉的平均萤光素酶活性±S.E.M.；每组N＝10。条件电场强度200V/cm；脉冲时间20 msec的8或4个脉冲，频率可变。
在表3中实验“A”所得的结果证明，高频率(≥1Hz)比低频率更有效，低频率相应于两个连续脉冲之间的时间长(10秒相当于0.1Hz)。在所实验值的范围内，即4个脉冲的0.1到4赫兹，8个脉冲的0.1到3赫兹，转染效率随着频率增加。
实施例9应用随时间指数递减变化的电场的效果本实施例显示应用指数降低的变化电场对核酸转移效率的影响。
在本实验中使用C57Bl/6小鼠。
在本实验中使用质粒pXL3031。质粒pXL3031(图12)是由质粒pXL2774(WO97/10343)衍生的一种载体，其中引入来自pGL3basic(GenbankCVU47295)的编码修饰的Photinus pyralis萤光素酶(胞浆)的基因luc+，使之位于来自人巨细胞病毒早熟区的启动子(CMV-IE，Genbank HS5IEE)和源自SV40病毒晚期区的多腺苷酸化信号(Genbank SV4CG)的控制之下。注射的DNA量为10μg。
所有的电脉冲发生器(Equibio电脉冲发生器，EasyjectT Plus型，Kent，UK)，可释放随时间变化指数递减的电场脉冲。施加电压为指数峰值电压。第二种可调节的参数是电容(单位为μF)，其可改变所释放能量的量和指数的时间常数。结果示于表4中。
表4应用指数递减的脉冲所获得的表达(萤光素酶活性)提高倍数。以施用质粒pXL3010而无电转移的萤光素酶活性为参照计算提高倍数。(提高倍数的均值，每种条件N＝4到6)。
作为比较，在相同实验中在200V/cm、每次20msec的8次脉冲、频率为1Hz的方波脉冲电场存在下，pXL3010转移获得的表达提高倍数为44。
这些结果显示，可以使用方形的或强度随时间递减的电脉冲。另外，在后一情况下，在弱电场高电容(例如，200V/cm，3000μ法拉的电容)或高电场低电容(例如，400V/cm，300μ法拉的电容)可获得表达的显著提高。
实施例10一次短高压脉冲与几次长低压脉冲的组合效果本实施例显示，在本实验中释放的电场可以是一种组合，该组合包括至少一次短时如50或100μs的500-800V/cm的电场，和至少一次较长时间如长于1ms最高可达90ms的弱电场(＜100V/cm)。
此处的弱电场值为80V/cm，以1Hz的4次脉冲施加，每次持续时间90ms。对于该实验，使用两种电脉冲发生器。先由一种然后由另一种仪器施加电脉冲，手工操作在少于一秒钟之内进行转换。
使用的质粒是质粒pXL3031，注射的DNA量为3μg。电场强度如表5所报告；本实验的其他条件与实施例1所述的相同。<
表5单位为百万RLU每一肌肉的平均萤光素酶活性±S.E.M.；每组N＝10块肌肉。
综合了两个系列实验结果的表5显示，一个高电压的短脉冲或弱电压的四个连续的长脉冲与注射pXL3031但不施加电场的对照组相比几乎不改善转染。当弱电场脉冲在高电场脉冲之前施加时情况也一样。
相反，在第二系列实验中，高电压短脉冲之后接着弱电压的四个连续的长脉冲的组合很显著地提高了DNA的转移效率。
实施例1和2中获得的结果显示，施加频率为1Hz、单位持续时间为1msec的600、800或1200V/cm的8次脉冲，导致肌肉损伤和抑制转染。实施例10中获得的结果显示，在特定条件下，使用高压电场而不引起损伤是可能的。确实，对肌肉的肉眼检查未能证明任何可见的变化。使用短时间的高压电场，随后较长时间的弱电场，提供了调节DNA转移效率的另一种方法。实施例11对不同大小的质粒、在不同启动子控制下的基因或转基因表达的蛋白有不同定位的基因的电转移11.a-对不同大小质粒的电转移试验了含有萤光素酶编码基因的不同大小的质粒(2.8Kb、3.8Kb、8.6Kb、20Kb和52.5Kb)。施用的质粒量为10μg/肌内。以20msec、2Hz的8次脉冲施加强度200V/cm的电场，本实验的其他条件与实施例1中所述的相同。
用2.8Kb和3.8Kb的质粒观察到转基因表达提高约50倍，对8.6Kb的质粒为约80倍，对20Kb和52.6Kb的质粒为3-6倍。
该实施例因而证明转移大质粒的可能性，即可以直到20Kb及更大。
11.b在无萤光素酶编码基因时的发光信号的控制为了控制并排除在萤光素酶活性测定中观察到的发光信号是出于电处理后组织中的激发产物的可能性，对用不编码萤光素酶的质粒处理并经受电场的肌肉测定了萤光素酶活性。
表6注射不同的质粒、施加或不施加电场的肌肉中的萤光素酶活性。条件200V/cm，200msec、1Hz频率的8次脉冲。百万RLU/肌肉表示的萤光素酶活性的均值+/-SEM。
这些结果表明，在注射不编码萤光素酶的质粒的肌肉中萤光素酶的基础活性是完全可以忽略的。
11.c-在不同启动子控制下的基因电转移在转基因的表达水平上，在施加电场或否的条件下检验了不同启动子的影响。
每块肌肉注射的质粒量为2μg。施加的电场为200V/cm强度的20msec、1Hz的8次脉冲，本试验的其他条件与实施例1中所述的相同。结果示于表7中。试验的质粒为CMV-LUC结构的质粒pXL3031。PGK结构相当于用启动子PGK替换pXL3031中的启动子CMV。
表7以百万RLU/肌肉计的萤光素酶活性的均值+/-SEM。
这些结果表明，当在电场存在下进行DNA转移时，转基因表达的提高倍数在不同来源或强度的启动子下是相似的。
11.d-转基因表达蛋白有不同定位的基因的电转移本实施例阐明了不同细胞定位蛋白的编码基因的转移。质粒pXL3031编码胞质中的合成萤光素酶，质粒pXL2774编码定位于过氧化物酶体的萤光素酶。
每块肌肉注射的质粒量为10μg。施加的电场为200V/cm强度的20msec、1Hz的8次脉冲，本实施的其他条件与实施例1中的相同。结果示于表8中。<
表8以百万RLU计的萤光素酶活性的均值+/-SEM。
这些结果证明，本发明的方法适用于不同细胞定位蛋白的编码基因的转移，特别是对于过氧化物酶体的蛋白质或胞质蛋白质。
实施例12转基因表达的动力学和组织学分析本实施例说明在本发明条件的电场存在下核酸的转移可以获得转基因的高水平表达并稳定表达至少四个月。
在本实验中使用C67Bl/6小鼠。使用的质粒是质粒pXL2774，施用的DNA量是15μg。DNA注射之后是下列条件下电场的施加或不施加200V/cm；20msec持续时间的8次脉冲；1Hz的频率。其它条件如实施例1所述。对在不同时间处死的10只小鼠的组别测定萤光素酶活性。结果示于图6。
可以看出，对照组中从质粒注射后第三小时开始萤光素酶的表达是可检测的，直到第三天(D3)一直增高，然后从第35天开始下降。
对于用电场处理的组，观察到，转基因表达保持在比对照组非常明显增强的水平。另外，令人注目地观察到该表达在第35天和至少第120天期间保持高水平并恒定。从应用治疗性基因长期临床治疗的角度来看，转基因的这种高水平持续表达是特别有利的结果。
12.b-组织学分析除了使用编码定位于核中的β-半乳糖苷酶的质粒pCOR CMV-lacZ(pXL3004)之外，在这些同样条件下进行组织学分析。
pXL3004(图13)是质粒pXL2774(WO 97/10343)衍生的一种载体，其中引入用核定位信号序列插入修饰的lacZ基因(Mouvel等人，1994，病毒学(Virology)204180-189)，并置于从质粒pCDNA3(Invitrogen，荷兰)获得的CMV启动子与SV40多腺苷酸化信号(Genbank SV4CG)的控制之下。
质粒施用7天后处死动物。组织学分析允许检测表达β-半乳糖苷酶而且细胞核位于截面中的细胞(Xgal组织化学)。
接受质粒pXL3004随后经受电脉冲的组中，在检查的截面具有阳性核的肌肉纤维数为平均76，而对照组(接受质粒pXL3004但不经受电脉冲的动物组)为8.5。
注意到，表达转基因的肌纤维数是对照组的9倍。这些肌纤维的大部分是静息的，核位于周边。中心核的肌纤维很少表达β-半乳糖苷酶。还注意到沿着质粒的注射路径，单位表面的阳性肌纤维密度在电转移处理组中比对照组中高得多。
这些结果一起表明，相对于不经受电场的肌肉，电转移可以大大提高表达转基因的肌纤维的数量，以及大大提高表达转基因区域的面积。还观察到施加电场不会引起显著的炎症反应。
实施例13相对于电场施加时间的质粒注射时间的作用本实施例证明，可在电场施加至少30分钟前、甚至长至一小时之前向施用核酸。
本实验使用C57Bl/6小鼠。使用的质粒是质粒pXL2774，施用的DNA量是15μg或1.5μg。DNA注射之后或之前施加下列条件下电场200V/cm；20msec持续时间的8次脉冲；1Hz的频率。其它条件如实施例1所述。对照鼠接受质粒注射但不经受电脉冲。结果示于表9中。表9A无电场时注射DNA
>9B电场施加前注射DNA
9C电场施加后注射DNA
表9萤光素酶活性的平均值±S.E.M.，单位为百万RLU每块肌肉。每组N＝10。
施加电场的过程中DNA的存在是电转染效率的一个条件。令人注目的是，可以在电场施加前至少30分钟甚至一小时注射质粒(实验4和5)，不会显著改变表达水平。对每一肌肉注射15μg质粒和低10倍剂量即1.5μg观察到相似的结果。
这些结果尤其允许设想，在施加电场之前在肌肉中于不同的时间进行相同或不同质粒的多次注射。还可以在肌肉广泛的区域中多次注射，随后对待处理的整个注射区施加系列电脉冲。
实施例14注射的DNA剂量与表达水平间关系的统计研究本实施例所示的统计学分析允许对电场存在或不存在下的转基因剂量-反应关系进行比较。本研究证实，电转移装置的使用大大降低了转基因表达水平的变异性。
给5周龄C57Bl/6小鼠在颅侧胫骨肌中两侧肌内注射质粒pXL3031。质粒剂量在0.25-32μg DNA间变化。每个剂量实验10只小鼠。质粒注射后立即将两条腿中的一只暴露于具有1Hz频率、20ms的4次脉冲的250V/cm电场中。
处理后5天处死动物，研究每一肌肉的组织提取物中转基因的表达。结果示于图7中。
随每一系列10个重复平均值而变的方差改变的比较清楚地显示，转基因表达的分布是对数正态分布。对经计算证实的结果的图解分析(图7)显示，该表达随注射的DNA剂量的对数而线性变化。
应用柯克兰检验，证明对于每一回归(有及无电转移)存在方差的同质性，这允许用残余方差进行所有计算。
电转移条件下线性的差异对于5％的置信度是不显著的。相反，在无电转移条件下，线性的差异非常显著(p＜0.01)，表明反应的显著异质性。有电转移的情况下残余方差低5倍。
考虑到估计的残余方差的值，为了获得转染效率比较检验的相同能力，根据是否使用电转移，可能使用少5倍的动物。为了证明2、5或10倍转基因表达对95％置信度的差异，与无电转移条件下的165、40或25只动物相比，在电转移条件下施用转基因只需注射大约33、8或5只动物。下面给出了总结这种计算(使用电转移)的表。<
<p>电转移获得的个体间变异性的降低。使得可以对不同基因的表达进行严格的分析研究。这还保证得到治疗剂量的最好确定，并防止与超出治疗窗内可接受剂量有关的危险。
对每一回归获得的斜率的比较检验是不显著的。因而可以认为两种回归存在平行性的危险是5％。
相对能力的计算显示，为了获得与有电转移时相当的表达水平，在无电转移条件下每块肌肉必须注射约250倍的DNA(243±85，95％的置信区间)。
相对能力的计算显示，相关地，对于给定的DNA量，存在电转移时的表达水平是无电转移时所获表达水平的大约500倍。
实施例15不同电极的比较本实施例的目的是比较两类电极—板式电极和针电极—对核酸转移效率的影响。还以不同的植入方向测试了针电极。
向大鼠的三头肌中注射质粒pXL2774(150μg)。如实施例1所述放置板式电极。板式电极的电极间距为1.2cm，对于针电极，电极间距为0.9cm。将针电极以相等的长度插入肌肉组织中，使之或者平行于或者垂直于肌纤维的轴，分别在注射部位两侧。无论电极类型或其取向如何，电场条件如下200V/cm的强度；20msec的8次脉冲；2Hz的频率。结果示于图8中。
所获得的结果显示，使用植入肌肉中的两个平行针电极施加电场给出与用与肌肉外周皮肤接触的板式电极所获得的相类似的结果。还证明电转移效率不依赖于相对于肌纤维方向的针电极植入方向。
本实施例证明，本发明的方法可以用外部电极或侵入式电极进行电转移，而与电极的方向无关。对于向大型肌肉施用核酸，使用针电极特别有利，保持温和电压的电脉冲(例如100V以0.5cm的间距产生200V/cm的电场强度)。
实施例16向小鼠、大鼠、兔和猴子的不同肌肉中的电转移效率本实施例说明，核酸的电转移适用于不同哺乳动物种(小鼠、大鼠、兔和猴子)的多种不同类型的肌肉。
对每个物种的电场施加条件如表10A所述。结果也显示于表10A中。<
>表10A使用电转移获得的萤光素酶表达的提高倍数。以施用质粒pXL3031或pXL2774而无电转移的萤光素酶活性为参照计算提高倍数。数据为每组10块肌肉的平均值。质粒施用7天后测定萤光素酶活性。
也在猴(Macaca fascicularis)中测试了电转移。所用的质粒是质粒pXL3179，包含编码成纤维细胞生长因子1(FGF1或aFGF)的基因。
质粒pXL3179(图11)来源于质粒pXL2774(WO97/10343)，其中引入了编码人成纤维细胞干扰素信号肽与FGF1的cDNA融合蛋白(sp-FGF1，Jouanneau等人，1991，PNAS 882893-2897)的基因，置于来自人巨细胞病毒早熟区的启动子(hCMV IE)和SV40病毒晚期区(Genebank SV4CG)多腺苷酸化信号的控制之下。
通过免疫组织化学测定FGF1的存在。结果值为肌内注射500μg质粒pXL3179三天后的阳性截面数。电场施加条件为200V/cm、每次20msec的8次脉冲、1Hz的频率。结果示于下表中。
表10B对猴(Macaca fascicularis)不同肌肉中FGF1表达的免疫组织化学分析的结果。数据表示在有与无电场下肌内注射500μg编码FGF1的质粒pXL3179三天后的阳性截面数。
结果证明在不同的哺乳动物种和不同类型的肌肉中，电转移都显著提高了转基因的表达。
实施例17大鼠膈肌中的电转移效率治疗性目的基因在膈中的直接长期、稳定表达的能力，在影响膈功能的某些变性疾病尤其是Duchenne肌病的治疗中具有重要的意义。
用largactyl和氯胺酮的混合物(1mg/kg largactyl和150mg/kg氯胺酮)麻醉大鼠。在这些实验中，通过沿胸骨的切口露出膈。在半膈中进行注射(在50μl 20mM NaCl和5％葡萄糖中的50μg质粒pXL2774)。然后将板式电极沿注射途径置于膈平面的两侧，电极间距为1mm。所用的电转移条件如下160V/cm或300V/cm；每次20msec持续时间的8次脉冲；1Hz的频率。注射不到1分钟后对肌肉施加电场。然后闭合动物的切口
表11萤光素酶活性的平均值±S.E.M.，单位为百万RLU每块肌肉。每组N＝12。
本实施例证明了在160V/cm的电场强度下施加8次20msec脉冲后膈中转基因表达的显著改善(使用曼-惠特尼非参数检验p＜0.003)。
实施例18分泌型碱性磷酸酶(SeAP)基因的转移和SeAP表达的动力学本实施例证明了本发明方法将肌肉转变为分泌治疗性目的多肽或疫苗的分泌器官的能力，从而在循环血中出现高浓度且稳定的目的多肽。
在本实施例中，在成年C57Bl/6小鼠中试验了电转移方法，注射含有编码人胎盘分泌的碱性磷酸酶的基因的质粒。成年C57Bl/6小鼠在单侧颅侧胫骨肌中接受质粒pXL3010注射。
质粒pXL3010(图13)来源于ColE1，其中引入了来源于pSEAP-basic(Clontech；GenbankCVU09660)的编码分泌型碱性磷酸酶的基因，置于来自质粒pCDNA3(Invitrogen，荷兰)的CMV启动子和SV40病毒晚期区(Genebank SV4CG)的多腺苷酸化信号的控制之下。
电转移条件如下20msec持续时间、1Hz频率、200V/cm电场的8次脉冲。注射后施加20秒的电场。7天后从眼眶后血管丛采取血样。用化学发光测定试验(Phospha-light，Tropix，Bedford，MA01730)测定血清中碱性磷酸酶的浓度。对经受或未经受电场的肌肉注射非编码的质粒(pUC19)可证实没有相应于内源性碱性磷酸酶活性的信号。结果示于表12中。
表12循环血中碱性磷酸酶(SeAP)浓度的平均值±S.E.M.，单位为ng/ml血清。
当经电转染施用质粒pXL3010时，观察到血中SeAP浓度提高140-170倍。
注射400μg质粒(施加电场前在颅侧胫骨肌中两侧并以30分钟间隔两次注射100μg DNA)在有电转移时产生2200ng/ml血清浓度的碱性磷酸酶，而与之相比无电转移时为16ng。
应注意，加入非编码性DNA(pUC19)，使得可以在恒定量的DNA(每只鼠总共10μg的DNA)下工作，可以进一步提高所注射小量质粒pXL3010(≤1μg)的碱性磷酸酶表达水平。
进行了SeAP表达的动力学。施用的质粒剂量为15μg，对每块肌肉两侧注射，即每只鼠30μg。结果显示于图9中。注射后7天，观察到当pXL3010电转移施用时检测到的SeAP血浓度显著提高并稳定(至少两个月)。
这些结果证实，使用本发明的方法在肌肉中转移核酸可以获得分泌型蛋白和定位于肌肉中的蛋白高且稳定水平的表达，还核能将肌肉转变为分泌目的多肽的器官。
实施例19促红细胞生成素(EPO)编码基因的转移对C57Bl/6小鼠在颅侧胫骨肌中单侧注射质粒pXL3348。质粒pXL3348(图16)来源于质粒pXL2774，其中引入了鼠促红细胞生成素基因(NCBI193086)，并置于来自人巨细胞病毒早熟区(hCMV IE)的启动子和SV40病毒晚期区(Genebank SV4CG)的多腺苷酸化信号控制之下。
电转移条件如下200V/cm、20msec的8次脉冲、1Hz的频率。质粒DNA注射后立即施加电场。<
表13平均值±S.E.M.；N＝4-5。
在D17和D24，电转移施用1μg pXL3348，观察到血中促红细胞生成素量的非常显著的增加。另外，促红细胞生成素升高的生理效应到D7是很显著的(85％)，表现为血细胞比容的升高，甚至在用少量质粒时(1μg)也是如此。
实施例20血管内皮生长因子(VEGF)编码基因的转移对C57Bl/6或SCID成年小鼠在颅侧胫骨肌中两侧注射pCOR hVEGF(pXL3212，15μg)。
质粒pXL3212(图11)是质粒pXL2774(WO97/10343)的一种衍生物，其中引入了编码VEGF165的cDNA(血管内皮生长因子，GenbankHUMEGFAA)，置于人巨细胞病毒早熟区的启动子(hCMV IE)和SV40病毒晚期区(Genebank SV4CG)多腺苷酸化信号的控制之下。
电转移条件如下以20msec持续时间、250V/cm、2Hz频率的8次脉冲。血样采自眼眶后血管丛。质粒注射前一天及注射后7天采集血样。用Quantikine试剂盒(R&D System)进行人VEGF的免疫酶定量测定。用小鼠血清中的人VEGF进行该实验的校准。结果显示于表14中。<
>表14C57Bl/6或SCID小鼠中VEGF的血清浓度(ng/升)。
实施例21凝血因子IX编码基因的转染对C57BL6或SCID成年小鼠在颅侧胫骨肌中两侧注射15μgpXL3388。
质粒pXL3388(图12)是质粒pXL2774(WO97/10343)的一种衍生物，其中引入了编码人因子IX(克里斯马斯氏因子；GenbankHUMFIXA)的cDNA，置于来自人巨细胞病毒早熟区的启动子(hCMVIE，Genbank HS5IEE)和SV40病毒晚期区(Genebank SV4CG)多腺苷酸化信号的控制之下。电转移条件如下200V/cm、2Hz频率、20msec持续时间的8次脉冲。从眼眶后血管丛采血样。质粒注射7天后进行采样。结果示于表15中
表15C57Bl/6或SCID小鼠中因子IX的血浆浓度。
只有在本发明方法的条件下施用质粒时才能在血液中检测到人因子IX。
实施例22成纤维细胞生长因子1(FGF1)编码基因的转移对C57BL6或SCID成年小鼠在颅侧胫骨肌中两侧注射pCOR FGF1(pXL3096；15μg)。
质粒pXL3096(图14)是质粒pXL2774(WO97/10343)的一种衍生载体，通过加入形成三股螺旋的序列(TH；Wils等人，1997，基因治疗4323-330)，在其中引入了编码人成纤维细胞干扰素信号肽与编码FGF1的cDNA间融合体(sp-FGF1；Jouanneau等人，1991，PNAS882893-2897)的基因，位于来自人巨细胞病毒早熟区的启动子(hCMV IE)控制之下，随后是HSV1的TK基因前导序列(转录，非转录)和SV40病毒晚期区的多腺苷酸化信号(Genebank SV4CG)。
使用下列电转移条件20msec持续时间的8次脉冲，200V/cm，2Hz频率。用免疫组织化学法显示FGF1的存在。
图10显示C57Bl/6小鼠的结果。对于经受电场的组，观察到阳性纤维数非常明显高于只接受pXL3096质粒而不经受电场的对照组。在D21和D35，对于对照组，FGF1的存在几乎不可检测，而在电转移处理的组中观察到大量阳性纤维。
表16显示SCID小鼠的结果。
表16FGF的表达，对取自肌肉中部的截面的免疫组织化学研究和阳性纤维数。
通过免疫组织化学显示的阳性纤维数确定，只在接受电场的肌肉中才检测到FGF1的表达。此外，注意到甚至在较低质粒剂量(1.5μg)下可检测到FGF1的表达。
实施例23神经营养因子NT3编码基因的转移对成年C57Bl/6小鼠和幼Xt/pmn小鼠施行本发明的方法，用于转移神经营养因子3(NT3)的编码基因。pmn小鼠是肌萎缩性侧索硬化(ALS)的一种鼠模型，其特征在于早期和快速的运动神经元退化，及大约40天的平均预期寿命。
23.1NT3编码基因在成年鼠中的转移对5周龄C57Bl/6小鼠在颅侧胫骨肌中单侧注射12.5μg含有编码鼠神经营养因子NT3的质粒pXL3149。
质粒pXL3149(图14)是质粒pXL2774(WO97/10343)的一种衍生载体，其中引入了鼠NT3基因编码(GenbankMMNT3)，并置于来自人巨细胞病毒早熟区(hCMV IE)的启动子和SV40病毒晚期区(GenebankSV4CG)的多腺苷酸化信号控制之下。
使用下列电转移条件20msec持续时间的4次脉冲，250V/cm，1Hz频率。质粒DNA注射后立即施加电场。小鼠处理7天后在PBS缓冲液中研磨肌肉，离心(12000×g)制备上清液，研究其中NT3的存在，并通过ELISA试验(Promega试剂盒)测定NT3的量。
对20块肌肉的平均值(±95％置信区间)为77±11pg/肌肉(没有电转移，施用质粒DNA)，和2700±900pg/肌肉(有电转移时施用质粒DNA)。
当质粒pXL3149在本发明方法的条件下转移时，观察到肌肉中NT3产物的量提高55倍。
23.2NT3编码基因在幼鼠中的转移对于4-5天龄Xt pmn杂合小鼠用质粒pXL3149进行了相似的实验。注射剂量为每只动物130μg，在不同肌肉多位点(腓肠肌，25μg；颅侧胫骨肌，12.5μg)进行注射。
使用下列电转移条件20msec持续时间的4次脉冲，500V/cm，1Hz。
质粒施用后7天在血浆和肌肉(腓肠肌或颅侧胫骨肌)中检测NT3的存在。施用0.9％的氯化钠溶液作为NT3基础水平的对照。通过ELISA试验(Promega试剂盒)测定NT3的量。表17报告了该实验的结果。
表17NT3量的平均值±S.E.M.(pg每块肌肉和pg/ml血浆)。
在此处的实验条件下，在腓肠肌和颅侧胫骨肌中检测到基础水平的NT3信号。在无电转移时，质粒pXL3149的注射获得的NT3基因表达水平不高于肌肉中NT3的基础检测水平。当使用本发明的方法施用质粒时，观察到肌肉中检测到的NT3量极大增长。也观察到由肌肉分泌的在血浆中检测到的NT3的量在这些条件下非常显著地提高(提高倍数约为35)。
这些结果说明，对于给定量的DNA，本发明的方法可以非常显著地提高DNA的转染效率，并不但在肌肉中而且在血浆中大大提高神经营养因子如NT3的量。
实施例24人生长激素编码基因的转移C57Bl/6小鼠在颅侧胫骨肌中单侧接受质粒pXL3353或质粒pXL3354注射(10μg)。质粒pXL3353(图15)来源于质粒pXL2274，其中引入了人生长激素的整个基因(从转录起始信号延伸到BamHI位点、直到多腺苷酸位点后的224个碱基对的hGH的XbaI/Sph片段)，并置于来自人巨细胞病毒早熟区(hCMV IE)的启动子和SV40病毒晚期区的多腺苷酸化信号控制之下。
通过反转录从人垂体mRNA文库中获得人生长激素cDNA，然后使用下列引物进行30个循环的PCR扩增
5’区的互补寡核苷酸5’-GGGTCTAGAGCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3’该寡核苷酸含有一个XbaI位点和Kozak序列。
3’区的互补寡核苷酸5’-GGGATGCATTTACTAGAAGCCACAGCTGCCTC-3’该寡核苷酸含有一个NsiI位点和终止密码子。
将扩增的片段引入到质粒pCR2.1(TA克隆试剂盒，Invitrogen)中并测序。将含有hGH cDNA的681个碱基对的XbaI/NsiI片段与pSL3353的XbaI/NsiI片段相连接，产生质粒pXL3354(图15)。
电转移条件如下200V/cm；20msec持续时间的8次脉冲；1Hz频率。质粒DNA注射后立即施加电场。小鼠处理7天后检测12000×g离心缓冲PBS中研磨肌肉后上清液中的hGH的存在。通过ELISA(Boehringer Manheim)测定hGH的量。
表18hGH表达的平均值(皮克/肌肉)±S.E.M.。
这些结果显示，电转移可以获得人生长激素的很大程度的提高。也在含有整个基因和其所有调节基因的质粒中观察到了这种提高。
实施例25疫苗转基因的电转移效果本实施例证明，本发明方法还可用于转移编码目的疫苗多肽的基因。
用9周龄雌性Balb/c小鼠进行本实验。所用的电极是间距5mm的不锈钢板式电极。VR-HA是一种含有流感病毒(A/PR/8/34株)血凝素基因的质粒DNA。VRgB是一种含有人巨细胞病毒(Towne株)糖蛋白B(gB)基因的质粒DNA。
纵向穿过皮肤向颅侧胫骨肌中单侧注射质粒溶液(50μl 20μg/ml或200μg/ml于NaCl 0.9％中的溶液)。注射质粒后20秒钟，通过方形脉冲发生器垂直于肌肉轴施加电脉冲(电场强度200V/cm、持续时间为20毫秒的8个连续脉冲，频率为1Hz)。
为了评价免疫应答的刺激，按照下列免疫方案D0→采集免疫前血清标本D1→第一次注射，有或无电转移D21→采集免疫血清标本D22→强化注射，有或无电转移D42→采集免疫血清标本D63→采集免疫血清标本血清标本采自眼眶后窦。用ELISA测定特异性抗体的量。用单侧注射的10只动物在10个点测试每一实验条件。
表19A中显示针对流感血凝素的抗体效价的结果。
表19a在不存在或存在电脉冲时，1μg或10μg DNA(VR-HA)注射后获得的针对流感血凝素的抗体效价。该结果是每组10只动物的几何平均值(对于注射1μg DNA并暴露于电脉冲的组为8只动物，在D63取样)±标准误。通过用非参数曼-惠特尼检验两两比较有电脉冲和无电脉冲的注射组，获得值(p)。
这些结果显示，在用电脉冲处理的组中针对流感血凝素的抗体效价提高大约10倍。实际上，在电脉冲存在下接受1μg DNA的小鼠比接受10μg DNA但无电脉冲处理的小鼠具有略高的平均抗体效价。
表19B显示针对人巨细胞病毒糖蛋白B的抗体效价的结果。
表19B在不存在或存在电脉冲时，10.μg DNA(VR-gB)注射后获得的针对人巨细胞病毒糖蛋白B的抗体效价。该结果是每组10只动物的几何平均值(有电脉冲的注射组动物为9只)±标准误。通过用非参数曼-惠特尼检验两两比较在有电脉冲和无电脉冲存在下的注射组，获得值(p)。
这些结果显示，用电脉冲处理的组中到第42天抗人巨细胞病毒糖蛋白B抗体的效价升高了4倍。还注意到用电脉冲处理的动物组的变异系数平均小三倍。
权利要求
1.一种向一个或多个横纹肌中体内转移核酸的方法，其中通过直接向组织施用或通过局部或全身施用使肌肉细胞与待转移的核酸接触，并且通过对所述肌肉施加一次或多次强度为1-800伏特/cm的电脉冲来确保转移。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于电场强度为4-400伏特/cm。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于电场强度为30-300伏特/cm。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其特征在于施加电场的总持续时间长于10毫秒。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其特征在于向肌肉施加的电场包括一个或多个规则频率的脉冲。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于向肌肉施加的电场包括0.1-1000赫兹频率的1-100000次脉冲。
7.根据权利要求1-4任一项的方法，其特征在于这些电脉冲以彼此之间不规则的方式释放，而且描述依赖于脉冲时间的场强的函数是可变的。
8.根据权利要求1-7任一项的方法，其特征在于描述电场随时间变化的函数的积分超过1kV·msec/cm。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述积分超过或等于5kV·msec/cm。
10.根据权利要求1-9任一项的方法，其特征在于电脉冲选自方波脉冲，产生指数衰减波、短时振荡单极波和短时振荡双极波或其他波形的电场。
11.根据权利要求1-10任一项的方法，其特征在于电脉冲包括方波脉冲。
12.根据权利要求1-11任一项的方法，其特征在于电脉冲是利用置于肌肉两侧或与皮肤接触的电极来施加的。
13.根据权利要求1-11任一项的方法，其特征在于电脉冲是利用引入肌肉中的电极来施加的。
14.根据权利要求1-13任一项的方法，其特征在于将核酸注射入肌肉中。
15.根据权利要求1-13任一项的方法，其特征在于核酸通过系统途径注射。
16.根据权利要求15的方法，其特征在于核酸通过动脉内或静脉内途径注射。
17.根据权利要求1-13任一项的方法，其特征在于核酸通过局部、皮肤、口、阴道、鼻内、皮下、或眼内途径施用。
18.根据权利要求1-17任一项的方法，其特征在于核酸存在于一种组合物中，后者还含有用于不同给药途径的药物可接受的赋形剂。
19.根据权利要求18的组合物，它适于胃肠外给药。
20.根据权利要求1-19任一项的方法，其特征在于核酸是脱氧核糖核酸。
21.根据权利要求1-19任一项的方法，其特征在于核酸是核糖核酸。
22.根据权利要求1-21任一项的方法，其特征在于核酸是合成或生物合成来源的，或者从病毒或原核生物或单细胞或多细胞真核生物中提取的。
23.根据权利要求22的方法，其特征在于施用的核酸是与来源生物和/或合成系统全部或部分成分结合的。
24.根据权利要求1-23任一项的方法，其特征在于核酸编码RNA或目的蛋白。
25.根据权利要求24的方法，其特征在于RNA是催化的或反义的RNA。
26.根据权利要求24的方法，其特征在于核酸编码选自下组的蛋白质酶，血衍生物，激素，淋巴因子，生长因子，营养因子，血管生成因子，神经营养因子，骨生长因子，造血因子，凝血因子，抗原和参与氨基酸、脂类和其他细胞必要成分之代谢的蛋白质。
27.根据权利要求26的方法，其特征在于核酸编码血管生成因子VEGF和FGF，神经营养因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、FGF1、NT3、NT5，Gax蛋白，治疗糖尿病的胰岛素，生长激素，细胞因子，α-1-抗胰蛋白酶，降钙素，瘦素和载脂蛋白，维生素、激素和神经递质合成中的酶。
28.根据权利要求24的方法，其特征在于核酸编码抗体，单链抗体的可变片段(ScFv)或在免疫治疗中具有识别能力的其他抗体片段，或编码可溶性抗体、受体或粘着蛋白的激动或拮抗性肽、或人工的、嵌合的或截短的蛋白质。
29.根据权利要求28的方法，其特征在于核酸编码抗独特型抗体，CD4受体或TNFα受体或乙酰胆碱受体的可溶性片段。
30.根据权利要求26到29中任一项的方法，其特征在于核酸编码一种治疗性蛋白的前体。
31.根据权利要求1到30中任一项的方法，其特征在于核酸为质粒形式。
32.根据权利要求1到30中任一项的方法，其特征在于核酸含有大型基因和/或内含子和/或大或小的调节元件。
33.根据权利要求1到30中任一项的方法，其特征在于核酸是附加体DNA或酵母的人工染色体或微型染色体。
34.根据权利要求1到33中任一项的方法，其特征在于核酸含有允许和/或有利于转基因在肌肉中表达的序列。
35.根据权利要求1到34中任一项的方法，其特征在于核酸与可以增强基因转移的任何类型的载体或这些载体的任意组合相连接，例如病毒、合成或生物合成的物质，或抛射或否的球。
36.根据权利要求1到35中任一项的方法，其特征在于肌肉经过一种旨在改善基因转移的处理，一种经局部或系统施用的药理学性质的处理，或酶、透化、外科、机械、热或物理处理。
37.根据权利要求1到36中任一项的方法，其特征在于可以使肌肉产生生理和/或治疗剂量的物质，产生在肌肉细胞中或被分泌出。
38.根据权利要求1到37中任一项的方法，其特征在于可以通过调节被转染肌肉组织的体积来调节所表达的转基因量。
39.根据权利要求38的方法，其特征在于可以通过利用多个施用位点来调节被转染肌肉组织的体积。
40.根据权利要求1到39中任一项的方法，其特征在于可以通过调节电极的数量、形式、表面和排列，通过改变脉冲的强度、数量、持续时间、频率和形式，及核酸施用得量和体积来调节所表达的转基因量。
41.根据权利要求1到40中任一项的方法，其特征在于可以通过经受局部电脉冲组织的体积来控制所转染组织的局部化。
42.根据权利要求1到41中任一项的方法，其特征在于可以通过切除被转染的组织区域来恢复原始的状态。
43.一种核酸和一种强度为1-800伏特/cm的电场的组合产品，用于体内向横纹肌中同时、分开或时间上交错地施用，用于基于向横纹肌中体内电转移的基因治疗中。
44.根据权利要求43的组合产品，其特征在于电场强度为4-400伏特/cm。
45.根据权利要求43的组合产品，其特征在于电场强度为30-300伏特/cm。
46.根据权利要求43-45任一项的组合产品，其特征在于施加电场的总持续时间长于10毫秒。
47.根据权利要求43-46任一项的组合产品，其特征在于向肌肉施加的电场包括一个或多个规则频率的脉冲。
48.根据权利要求47的组合产品，其特征在于向肌肉施加的电场包括0.1-1000赫兹频率的1-100000次脉冲。
49.根据权利要求43-46任一项的组合产品，其特征在于这些电脉冲以彼此之间不规则的方式释放，而且描述依赖于脉冲时间的场强的函数是可变的。
50.根据权利要求43-49任一项的组合产品，其特征在于描述电场随时间变化的函数的积分超过1kV·msec/cm。
51.根据权利要求50的组合产品，其特征在于所述积分超过或等于5kV·msec/cm。
52.根据权利要求43-51任一项的组合产品，其特征在于电脉冲选自方波脉冲，产生指数衰减波、短时振荡单极波和短时振荡双极波或其他波形的电场。
53.根据权利要求43-52任一项的组合产品，其特征在于电脉冲包括方波脉冲。
54.根据权利要求43-53任一项的组合产品，其特征在于电脉冲是利用置于肌肉两侧或与皮肤接触的电极来施加的。
55.根据权利要求43-53任一项的组合产品，其特征在于电脉冲是利用引入肌肉中的电极来施加的。
56.根据权利要求43-55任一项的组合产品，其特征在于将核酸注射入肌肉中。
57.根据权利要求43-55任一项的组合产品，其特征在于核酸通过系统途径注射。
58.根据权利要求57的组合产品，其特征在于核酸通过动脉内或静脉内途径注射。
59.根据权利要求43-55任一项的组合产品，其特征在于核酸通过局部、皮肤、口、阴道、鼻内、皮下、或眼内途径施用。
60.根据权利要求43-59任一项的组合产品，其特征在于核酸存在于一种组合物中，后者还含有用于不同给药途径的药物可接受的赋形剂。
61.根据权利要求60的组合物，它适于胃肠外给药。
62.根据权利要求43-61任一项的组合产品，其特征在于核酸是脱氧核糖核酸。
63.根据权利要求43-61任一项的组合产品，其特征在于核酸是核糖核酸。
64.根据权利要求43-63任一项的组合产品，其特征在于核酸是合成或生物合成来源的，或者从病毒或原核生物或单细胞或多细胞真核生物中提取的。
65.根据权利要求64的组合产品，其特征在于施用的核酸是与来源生物和/或合成系统全部或部分成分结合的。
66.根据权利要求43-65任一项的组合产品，其特征在于核酸编码RNA或目的蛋白。
67.根据权利要求66的组合产品，其特征在于RNA是催化的或反义的RNA。
68.根据权利要求66的组合产品，其特征在于核酸编码选自下组的蛋白质酶，血衍生物，激素，淋巴因子，生长因子，营养因子，血管生成因子，神经营养因子，骨生长因子，造血因子，凝血因子，抗原和参与氨基酸、脂类和其他细胞必要成分之代谢的蛋白质。
69.根据权利要求68的组合产品，其特征在于核酸编码血管生成因子VEGF和FGF，神经营养因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、FGF1、NT3、NT5，Gax蛋白，治疗糖尿病的胰岛素，生长激素，细胞因子，α-1-抗胰蛋白酶，降钙素，瘦素和载脂蛋白，维生素、激素和神经递质合成中的酶。
70.根据权利要求66的组合产品，其特征在于核酸编码抗体，单链抗体的可变片段(ScFv)或在免疫治疗中具有识别能力的其他抗体片段，或编码可溶性抗体、受体或粘着蛋白的激动或拮抗性肽、或人工的、嵌合的或截短的蛋白质。
71.根据权利要求70的组合产品，其特征在于核酸编码抗独特型抗体，CD4受体或TNFα受体或乙酰胆碱受体的可溶性片段。
72.根据权利要求68到71中任一项的组合产品，其特征在于核酸编码一种治疗性蛋白的前体。
73.根据权利要求43到72中任一项的组合产品，其特征在于核酸为质粒形式。
74.根据权利要求43到72中任一项的组合产品，其特征在于核酸含有大型基因和/或内含子和/或大或小的调节元件。
75.根据权利要求43到72中任一项的组合产品，其特征在于核酸是附加体DNA或酵母的人工染色体或微型染色体。
76.根据权利要求43到75中任一项的组合产品，其特征在于核酸含有允许和/或有利于转基因在肌肉中表达的序列。
77.根据权利要求43到76中任一项的组合产品，其特征在于核酸与可以增强基因转移的任何类型的载体或这些载体的任意组合相连接，例如病毒、合成或生物合成的物质，或抛射或否的球。
78.根据权利要求43到77中任一项的组合产品，其特征在于肌肉经过一种旨在改善基因转移的处理，一种经局部或系统施用的药理学性质的处理，或酶、透化、外科、机械、热或物理处理。
79.根据权利要求43到78中任一项的组合产品，其特征在于可以使肌肉产生生理和/或治疗剂量的物质，产生在肌肉细胞中或被分泌出。
80.根据权利要求43到78中任一项的组合产品，其特征在于可以通过调节被转染肌肉组织的体积来调节所表达的转基因量。
81.根据权利要求80的组合产品，其特征在于可以通过利用多个施用位点来调节被转染肌肉组织的体积。
82.根据权利要求43到81中任一项的组合产品，其特征在于可以通过调节电极的数量、形式、表面和排列，通过改变脉冲的强度、数量、持续时间、频率和形式，及核酸施用得量和体积来调节所表达的转基因量。
83.根据权利要求43到82中任一项的组合产品，其特征在于可以通过经受局部电脉冲组织的体积来控制所转染组织的局部化。
84.根据权利要求43到83中任一项的组合产品，其特征在于可以通过切除被转染的组织区域来恢复原始的状态。
全文摘要
本发明涉及向横纹肌中体内转移核酸或与提高转移效率的物质结合之核酸的改善的方法,还涉及用于基因治疗应用的核酸与本发明转移方法的组合。
文档编号C12N5/08GK1261807SQ9880667
公开日2000年8月2日 申请日期1998年6月30日 优先权日1997年6月30日
发明者M·布瑞奥, L·密尔, D·舍曼 申请人:罗纳-布朗克罗莱尔股份有限公司, 古斯达威罗斯研究所, 国家科研中心