专利名称：真核细胞和反转录病毒反义起始元件的制作方法
技术领域：
本发明的实现部分得到国立卫生研究院授予的补助金R29AI38114和RO1MH47225的政府资助。政府在本发明中享有一定权利。
背景技术：
发明领域本发明涉及真核细胞中基因表达的调节。更具体地说，本发明涉及一种新的天然的反义RNA负调节系统，该系统采用的基因元件提供了产生反义转录本的机制。
背景和相关领域描述启动真核细胞基因的转录的一般机理通常涉及几种因子之间的相互作用，这些因子包括启动子(启动元件)、增强子、DNA结合蛋白和包含RNA聚合酶和伴随转录因子的转录复合物。通常，富含AT的区域TATA基序位于转录起始位点的上游，它是许多启动子启动RNA聚合酶有效和准确转录所必需的。在有或没有TATA盒的启动子中，启动元件可使转录因子取向于RNA聚合酶II。然而，转录的启动速率由识别转录复合物启动位点附近的启动子/增强子元件的一个或多个DNA结合蛋白来决定。据推断，DNA结合蛋白能影响转录复合物的启动或复合物一旦启动后延伸的趋势。
人免疫缺陷病毒(HIV)的5′长末端重复序列(LTR)是一种原型增强子-启动子单元，它含有一个标准的TATA盒，一个起始位点(Rittner等人，1995，J.Mol.Biol.248562-580)、许多病毒和细胞基因中常见的上游元件(例如Sp1和NF-κB)(它们受病毒和细胞DNA结合蛋白的影响(例如参见，Jones，1989年，New Biologist 1127-135中综述))。从HIV双链中间产物以及位于5′LTR中的HIV启动子，从负链(也称为“模板”)DNA(见本文的定义部分)转录出正链极性mRNA。然后，mRNA依赖于转录本翻译成一个或多个病毒蛋白，它们包括Gag，Pol，Vif，Tat，Vpu，Vpr，Rev，Env和Nef。
HIV启动子的有效转录取决于大幅度增加病毒mRNA水平的激活转录的Tat的存在。在没有Tat存在时，从负链DNA转录出的主要是短的mRNA转录本。这些短的转录本终止于顺式作用元件(反式激活应答区域)附近(TAR；Selby等人，1989，GenesDev.3547-558)。另外，在Tat不存在时，转录出的是低基础水平的病毒mRNA。Tat的功能是通过位于转录起始位点下游的TAR来介导的。在转录本上的TAR区域折叠成在能量上有利的RNA次级结构或RNA-干(stem)环结构(见
图1)，作为Tat的结合位点。已经证实，在Tat不存在时，已经启动了转录的大部分聚合酶提前从模板上脱离下来。在Tat结合TAR后，Tat独立于其它启动子元件起刺激延伸的作用(Rittner等人，1995，同上)。已经报道，起始元件(INR)是哺乳动物细胞中缺乏TATA盒时使转录起始有效所必需的(Javahery等人，1994，Mol.Cell Biol.14116-127；Smale和Baltimore，1989，Cell 57103-113)。为何HIV LTR的基础性(独立于Tat)转录在体内较低，是否有影响HIV5′LTR的某种阻遏机制存在，这些仍不能确定。
提出的一种可能是，病毒DNA的正链含有一个长的开放读框(ORF)，它位于互补于env基因序列的基因组区域中，它可能编码了一个病毒蛋白(Miller，1988，Science2391420-142)。然而，还不清楚这种可能是否能通过(例如)证实有推定蛋白或其各自mRNA而得到确认。Michael等人进一步评价了HIV中发生双向转录的可能性(1994，J.Virol.979-87)。发现HIV 3′LTRU3区域中的一个弱的负链启动子负责产生负链极性的RNA转录本。从3′LTR中的弱负链启动子产生的这种RNA转录本在HIV生命周期中起何作用(如果有的话)仍有待阐明。
调节病毒或细胞基因表达的通道(无论是涉及转录还是翻译)是本发明的目标。更具体地说，调节工业或医药应用的重组蛋白的产生是生物技术工业的共同目的。以HIV为例，已经利用反式激活功能来开发HIV特异的、灵敏的生物试验(Felber和Pavlakis，1988，Science 239184-7)，并用来评价药物对HIV感染和复制能力的影响(例如参见，Schwartz等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 867200-7203)。已经尝试了几种方法来反义抑制细胞或病毒基因表达。例如，反义抑制HIV复制已经在抑制一些病毒功能方面获得了不同程度的成功。在HIV中反义抑制的靶向部位包括LTR、U5区域、U3区域、R区域、引物结合位点区域、AUG起始密码子区域、Poly P区域、RNA剪接位点、前导区、tat剪接位点、rev剪接位点和帽(cap)部位(例如参见美国专利No.5,580,761，授予Greatbatch等人)。还提出，与TAR干-环的二级结构反义的合成寡核苷酸可能能破坏TAR干-环(Vickers等人，1991，Nucleic Acids Res.193359-3368；美国专利No.5,512,438，授予Eckers)，或与tat mRNA反义(美国专利No.5,51,438，授予Eckers)的合成寡核苷酸最终能破坏Tat和TAR结合所介导的反式激活。
因此，现在已经需要并仍继续需要在细胞内产生能在转录和/或翻译水平上起有效调节基因表达作用的反义分子。理想的是，可以采用这种方法来进行反义治疗，从而“翻转”哺乳动物细胞中固有的转录和/或翻译的控制机制。
发明概述本发明涉及发现一种真核细胞内源的在转录和/或翻译水平调节基因表达的天然新机制。本发明公开的机制是一种天然的反义RNA调节系统，该系统的一个关键组分包含反义起始序列(antisense initiator sequence，aINR)。
aINR使RNA聚合酶II的取向能产生一个或多个反义转录本；即利用正链DNA作为模板引发负链极性RNA转录本的产生。已经发现，aINR启动产生的天然反义RNA转录本起结合互补有义RNA转录本形成双链体的作用。产生的双向转录以及该RNA双链体的形成可通过抑制有义mRNA转录本的转录来调节基因表达。RNA双链体的形成所介导的基因表达调节机制是使RNA聚合酶去稳定，从而促进有义mRNA转录的提前终止。因此，该机制可能导致抑制转录延伸或使负链DNA转录出短(小于全长)的mRNA或RNA有义转录本。
在注意到aINR是双链的同时，aINR的7个碱基共有序列(5′到3′)是G/A G/A A/TN T G G/A，其中第一个核苷酸可以是G或A；第二个核苷酸可以是G或A；第三个核苷酸可以是A或T；第四个核苷酸可以是G、A、T或C；第五个核苷酸可以是T；第六个核苷酸可以是G；第七个核苷酸可以是G或A。在本发明的另一个实例中，aINR的3′端可包括一个额外的核苷酸，第八个核苷酸，它包括G或A。
本发明提供了调节基因表达的组合物和方法。构建一个载体，它含有至少一个aINR拷贝，该aINR在至少一个拷贝的核酸分子(靶基因的编码链)的下游。aINR的下游可以放置一些调控元件(例如任一方向的CAAT；或相对于aINR共有序列反向的TATA盒)。然后将所得重组载体导入表达待调节靶基因的细胞中。一旦进入细胞，重组载体的aINR就启动RNA聚合酶II产生反义RNA转录本。然后，该反义RNA转录本通过和靶基因转录的有义mRNA形成RNA双链体，调节靶基因的表达。由于靶基因的转录受抑制，因此只有很少(如果有的话)的全长有义mRNA转录本能被翻译成该靶基因编码的蛋白。因此，这种调节能导致受处理细胞产生这种蛋白的量减少。
附图简述图1示出了HIV-1 TAR和毗邻区域，图中用箭头指出了HIV-1反义启动序列(aINR)(SEQ ID NO2)的位置。
图2是HIV-1 LTR的示意图，它显示了各种调控元件、双向转录、以及HIV aINR产生的反义转录本可能调节转录和/或翻译的一种或多种机制。
图3是体外转录反应的2％琼脂糖凝胶，转录反应后在初始反转录步骤中用生物素化有义引物(组A，泳道1-7)或反义引物(组B，泳道1-7)杂交，然后进行聚合酶链反应。组A和B的泳道1代表阳性转录对照(模板+聚合酶)；而泳道2代表阴性转录对照(模板，没有聚合酶)。组A的泳道3和4以及组B的泳道3和5代表在HIV aINRRNA存在(分别为10x和5x)时的转录；而组A和B的泳道6和7代表在HIV反义TARRNA存在(分别为10X和5X)时的转录。图中还示出了只有引物(组A泳道5和组B泳道4)以及用作参照的大小标记。
图4示出了HIV的5′LTR、从其衍生的截短的dsDNA模板、以及用于体外转录然后进行RNA酶保护试验的探针。
图5示出了经RNA酶保护试验的体外真核转录反应的结果，用8％变性凝胶上的电泳分析RNA保护的片段。泳道1是与生物素化的有义探针杂交的对照RNA酶消化试验。泳道2-6代表图4所述的不同大小的模板，这些模板用于体外转录试验，和生物素化的有义探针杂交，然后用RNA酶消化；泳道10是与生物素化的反义探针杂交的对照RNA酶消化试验；泳道11-15代表图4所述的不同大小的模板，这些模板用于体外转录试验，和生物素化反义探针杂交，然后作RNA酶消化。泳道7和9是用作参照的大小标记。
图6代表真核转录反应的引物延伸试验结果，该结果通过在8％变性凝胶上电泳然后膜转移和比色检测分析获得。泳道1是核抽提物对照(不加入DNA模板进行体外转录，然后通过引物延伸来分析)；泳道2代表从HIV aINR产生的RNA制得的cDNA，然后杂交和用反义探针(反义RNA的负对照)延伸；泳道3代表HIV aINR产生的RNA，和有义探针杂交和延伸。
图7代表在测定HIV aINR产生的反义RNA的试验中体外真核转录反应的结果，该结果通过逆转录聚合酶链反应，然后作琼脂糖凝胶电泳分析获得。
发明详述定义出于说明书或权利要求的目的，术语“反义起始序列”或“aINR”及其“功能性等价物”是指在真核DNA中(如哺乳动物DNA)或采用真核调控元件的病毒DNA中的一个双链基因元件，(a)当其置于顺式作用方向上、一DNA分子的下游并和该分子操作性相连时，它调节靶基因在哺乳动物细胞中的表达；(b)它启动操作性相连的DNA分子转录为负链极性(反义)RNA转录本，该转录本和靶基因产生的有义RNA转录本特异结合形成RNA双链体；和(c)它具有G/A G/A A/T N T G G/A的共有序列。
在本发明的另一个实例中，aINR的3′端可包括一个额外的第8个核苷酸，该核苷酸包括G或A。“顺式作用”指DNA分子的正链和aINR的共有序列在同一条链上。另外，与SEQ ID NO1公开的aINR共有核苷酸序列相同的核苷酸序列(除了有一个碱基变化或替代外)能基本上(在SEQ ID NO1活性的大约50％至高于100％之间)象SEQ ID NO1那样起作用，因此它是功能性等价物，因为它基本上能够在真核细胞中启动所需DNA分子的转录。
出于说明书或权利要求的目的，术语“操作性相连”是指化学融合(受到随后的连接限制)或DNA的合成，这样，aINR启动的转录从合适的方向和在待转录成功能性反义RNA的DNA分子读框内形成了DNA分子-aINR组合。在构建DNA分子-aINR组合时，通常较佳的是将aINR置于DNA分子下游与其天然设定中的距离大致相同的距离处。然而，如本领域中所知道的，对该距离可作一些变化而不会丧失起始功能。同样，可在aINR的下游表现出增强aINR启动的最佳距离处放置额外的包括调控元件(例如CAAT盒或反向的TATA盒的互补序列)的DNA序列。
出于说明书或权利要求的目的，术语“基本上由一个核苷酸序列组成”是指本文公开的核苷酸序列，还包括其中除一个碱基变化或替换外其余都相同的核苷酸序列。
出于说明书或权利要求的目的，术语“个体”或“宿主”是指任何哺乳动物，尤其是人、植物和利用真核转录机制的病毒。
出于说明书或权利要求的目的，术语“DNA分子”是指含有调控序列的双链(ds)核酸序列，该调控序列涉及靶基因和/或基因序列转录的启动和效率，使得该DNA分子被转录成负链极性RNA转录本，该转录本的功能是和靶基因产生的有义RNA转录本结合形成RNA双链体。
出于说明书或权利要求的目的，术语“正链”或“正链极性”指选自靶基因编码序列的单链(ss)DNA分子，或是转录成与aINR引发的反义RNA互补的mRNA或RNA的DNA序列链。
出于说明书或权利要求的目的，术语“负链”或“负链极性”指与正链互补的单链(ss)核酸分子。
出于说明书或权利要求的目的，术语“互补”指单链核苷酸序列具有足够数量的配对碱基，它通过随后发生的氢键键合和另一单链核苷酸序列特异性(非随机性)杂交出于说明书或权利要求的目的，术语“重组表达载体”指一个核酸构建物(载体序列)，它包含的aINR和DNA分子操作性相连，从而在合适的宿主中实现aINR的转录。载体可以包括(但不局限于)质粒、噬菌体、病毒载体、病毒样载体或潜在的基因组插入物(例如参见Mulligan等人，1993，Science 200926-923)。
出于说明书或权利要求的目的，术语“调控元件”指上游启动子元件基序，其作用是促进结合RNA聚合酶或转录启动、活性和效率的转录因子。真核调控元件包括(但不局限于)TATA盒、TATA样盒(如TTTAA、TTTAAA、TAT、TAATA)、CAAT盒、CAAT样盒(如CTAATC)、上游刺激因子(USF)、上游序列元件(USE)和转录因子结合部位(例如AP-2、SP1、CRE、PEA-3、NF-IL6等)。
影响真核细胞中正常生理过程和病理过程中的能力很大程度上取决于真核细胞中基因表达的调节。在分析反转录病毒和哺乳动物细胞的表达时，发现了一个新的基因元件以及该元件调节基因表达的机制。然而，该基因元件并不局限于哺乳动物。由于发现它也存在于反转录病毒中，因此它可能代表了更通用(即真核细胞)的控制机制。分离该基因元件并作性质分析，结果揭示它包含一个7个碱基对(bp)的元件，它的作用可能是启动负链极性RNA转录本，该转录本通过反义机制直接抑制相对的DNA互补链中基因有效转录所需的转录起始位点和/或激活剂的总体转录机制。在另一个实例中，基因元件可以延长至8个碱基对以进一步增强作用。在天然的设定中，通常元件可选择要置在正链极性启动子(如TATA盒)和其调节的基因的起始编码区之间，或在基因的编码序列中。这种转录阻遏机制是一种天然的反义RNA调控系统，该系统的关键组分包括一个被称为“反义起始序列”的元件。
根据本发明的一个实例，用重组DNA技术将至少一个拷贝的aINR和至少一个拷贝的DNA分子操作性相连并插入表达载体中。然后将重组载体导入合适的宿主细胞中，指导负链极性RNA转录本的表达，该转录本直接抑制靶基因在该特定宿主细胞中有效转录所需的转录起始位点和/或激活剂的总体转录机制。本发明的这种转录阻遏方法包括将重组载体导入宿主细胞内，从而使aINR产生的反义转录本能下调靶基因在宿主细胞中的表达。本领域技术人员应当理解，重组载体能导入培养中的宿主细胞内(体外)，或能导入体内细胞中(例如在基因治疗应用中)。
在参看了下列实施例后显然能更全面地了解本发明及其具有的许多优点，提供这些实施例是为了帮助了解本发明的特征，并使本领域技术人员能制备和使用本发明的新的反义起始序列。下列实施例的目的是为了描述本发明，而不应被认为限制了本发明的范围。
实施例1人免疫缺陷病毒中的aINR根据本发明，从反转录病毒DNA鉴别出一种反义起始序列并作了图谱。如图1所示，HIV-1 aINR(SEQ ID NO2)位于通常的HIV-1启动子和转录起始位点的下游。该HIV-1 aINR位于5′LTR(也在3′LTR)R区域内，更具体地说，在称为TAR区的双链DNA区域内。aINR位于通常的有义HIV-1转录的帽位点和起始位点约21-27核苷酸处，它排列产生方向相反并和已知的HIV-1转录本TAR区起始部互补的转录本。aINR产生的反义转录物与所有HIV-1有义转录物的起始部至少25个核苷酸互补，但可能包含长度超过25个核苷酸的互补序列。
RNA转录本上的TAR区域和Tat结合导致转录激活，该激活大大提高了由HIV5′LTR启动子转录出的正链极性病毒mRNA的水平。功能性Tat蛋白以及TAR序列均是Tat反式激活后观察到的全长转录本增加以及HIV-1存活所需要的(Cullen，1992，Microbiol.Reviews 375-394)。如本文所证实的以及图2所述的，该HIV aINR启动了与TAR RNA序列部分反义的转录。HIV aINR DNA含有的序列与包含TAR RNA中Tat蛋白结合位点的序列的一部分相似(Weeks等人，1990，Science 2491281-85)。HIVaINR能产生RNA转录本，该转录本能和HIV-1有义启动子转录出的mRNA形成RNA双链体。这种RNA双链体的形成能通过一种或多种机制来调节HIV有义初级转录本的有效合成，进而调节HIV-1基因表达，这些机制包括抑制或弱化RNA聚合酶II有效地延伸有义转录本，影响有义mRNA的稳定性或在其胞核内加工，以及抑制转录起始中帽位点的功能(另如图2所述)。
在体外或体内进行试验观察转录，以证实该HIV aINR能引发反义转录本，并且产生的反义转录本能起抑制强噬菌体启动子转录的作用。
噬菌体转录系统噬菌体转录系统采用与噬菌体启动子相连的HIV LTR模板，用该系统来产生反义RNA并证实类似于aINR产生的RNA的反义转录本能在体外抑制“有义”转录。合并扩增反应(聚合酶链反应，PCR)片段，产生HIV-1 LTR双链(ds)DNA模板(称为5′T7HaeIII-3′HindIII-SP6)，使得模板5′端含有T7位点。因此，5′端从HIV-1 SP-1结合位点延伸至刚好超过TAR区域，总共长度约为213bp。用聚合酶链反应另构建其它两个双链DNA模板，并用来在体外分开的反应中制备纯化的反义RNA其中设计TAR双链DNA模板(SEQ ID NO3)来制备反义TAR RNA，设计HIVaINR双链DNA模板(SEQ ID NO4)来制备反义HIVaINR RNA。如下所述用缓冲试剂建立平行的转录反应1.5′T7HaeIII-3′HindIII-SP6模板+T7 RNA聚合酶；2.5′T7HaeIII-3′HindIII-SP6模板(阴性对照)；3.5′T7HaeIII-3′ HindIII-SP6模板+纯化的反义TAR RNA(在5′T7HaeIII-3′HindIII-SP6模板中加入10X或5X)+T7 RNA聚合酶；和4.5′T7HaeIII-3′HindIII模板+纯化的反义HIVaINR RNA(在5′T7HaeIII-3′HindIII模板中加入10X或5X)+T7 RNA聚合酶。
培育后，用DNA酶I处理每个体外转录反应物，除去双链DNA模板，然后用苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀，获得纯化的合成的RNA。然后用反转录聚合酶链反应分析每一反应的纯化的合成的RNA。如图3的2％琼脂糖凝胶所示，对组A泳道1-7代表的反应物作如下分析在最初的反转录步骤中采用“有义”的生物素化的引物(5′SpI-IIB)，然后用5′SpI-IIB引物和3′T7引物(LTR序列，核苷酸442-477)进行聚合酶链反应。这样，组A中的泳道将检测以反义方向排列的负链极性的RNA转录本。由于T7 RNA聚合酶只能以5′T7 HaeIII-3′HindIIISp6模板有义方向合成RNA转录本，因此组A泳道合理地显示出没有产生反转录PCR产物(即只显示出引物和引物二聚体)。如图3所示，对组B泳道1-7代表的反应物作如下分析在最初的反转录步骤中采用“反义”的生物素化的引物(3′HindIII-B)，然后用5′R引物和3′HindIII-B引物进行聚合酶链反应。这样，组B中的泳道检测出由T7 RNA聚合酶合成的以有义方向排列的RNA转录本。组B泳道1显示出含有5′T7HaeIII-3′HindIII模板+T7RNA聚合酶的体外转录反应得到的RNA转录本，然后用反转录聚合酶链反应分析。该泳道合理地显示出从该反应制得的RNA转录本产生的反转录PCR产物(同时还显示了引物和引物二聚体)。组B泳道2合理地显示出在只含有5′T7HaeIII-3′HindIII模板(阴性对照而没有T7 RNA聚合酶)的体外转录反应中没有产生转录本。组B泳道3(10X)和泳道5(5X)证实了体外转录反应中反义HIV aINR RNA转录本的存在抑制了T7 RNA聚合酶对5′T7HaeIII-3′HindIII模板的体外转录。类似地，组B泳道6(10X)和泳道7(5X)证实了反义TAR RNA的存在在5′T7HaeIII-3′HindIII模板体外转录期间抑制了T7RNA聚合酶合成RNA。
总之，该体外转录试验表明，从HIV aINR延伸的反义RNA转录本能抑制有义HIV RNA转录本的产生，甚至能抑制诸如T7噬菌体启动子的强启动子产生RNA转录本。
果蝇属体外转录系统该真核转录系统采用果蝇胚胎核抽提物来提供转录因子和RNA聚合酶II；该系统证实了HIV aINR在其自身启动子下的功能。该体外系统被用作体内过程的模型，因为一旦HIV整合到人宿主T细胞染色体DNA中，它依靠真核细胞转录因子和RNA聚合酶II来转录其基因。
A.RNA酶保护试验采用能在体外从真核起始子有效转录的真核转录系统(商用的果蝇胚胎核抽提物转录系统)来调查是否能从HIV aINR引发真核转录。如前所述(Ludwig等人，1995，Nucleic Acids Res.233792-93)，用含有特异性HIV-1序列以及噬菌体T7或SP6聚合酶启动子序列的引物和HIV-LTR模板，通过聚合酶链反应产生四种不同的HIV-1 LTR片段。如图4所示，用于体外转录的四种截短的双链DNA模板包括具有两个Sp1位点和TATA盒的5′HaeIII-PBS(SP6)3′模板；缺少所有Sp1位点并将TATA盒二等分的5′PvuII-PBS(SP6)3′模板；从mRNA帽位点和起始位点起截短48bpTAR区域的5′(T7)PvuII-ScaI(SP6)3′模板；和不含HIV-1启动子Sp1位点、也不含TATA盒的5′(T7)R-BssHII(SP6)3′模板。
对每个模板和果蝇核抽提物进行体外转录反应，基本上采用生产商说明书的条件。然后用DNA酶I处理各个体外转录反应物，除去DNA模板，然后苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，从合成的RNA中除去DNA酶。然后用RNA酶保护试验分析每一反应的纯化的合成的RNA，试验基本上如试剂盒生产商所述那样进行，只是采用生物素化的RNA探针进行杂交，然后用RNA酶T1消化。如前所述(Ludwig等人，1995，同上)，用T7 RNA聚合酶(针对有义探针)或SP6 RNA聚合酶(针对反义探针)体外合成生物素化的RNA探针。如图4所示，生物素化的有义探针含有从帽位点延伸到BssHII位点的HIV-1序列，因此包括了TAR区域。然后如下所述分析杂交的和保护的片段在8％变性凝胶上电泳，然后进行膜转移和比色检测(Ludwig等人，1995，同上)。
如图5泳道10-15所示，在通常的有义方向没有引发转录本，因为RNA酶消化试验证实反义探针不能杂交，从而保护了有义转录本。将反义探针加上tRNA的RNA酶消化对照(泳道10)和泳道11-15(反义探针+样品RNA)作比较。重要的是注意到用于该试验的果蝇抽提物本身缺少Sp1蛋白。因此，含有SP1位点的所有模板的有义转录缺少了主要的推动力，从而能在分离物中观察到反义转录。所有四个模板的TAR区DNA均含有HIV aINR。如果从HIV aINR引发了反义转录，则转录本和有义探针之间互补碱基对的预计的重叠区域(受杂交保护的RNA的预计大小)将为26-28个核苷酸，这取决于模板。尽管生物素化的有义探针(泳道1，对照RNA酶消化有义探针+tRNA)有大量的二级结构，检测到受保护的HIV aINR产生的预计大小的反义转录本(见箭头)，如图5泳道2-6所示。在该体外转录试验中用缺少HIV aINR的双链DNA模板没有观察到反义转录物(结果未显示)。通过逐步截短HIV-1 LTR区域用作体外转录反应的模板，作出最小的aINR图谱。
总之，和RNA酶保护试验结合的该体外真核转录系统表明，HIV aINR能产生与含TAR区序列的HIV-1有义RNA转录本方向相反且互补(如反义)的转录本。
B.引物延伸用体外真核转录系统和5′(T7)PvuII-SacI(SP6)3′HIV-1模板(双链DNA)，通过引物延伸分析任何存在的RNA转录本(在DNA酶消化、苯酚氯仿抽提和乙醇沉淀之后)。引物延伸用未标记的引物进行，但是在AMV反转录酶介导的cDNA合成反应期间掺入生物素-16-dUTP。如图6所示，所有泳道中出现的大分子量物质均由果蝇核抽提物提供(见泳道1，核抽提物对照，其中体外转录时没有加入DNA模板，然后用引物延伸分析)。另外如图6所示，纯化的RNA的引物延伸证实，HIV aINR产生的RNA和有义引物(5′(T7)PvuII)延伸出预计大小(如泳道3箭头所示)的cDNA产物；但是和反义引物(3′SacI-SP6)却不会(泳道2)。
总之，该体外真核转录系统与分析体外转录的RNA的引物延伸试验相结合，结果表明HIV aINR甚至能在通常的“有义”HIV-1启动子元件不存在下起引发反义转录本的作用。
体外转录系统特别重要的是要证明该HIV aINR能在体内指导产生反义转录本。HIV aINR的体内转录通过对分离自己经转染了pHIV-CAT的人Jurkat T细胞的RNA作反转录酶-PCR，并和转染对照比较来分析。质粒pHIV-CAT含有HIV-1 LTR U3和R序列，它们在氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的5′端。在增强细胞摄取质粒的转染剂(TransfectamTM，Promega)存在下，进行质粒DNA的转染。在96孔微量滴定板的一个孔中，将3.8×105细胞和质粒DNA(每0.182微升转染剂0.086微克质粒DNA)混合，采用基本上如生产商所述的条件培育2小时。对照转染反应包括pHIV-CAT加上pSV-βgal加上转染剂(以评价转染效率)、单用转染剂(没有质粒DNA；“模拟转染”)、或没有接受任何处理。然后将各转染反应的的细胞重悬于细胞培养基中培养2天。然后用本领域已知的方法和试剂从培养细胞中抽提出RNA。纯化分离抽提出的RNA，然后用5′AvaI有义引物(含有HIV-1 LTR增强子元件上游的序列)对样品RNA作反转录，然后用5′AvaI有义引物和含有与TAR序列起始区互补的序列的3′反义引物(SEQID NO9)通过30轮聚合酶链反应扩增变性(94℃，45秒)、退火(70℃，45秒)和延伸(72℃，2分钟)。然后用3％琼脂糖凝胶电泳分析反转录PCR产物。结果如图7所述。
在图7中，标为“m”的泳道代表DNA大小标准标记。阳性RT-PCR对照(图7，泳道“+”)代表在反转录步骤中采用AvaI引物，然后用5′AvaI有义引物和3′反义引物，设计这些引物来扩增对照反义RNA模板，其合成如前所述(Ludwig等人，1995，同上)。阴性对照反转录PCR反应(图7，泳道“-”)显示没有扩增产物(微弱的条带代表引物)，这表明纯化的RNA样品没有DNA(pHIV-CAT)污染。从HIV-1反义转录本扩增得到的预计大小为183bp的双链DNA产物是清晰可见的(图7，显示了三组，泳道“a”pHIV-CAT和转染对照质粒pSVgal；泳道＂b＂pHIV-CAT)。标为＂s＂的泳道代表在指定质粒转染后用PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)和钙离子载体(T细胞激活剂)刺激转染的T细胞。
不论刺激存在与否，HIV aINR均在人T细胞内体内产生HIV-1反义RNA。到目前为止的数据(未显示)提示，HIV aINR在转染的人T细胞中体内产生的反义RNA代表了TAT不存在时从HIV-1 LTR产生的总RNA的显著的一部分。
实施例2哺乳动物aINR根据本发明，在通过产生反义转录本调节哺乳动物基因表达的区域内，可能发现并已经发现了反义起始序列。例如，转录沉默子包含一个负调控元件，它可能在CD4基因(或转基因)的增强子和启动子之间，或在启动子和基因之间，从而位于CD4转录起始位点的下游(是其天然的设定)(Sawada等人，1994，Cell 77917-29，纳入本文作参考)。将该转录沉默子，CD4沉默子，缩小到位于转录起始位点下游约2kb处的428bp限制性片段内；这样，转录沉默子可能在距其阻遏的基因的起始位点至少2kb处起作用。根据本发明，在428bp CD4沉默子中至少发现一个aINR(SEQ ID NO5)位于序列的183-191之间。CD4基因的转录阻遏机制模型是用HIV LTR观察到的。例如，CD4基因表达在DN(CD4-，CD8-)胸腺细胞中受转录阻遏，但是在DN胸腺细胞发展到DP阶段(CD4+、CD8+)时受到上调，这可能是阻遏蛋白/沉默子机制失活的结果。同样，看来HIV LTR启动子的转录阻遏(可能由HIV aINR介导)通过Tat和TAR的结合而无效(或失活或降低至对转录阻遏HIV LTR启动子无效的低基础水平)。
在另一个实施例以及T细胞受体γ基因(TCRγ)在TCRαβ+细胞中的表达受阻遏的报道中，鉴别出一个含有多个转录沉默子的区域(Lefranc和Alexandre，1995，Eur.J.Immunol.25617-22，纳入本文作参考)。侧接TCRγ基因的该转录沉默子包含在1.2kbSacI B片段中。数据表明，TCRαβ+细胞中TCRγ基因座的沉默系由转录活性沉默子介导。根据本发明，在1.2kb TCRγ沉默子中发现了至少一个aINR(SEQ ID NO6)，它位于含有沉默子的B片段序列的核苷酸853-859处。
在另一个实施例中以及T细胞受体α基因(TCRα)在TCRγδ细胞中的表达受阻遏的报道中，鉴定出一个含有多个转录沉默子的区域(Winoto和Baltimore，1989，Cell59649-55，纳入本文作参考)。另外，该报道还提供了以前描述的不依赖于启动子/增强子的方向和距离、阻遏转录的负调控元件的简单综述(“不依赖”通过以不同位置和方向放置含元件的大片段，结果不影响其立即转录来确定)。两个TCRα转录沉默子各自位于300+bp片段处。例如，根据本发明，在309bp TCRα转录沉默子SIL I中发现至少一个aINR(SEQ ID NO7)，它在SIL I序列的核苷酸85-92处。
表1描述了各种aINR序列的比较，以及根据本发明获得的共有序列。
表1aINR序列中的碱基位置
N＝A，T，G或C在鉴定出共有的aINR序列后，可用本领域已知的标准方法制备aINR或含有aINR的核酸序列。例如，可用酶促核酸扩增来从含有aINR的核酸序列扩增aINR，然后纯化包含aINR的扩增产物。另一种方法是用核酸合成仪和相关的标准生物化学技术，其中aINR能通过化学合成。
实施例3含有aINR的重组载体本发明提供了调节基因表达的组合物和方法。可以构建一个载体，它含有至少一个拷贝的aINR，该aINR在至少一个拷贝的具有待调节序列的DNA分子的下游并与其顺式操作性相连。在aINR序列的下游邻近处(如本领域技术人员所知的)可以放置一个或多个调控元件(例如CAT盒、TATA盒)，以便和aINR一起在传递信号和引发反义转录本转录中起作用。然后将所得重组载体导入表达待调节靶基因的细胞中。一旦进入细胞，重组载体的aINR就引发产生反义RNA转录本。然后，该反义RNA转录本通过和靶基因转录出的有义mRNA形成RNA双链体来调节靶基因的表达。另外，靶基因的双链DNA和反义RNA转录本之间可能形成三联体。由于靶基因的转录受抑制，因此只有很少(如果有的话)的全长有义mRNA转录本能被翻译成该靶基因编码的蛋白。因此，这种调节可能导致受处理细胞产生这种蛋白的量减少。
在制备该载体时有几个考虑因素。
A.基础构建物用于本发明作为导入宿主细胞并从其中插入的aINR产生反义转录本的运载体的载体可以选自质粒、病毒、反转录病毒、噬菌体、或作为染色体插入物有待整合。本领域技术人员应当理解，基础载体的常见特征将根据以下这些因素而不同，这些因素包括(但不局限于)后来的重组载体在体外还是在体内导入宿主细胞，以及待调节的基因表达是单拷贝或多拷贝基因(例如在这种情况下载体的拷贝数可考虑作变化)。然而，用于本发明方法的载体的一些基础特征包括它具有选择标记用来鉴定已转染了载体的宿主细胞；它具有限制性位点以便将至少一个拷贝的aINR克隆到至少一个拷贝的DNA分子的下游并和其顺式操作性相连，形成重组载体。另外，在某些情况下，可能还需要提供一种能“关闭”或阻遏aINR的机制，从而使aINR不再产生反义转录本。
可获得的并且有用的基础载体的例子是本领域技术人员已知的，它们包括(但不局限于)质粒pRSVneo，pSV2gpt，pSV2neo和pCMV。特别可用来在体外或体内将基因或DNA分子输送给哺乳动物细胞的载体是各种病毒载体，其包括(但不局限于)反转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体以及Sindbis和其它RNA病毒(例如Mulligan，1993，Science260926-932中回顾的病毒)。
例如，用于基因治疗应用的一种较佳的载体是细小病毒载体，它能稳定地定点整合转移的重组DNA分子。由于AAV和目前已知的任何人类疾病没有关系，因此用AAV制成的载体或杂交的细小病毒载体看来可安全用于(例如)基因治疗应用(例如参见Chatterjee等人，1992，Science，2581485-1488；美国专利No.5,252,470，授予Srivastava)。在该AAV载体中，ITR(末端反向重复序列)中的启动子能驱动新霉素磷酸转移酶基因或其它标记基因的表达，而aINR驱动转录成反义RNA。AAV载体的ITR还提供了一种将载体及其中插入的序列整合到染色体中方法，因为ITR是一种已表明能定点(而不是随机)插入染色体的序列。另一个较佳的载体是复制缺陷型腺病毒，它缺失了复制所需的一个或多个基因(例如E1A-E1B以及E3区域)。
B.重组载体构建采用本领域中的标准方法，至少一个拷贝的aINR在至少一个拷贝的DNA分子的下游并与其操作性顺式相连，该DNA分子具有涉及靶基因启动、或延伸、或转录的序列(待调节的系列)。aINR序列的下游邻近处(如本领域技术人员所知的)可放置一个或多个调控元件(例如逆向的CAT盒、TATA盒)，以便和aINR一起在传递信号和引发反义转录本转录中起作用。aINR和DNA分子均插入并连接入基础载体中，形成本发明的重组载体。为了确认重组载体的构建合适，可以采用标准方法，例如用限制性酶消化和琼脂糖凝胶电泳和/或双脱氧测序分析来分析载体中插入的方向。
本领域技术人员当理解，重组载体中与DNA分子操作性相连的aINR拷贝数可以依据试图调控的基因表达而变化。例如，在HIV中，为了克服Tat灭活HIV aINR介导的HIV LTR启动子的转录阻遏，希望有多拷贝(例如10至50个或更多)的DNA分子-HIV aINR组合。另外，如果待调控的基因表达是单拷贝或多拷贝的基因、或以相当高的效率转录(即来自本领域技术人员已知的强启动子和增强子组合)，则需可能要多拷贝(例如10至50个或更多)的DNA分子-HIV aINR组合。另外，尽管一些aINR看来在一些细胞类型中引发转录，但是aINR可能受到邻近的以细胞特异性方式起作用的调控元件影响，或可能在某些类型细胞中的作用水平低(例如参见Winoto和Baltimore，1989(同上)所鉴别的转录沉默子)。因此，在采用特定aINR的单拷贝不能最有效地引发基因调节的转录的细胞中，可能需要多拷贝的DNA分子-HIV aINR组合，结合所放置的增强aINR转录起始活性的调控元件的功能，以调节靶基因的表达。一种变化方案是，通过查看显示以细胞特异方式受到调节的基因的公开序列，可能鉴定出在该特定细胞类型中起作用的aINR(通过位置和共有序列)以及合适的调控元件(通过位置和共有序列)。
本发明该实例的一个描述是，通过将10-50拷贝的包含DNA分子-HIV aINR组合(以便用于HIV 5′LTR的基因调控)的序列连接到基础载体中，构建一个重组载体。在一个较佳的实例中，为了提高反义转录本产生的效率，序列包含DNA分子-HIVaINR-调控元件的组合。SEQ ID NO8中示出了一种典型的DNA分子-HIV aINR-调控元件的组合。然后将所得重组载体导入哺乳动物细胞，aINR引发产生反义RNA转录本。然后，反义RNA转录本通过和HIV-1 LTR转录的有义mRNA形成RNA双链体，来调节细胞中所含HIV-1的HIV-1 LTR的表达。
在HIV aINR和DNA分子结合用来调节哺乳动物细胞基因表达的另一个实例中，可包括一种利用如HIV 5′LTR所证实的相同控制机制的机制作为控制HIV aINR产生的反义转录本介导的转录阻遏的方法。在该实例中，重组构建物含有一个插入物，该插入物包含完整TAR区域DNA(SEQ ID NO8的核苷酸75至133)中的HIV aINR，该HIV aINR在至少一个拷贝含真核靶基因的DNA分子的下游并与其操作性相连，从该构建物可以产生反义序列与真核靶基因转录出的有义RNA结合。另外，合适的调控元件可以位于HIV aINR的下游。这种构建物提供了Tat控制机制。当含有重组载体的细胞没有Tat存在时，HIV aINR产生了反义转录本，然后该转录本与靶基因转录出的有义RNA结合。在Tat存在时(例如通过随后导入表达Tat的载体)，通过Tat与TAR的结合，可以使HIV aINR介导的反义RNA的转录无效(灭活或降低至对靶基因的转录阻遏无效的低基础水平)。pTAT载体已有描述(Koken等人，1994，Gene144243-7；Ho等人，1990，J.Gen.Virol.7197-103)。
C.将重组载体导入宿主细胞内将重组载体导入宿主细胞的方法是本领域技术人员所知的，它们包括(但不局限于)转化、转染、磷酸钙沉淀、微量注射、定向脂质体、粒子枪轰击、电穿孔、电融合和注射。因此，本发明中一种调节宿主细胞中靶基因表达的方法包含将重组载体导入宿主细胞中，该重组载体包含至少一个拷贝的aINR(最好有下游调控元件)，该aINR与至少一个拷贝的含靶基因的DNA分子操作性相连，该DNA分子产生反义RNA，其中反义RNA再与靶基因转录出的有义RNA结合，从而在转录和/或翻译水平上调节基因表达。
在该实例的另一变化中，包含至少一个拷贝的aINR与至少一个拷贝的DNA分子操作性相连的重组载体或基因物质的导入可以是直接注射(通过任何肠胃外途径，例如静脉内、腹膜内、真皮内、皮下或肌内或通过接触鼻咽、气管或肠胃道粘膜表面)到个体内(“直接的核酸转移”)。本领域技术人员已经证实，直接将核酸转移到“接种疫苗的”个体内，导致接种个体的细胞(如血管内皮细胞和主要器官的组织)表达基因物质(例如静脉内注射一种表达质粒阳离子脂质体复合物(Zhu等人，1993，Science261209-211；纳入本文作参考))。另外，包含待注射的本发明重组载体或基因物质的组合物还可包括一种或多种药学上可接受的载体，例如稀释剂，和/或促进细胞摄取核酸的化合物(称为“核酸摄取增强剂”)。
在本发明该方法的另一个例子中，可从个体取出细胞用本领域已知的标准程序进行转染或电穿孔，从而导致将重组载体(包含至少一个拷贝的aINR，以及与其操作性相连的至少一个拷贝的DNA分子)导入靶细胞内。然后可以用本领域中已知的方法(例如通过载体中表达的选择标记)选择含有重组载体的细胞，然后将选出的细胞重新导入个体内。
根据前述内容，本领域技术人员显然能对上述方法、构建物和细胞作各种变化而不脱离本发明的精神和范围。因此，本发明还包括不脱离其精神和实质性特点的其它具体形式。因此，本文中的实例和实施例应被认为在所有方面均是描述性的，而不是限制性的，因此在等价于权利要求的意义和范围内的所有变化均包括于权利要求中。
序列表(1)一般信息(i)申请人S(A)姓名Ludwig，Linda B.
(ii)发明名称真核和反转录病毒反义起始元件(iii)序列数目9(iv)通信地址(A)地址Hodgson，Russ，Andrews，Woods & Goodyear(B)街道1800 One M&T Plaza(C)城市Buffalo(D)州纽约(E)国家美国(F)邮编14203-2391(v)计算机可读形式(A)记录介质类型软盘，3.5英寸(B)计算机IBM PC兼容型(C)操作系统MS-DOS/Microsoft Windows(D)软件Wordperfect for Windows(vi)本申请资料(A)申请号(B)申请日1998年5月7日(vii)律师/代理人信息(A)姓名Kadle，Ranjana(B)登记号40，041(C)文献/案卷号11520.0114(ix)电讯信息(A)电话(716)856-4000(B)电传(716)849-0349(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度7核苷酸(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(E)其它信息/注意″X″＝A或G，″Y″＝A或T，和″N″＝A，T，C或G(ii)分子类型DNA(iii)假设没有
(iv)序列描述SEQ ID NO1XXYNTGX 7(3)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度8核苷酸(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设没有(iv)序列描述SEQ ID NO2GATCTGAG 8(4)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度98核苷酸(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设没有(iv)序列描述SEQ ID NO3GGGTCTCTCT GGTTAGACCA GATCTGAGCC TGGGAGCTCT CTGGCTAACT50AGGGAACCCA CTGCTTAAGC CTCAATAACC CTATAGTGAG TCGTATTA 98(5)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度63核苷酸(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设没有(iv)序列描述SEQ ID NO4CTGCTTTTTG CCTGTACTGG GTCTCTCTGG TTAGACCAGA TCTCCCTATA50GTGAGTCGTA TTA 63(6)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度8核苷酸(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设没有(iv)序列描述SEQ ID NO5AGAGTGGG 8(7)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度7核苷酸(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设没有(iv)序列描述SEQ ID NO6AATATGG 7(8)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度8核苷酸(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设没有(iv)序列描述SEQ ID NO7AGTCTGGG 8(9)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度153核苷酸(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设没有(iv)序列描述SEQ ID NO3GGCGTGGCCT GGGCGGGACT GGGGAGTGGC GAGCCCTCAG ATGCTGCATA 50TAAGCAGCTG CTTTTTGCCT GTACTGGGTC TCTCTGGTTA GACCAGATCT100GAGCCTGGGA GCTCTCTGGC TAACTAGGGA ACCCACTGCT TAAGCCTCAA150TAA 153(10)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度25核苷酸(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设没有(iv)序列描述SEQ ID NO9CCAGAGAGAC CCGATACAGG CAAAA 2权利要求
1.一种分离和纯化的核酸分子，它基本上由反义起始序列或其功能等价物组成，其中该反义起始序列基本上由SEQ ID NO1公开的共有序列组成。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中反义起始序列基本上由选自SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列组成。
3.一种重组核酸分子，它包括操作性连接(a)至少一个拷贝的权利要求1所述的反义起始序列；和(b)至少一个拷贝的DNA分子，其中该反义起始序列在DNA分子的下游，并且在相对于DNA分子中待调节序列的顺式方向上。
4.根据权利要求3所述的重组核酸分子，它还包含至少一个位于反义起始序列下游的调控元件以增强从反义起始序列转录的启动。
5.根据权利要求4所述的重组核酸分子，它含有基本上由SEQ ID NO8组成的核苷酸序列。
6.根据权利要求3所述的重组核酸分子，其中所述反义起始序列基本上由选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列组成。
7.一种能导入真核细胞并在其中复制的重组载体，它包含权利要求1所述的至少一个拷贝的反义起始序列，该序列在至少一个拷贝的待转录成反义RNA的DNA分子的下游并和其操作性相连。
8.根据权利要求7所述的重组载体，它还包含至少一个位于反义起始序列下游的调控元件以增强从反义起始序列转录的启动。
9.根据权利要求7所述的重组载体，其中所述反义起始序列基本上由选自SEQID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列组成。
10.根据权利要求7所述的重组载体，其中所述载体含有一个可选择的标记。
11.根据权利要求8所述的重组载体，其中所述载体含有一个可选择的标记。
12.根据权利要求7所述的重组载体，其中与DNA分子操作性相连的所述反义起始序列用基本上由SEQ ID NO8组成的核苷酸序列表示。
13.一种真核细胞，它含有权利要求7所述的重组载体。
14.一种真核细胞，它含有权利要求8所述的重组载体。
15.一种真核细胞，它含有权利要求9所述的重组载体。
16.一种真核细胞，它含有权利要求10所述的重组载体。
17.一种真核细胞，它含有权利要求11所述的重组载体。
18.一种真核细胞，它含有权利要求12所述的重组载体。
19.一种RNA分子，它从权利要求12所述的重组载体制得。
20.一种制备反义起始序列的方法，其中所述方法选自用酶促核酸扩增来从含有反义起始序列的核酸序列扩增反义起始序列，随后纯化包含反义起始序列的扩增产物；和用化学方法合成反义起始序列。
21.一种调节真核细胞中靶基因表达的方法，该方法包括将权利要求7所述的重组载体导入表达待调节靶基因的细胞中，其中重组载体的反义起始序列启动转录，将操作性相连的DNA分子转录成负链极性的RNA转录本，该转录本的功能是结合待调节靶基因产生的有义RNA转录本，形成RNA双链体，从而阻遏该靶基因的表达。
22.一种调节真核细胞中靶基因表达的方法，该方法包括将权利要求8所述的重组载体导入表达待调节靶基因的细胞内，其中重组载体的反义起始序列和下游调控元件启动转录，将操作性相连的DNA分子转录成负链极性RNA转录本，该转录本的功能是结合待调节靶基因产生的有义RNA转录本，形成RNA双链体，从而阻遏靶基因的表达。
23.一种调节哺乳动物细胞中靶基因表达的方法，该方法包括将权利要求3所述的重组核酸分子导入表达待调节靶基因的哺乳动物细胞内，其中重组核酸分子的反义起始序列启动转录，将操作性相连的DNA分子转录成负链极性RNA转录本，该转录本的功能是结合待调节靶基因产生的有义RNA转录本，形成RNA双链体，从而阻遏靶基因的表达。
24.一种调节哺乳动物细胞中靶基因表达的方法，该方法包括将权利要求4所述的重组核酸分子导入表达待调节靶基因的哺乳动物细胞内，其中重组核酸分子的反义起始序列和下游调控元件启动转录，将操作性相连的DNA分子转录成负链极性RNA转录本，该转录本的功能是结合待调节靶基因产生的有义RNA转录本，形成RNA双链体，从而阻遏靶基因的表达。
25.一种调节哺乳动物细胞中靶基因表达的方法，该方法包括将权利要求5所述的重组核酸分子导入表达待调节靶基因的哺乳动物细胞内，其中重组核酸分子的反义起始序列和下游调控元件启动转录，将操作性相连的DNA分子转录成负链极性RNA转录本，该转录本的功能是结合待调节靶基因产生的有义RNA转录本，形成RNA双链体，从而阻遏靶基因的表达。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述反义起始序列基本上由选自SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列组成。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述反义起始序列基本上由选自SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列组成。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述反义起始序列基本上由选自SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列组成。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述反义起始序列基本上由选自SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列组成。
全文摘要
本发明鉴定出一种基因调控元件,它是真核细胞中天然反义RNA负调控系统的一部分。当命名为反义起始序列的基因调控元件在DNA分子下游并与其操作性相连时,它能将DNA分子转录成负链极性的RNA转录本,该转录本的功能是与待调节靶基因产生的有义RNA转录本结合形成RNA双链体。本发明涉及用于导入真核细胞的重组载体和用该载体调节靶基因表达的方法,该方法包括将该重组载体导入宿主真核细胞内。
文档编号C12N15/63GK1262687SQ98807028
公开日2000年8月9日 申请日期1998年5月8日 优先权日1997年5月9日
发明者L·B·路德韦 申请人:纽约州立大学研究基金会