专利名称：用于检测整合酶φc31功能的真核细胞系统及其制备方法
技术领域：
本发明属生物技术和基因治疗技术领域，具体涉及一种在哺乳动物细胞中，用于检测整合酶ΦC31功能和活性的真核细胞系统及其制备方法。
背景技术：
噬菌体整合酶ΦC31可将外源核苷酸序列定点整合到哺乳动物细胞基因组的特异性位点上，近年来已成为在哺乳动物细胞中进行转基因位点特异性重组操作和基因治疗的有用工具。
2000年Calos等人最先进行应用噬菌体整合酶ΦC31在哺乳动物细胞中介导定点整合的研究，随后在小鼠的动物模型中实现了整合酶ΦC31介导凝血因子IX的基因治疗，并在果蝇等动物中实现了高效率的转基因动物的构建工作，从而开辟了基因治疗领域的高效定点基因组整合研究的新方向。然而对于整合酶ΦC31在哺乳动物细胞中表达和功能的研究，在其使用pBCBP+质粒的基础上建立的检测系统，只能定性的说明整合酶ΦC31在哺乳动物细胞中的活性，不能定量的表征不同的酶突变体和环境因素对整合酶ΦC31功能的影响。2001年，Kuhn等人建立了小鼠细胞的整合酶ΦC31的检测系统，他们利用整合酶ΦC31介导分子内重组的特性，用β-半乳糖苷酶(LacZ)作为标记基因，通过显微镜下的计算显色的细胞数目定量检测整合酶ΦC31的活性。该方法可以定量的说明整合酶ΦC31在小鼠细胞中的功能，但是操作步骤繁复和误差比较大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确性高、重复性好、操作简便的整合酶ΦC31功能和活性检测系统及其制备方法。
本发明提出的整合酶ΦC31功能和活性检测系统，是由ΦC31重组报告质粒PB[EGFP]转染人胚胎肾细胞系293，然后用新霉素G418筛选，挑选出单克隆细胞，发展而成的293-PB{[EGFP]}报告细胞系；其中，ΦC31重组报告质粒PB[EGFP]是利用pEGFP-N2载体，在增强型烟草花叶病毒启动子(CMVIE)之后，顺序插入特异序列attP和attB，然后在其间加上一段牛生长因子的多聚腺苷酸(BGH polyA)组成。其结构见图1所示。其构成元件的顺序排列如下增强型烟草花叶病毒启动子(CMVIE)，attP序列(见SEQ.ID NO.1)，牛生长因子的多聚腺苷酸序列(BGH polyA，见SEQ.ID NO.3)，attB序列(见SEQ.ID NO.2)，增强型绿色荧光蛋白序列(EGFP)。在整合酶ΦC31活性作用下，半个attP和半个attB序列及其之间的牛生长因子的多聚腺苷酸的序列被删除，则牛生长因子的多聚腺苷酸序列的阻断作用消失，增强型绿色荧光蛋白得以表达。
本发明提出的上述整合酶ΦC31功能和活性检测系统的制备方法如下1.构建重组报告质粒PB[EGFP]整合酶ΦC31可以识别的特异性的DNA序列(attP序列见SEQ.ID NO.1和attB序列见SEQ.ID NO.2)，当attP和attB序列同时位于一个DNA分子中，并且排列的方向相同时，整合酶ΦC31可以介导分子内的重组，删除attP和attB序列之间的DNA片断。根据上述原理，本发明构建了包含有特异性序列attP和attB的报告质粒PB[EGFP]。使用常规方法(分子克隆指南，1998年第二版，萨姆布鲁克等著，科学出版社)，首先利用pEGFP-N2载体(Clontech公司产品)，在增强型烟草花叶病毒启动子CMVIE之后，顺序插入attP和attB序列，然后在其间加上一段牛生长因子的多聚腺苷酸BGH polyA，用来阻断attB序列后的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。当存在活性的整合酶ΦC31时，经过重组反应，半个attP和半个attB序列以及他们之间的DNA片断BGH polyA被删除，而从其后的增强型绿色荧光蛋白得到表达，表现绿色荧光(见图1)。
2.建立稳定的检测整合酶ΦC31的真核细胞系293-PB{[EGFP]}利用上述构建的ΦC31重组报告质粒PB[EGFP]使用常规方法(分子克隆指南，1998年第二版，萨姆布鲁克等著，科学出版社)，转染人胚胎肾细胞系293，然后用新霉素G418筛选，挑选出单克隆细胞，发展成为293[PB-EGFP]报告细胞系。当没有ΦC31整合酶时，该细胞系没有绿色荧光蛋白(GFP)的表达；当存在有活性的ΦC31整合酶时，该细胞系有绿色荧光蛋白(GFP)的表达，表现出绿色荧光，可以在荧光显微镜观察(见图2)和用流式细胞仪计数荧光细胞数量(图3)，从而评估出转染，转导，转化等多种途径表达的ΦC31整合酶，及其突变体等的活性和功能的定量比较。
本发明利用ΦC31整合酶介导分子内重组的原理，制备了新型的人类胚胎肾细胞(293)的真核细胞检测系统，该系统在活性的ΦC31整合酶存在时有绿色荧光蛋白(GFP)的表达，表现出绿色荧光。可以用流式细胞仪计数荧光细胞数量和强度，从而计算出不同途径(转染，转导，转化等)表达的ΦC31整合酶，及其突变体等在哺乳动物细胞中的功能的定量比较和定性说明。该检测系统操作简便，步骤少，准确性高，重复性好，是ΦC31整合酶在哺乳动物细胞中应用的重要评估定量系统。
图1为重组报告质粒PB[EGFP]的构成及其受整合酶ΦC31作用后的机理简图。
图2为荧光显微镜检测整合酶ΦC31功能的真核细胞的结果检测整合酶ΦC31的真核细胞在转染整合酶ΦC31的cDNA后，48小时后荧光显微镜下的结果(见图2-A)，60小时后荧光显微镜下的结果(见图2-B)。淡灰色表示DAPI染色的细胞核，亮白色表示表达绿色荧光蛋白的细胞。
图3为流式细胞仪检测整合酶ΦC31功能的真核细胞的结果检测整合酶ΦC31的真核细胞在没有整合酶ΦC31表达，有整合酶ΦC31的表达，48小时后流式细胞仪的结果(图3-A，B)。阳性对照样品是只转染带绿色荧光蛋白表达的质粒(见图3-C)。
具体实施例方式
下面结合具体实施例子，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例子仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如萨姆布鲁克等人(分子克隆指南实验室手册，1998年第二版，科学出版社)，又如斯佩克特等人(细胞实验指南，实验室手册，1998年第二版，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
1、构建重组报告质粒PB[EGFP]通过常规的DNA重组技术，重组报告质粒PB[EGFP]的构建按照以下的步骤首先将attB克隆到pEGFP-N2载体(Clontech公司产品)上，以EcoRI-5′-ACCGGAATTCGTCGACATGCCCGCC-3′和KpnI-5′-AATAACGGTACCGTCGACGATGTAGGTC-3′作为引物，pBCBP+(Calos等构建)质粒为模板，PCR扩增attB序列。用EcoRI和KpnI分别对扩增产物和载体pEGFP-N2进行双酶切，分别回收DNA片段，并用T4连接酶(TAKARA公司产品)连接。连接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌Top10，在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB平板培养过夜后，筛选阳性克隆后用限制性内切酶鉴定，并进行DNA序列测定(Invitrogen公司)。DNA序列分析结果表明PCR产物的attB的DNA序列与SEQ.ID NO.1所示的1-240bp完全相同。命名为attB-EGFP-N2质粒。
其次，将attP克隆到attB-EGFP-N2质粒上，以SpeI-5′-CTAGACTAGTTCGCGCTCGCG-3′和BamHI-5′-CGCGGATCCATCCCCAGAAGCGGTTTTCGGGAG-3′作为引物。pBCBP+(Calos等构建)质粒为模板，PCR扩增attP序列。用SpeI和BamHI分别对扩增产物和质粒attB-EGFP-N2进行双酶切，分别回收DNA片段，并用T4连接酶连接。连接产物转化后，筛选阳性克隆后用限制性内切酶鉴定，进行DNA序列测定结果表明PCR产物的attP的DNA序列与SEQ.ID NO.2所示的1-283bp完全相同。命名为attP-attB-EGFP-N2质粒。
最后，将BGH polyA多核苷酸序列克隆到attP-attB-EGFP-N2质粒上，以5′-CCGCTCGAGCATGCATCTAG-3′和5′-CCGGAATTCCAGCTGGTTCTTTCCGCCTC-3′为引物，pCDNA3.0(Invitrogen公司产品)为模板，PCR扩增BGH polyA的序列。用XhoI和ECoRI分别对扩增产物和质粒attP-attB-EGFP-N2进行双酶切，分别回收DNA片段，用TG连接酶连接。连接产物转化后，筛选阳性克隆后用限制性内切酶鉴定，进行DNA序列测定分析结果表明BGH polyA的DNA序列与SEQ.ID NO.3所示的1-329bp完全相同。这样就构建出了CMVIE-attP-BGH polyA-attB-EGFP的重组报告载体，命名为PB[EGFP]质粒。(见图1)2.筛选检测ΦC31重组酶功能的稳定的单克隆真核细胞系293PB[EGFP]通过常规的细胞培养技术，检测整合酶ΦC31功能的真核细胞的制备按照如下的方法人胚胎肾细胞293细胞系来源于美国细胞保存中心(ATCC，Rockville，MD)，在高糖的10％牛血清的DMEM(Gibcol产品)细胞培养液中，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。当3.5CM的细胞培养板中细胞铺板率在70％以上时，利用脂质体(Invitrogen公司产品)转染质粒PB[EGFP]后，经过0.5mg/ml新霉素(G418)筛选16天，挑选出若干个单克隆的细胞系。对那些单克隆报告细胞系293PB[EGFP]用表达整合酶ΦC31cDNA转染表现绿色荧光的细胞作为验证方法，确定稳定的单克隆报告细胞系293PB[EGFP]的建立。在没有整合酶ΦC31存在时，报告细胞在荧光显微镜下显示阴性的结果，在存在活性的整合酶ΦC31时，报告细胞在荧光显微镜下显示阳性的结果(见图2-A和B)。
3.流式细胞仪检测整合酶ΦC31功能的真核细胞的结果检测整合酶ΦC31功能的真核细胞细胞293PB[EGFP]，在高糖的DMEM(Gibcol产品)细胞培养液中，含氨苄青霉素50ug/ml，链霉素25ug/ml，小牛血清10％，0.5mg/ml新霉素(G418)，在5％CO2，37℃的细胞培养箱培养。当3.5CM的细胞培养板中细胞铺板率达到90％时，利用脂质体试剂(Invitrogen公司产品)混合4ug的pCMVint质粒转染细胞，4-6小时后换新的细胞培养液，培养48-60小时后，PBS清洗细胞，胰蛋白酶消化细胞后，离心收获细胞。同时设立阴性和阳性的实验对照，经流式细胞仪检测，没有整合酶ΦC31表达细胞显示GFP阴性结果，有整合酶ΦC31表达细胞显示GFP阴性结果，荧光细胞的数量与比率可以定量的表示整合酶ΦC31在真核细胞中的活性与功能(见图3)。
1.SEQ.ID NO.1attB多核苷酸序列1 GTCGACATGC CCGCCGTGAC CGTCGAGAAC CCGCTGACGC TGCCCCGCGT ATCCGCACCC61 GCCGACGCCG TCGCACGTCC CGTGCTCACC GTGACCACCG CGCCCAGCGG TTTCGAGGGC121 GAGGGCTTCC CGGTGCGCCG CGCGTTCGCC GGGATCAACT ACCGCCACCT CGACCCGTTC181 ATCATGATGG ACCAGATGGG TGAGGTGGAG TACGCGCCCG GGGAGCCCAA GGGCACGCCC241 TGGCACCCGC ACCGCGGCTT CGAGACCGTG ACCTACATCG TCGAC2.SEQ.ID NO.2attP多核苷酸序列1 TACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACG61 GGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCA121 ACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCG181 TGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGTC3.SEQ.ID NO.3BGH polyA多核苷酸序列1 CTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGC61 TGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTG121 CCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATT181 GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGC241 AAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCT301 TCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGAATTC
权利要求
1.一种用于检测整合酶ΦC31功能的真核细胞系统，其特征在于是由ΦC31重组报告质粒PB[EGFP]转染人胚胎肾细胞系293，然后用新霉素G418筛选，挑选出单克隆细胞，发展而成的293-PB{[EGFP]}报告细胞系；其中，ΦC31重组报告质粒PB[EGFP]是利用pEGFP-N2载体，在增强型烟草花叶病毒启动子CMVIE之后，顺序插入特异序列attP和attB，然后在其间加上一段牛生长因子的多聚腺苷酸BGH polyA组成。
2.一种如权利要求1所述的用于检测整合酶ΦC31功能的真核细胞系统的制备方法，其特征在于具体步骤如下(1)构建重组报告质粒PB[EGFP]首先利用pEGFP-N2载体，在增强型烟草花叶病毒启动子CMVIE之后，顺序插入attP和attB序列，然后在其间加上一段牛生长因子的多聚腺苷酸BGH polyA；(2)建立稳定的检测整合酶ΦC31的真核细胞系293-PB{[EGFP]}利用上述构建的ΦC31重组报告质粒PB[EGFP]，转染人胚胎肾细胞系293，然后用新霉素G418筛选，挑选出单克隆细胞，发展成为293[PB-EGFP]报告细胞系。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述构建重组报告质粒PB[EGFP]的步骤如下首先将attB克隆到pEGFP-N2载体上，以EcoRI-5′-ACCGGAATTCGTCGACATGCCCGCC-3′和KpnI-5′-AATAACGGTACCGTCGACGATGTAGGTC-3′作为引物，pBCBP+质粒为模板，PCR扩增attB序列；用EcoRI和KpnI分别对扩增产物和载体pEGFP-N2进行双酶切，分别回收DNA片段，并用T4连接酶连接，命名为attB-EGFP-N2质粒；其次，将attP克隆到attB-EGFP-N2质粒上，以SpeI-5′-CTAGACTAGTTCGCGCTCGCG-3′和BamHI-5′-CGCGGATCCATCCCCAGAAGCGGTTTTCGGGAG-3′作为引物，pBCBP+质粒为模板，PCR扩增attP序列；用SpeI和BamHI分别对扩增产物和质粒attB-EGFP-N2进行双酶切，分别回收DNA片段，并用T4连接酶连接；连接产物转化后，命名为attP-attB-EGFP-N2质粒；最后，将BGH polyA多核苷酸序列克隆到attP-attB-EGFP-N2质粒上，以5′-CCGCTCGAGCATGCATCTAG-3′和5′-CCGGAATTCCAGCTGGTTCTTTCCGCCTC-3′为引物，pCDNA3.0为模板，PCR扩增BGH polyA的序列；用XhoI和ECoRI分别对扩增产物和质粒attP-attB-EGFP-N2进行双酶切，分别回收DNA片段，用TG连接酶连接；命名为PB[EGFP]质粒。
全文摘要
本发明属生物技术和基因治疗技术领域，具体涉及一种用于检测整合酶ΦC31功能的真核细胞系统及其制备方法。该检测系统由重组报告PB[EGFP]转染人胚胎肾细胞系293后用G418筛选，挑选出单克隆细胞而获得，其中，PB[EGFP]是利用pEGFP－N2载体，在增强型烟草花叶病毒启动子(CMVIE)之后，顺序插入特异序列attP和attB，然后在其间加上一段牛生长因子的多聚腺苷酸而构成。该细胞系统可以评估出转染、转导、转化等多种途径表达的ΦC31整合酶，及其突变体等的活性和功能。该检测系统操作简便，准确性高，重复性好，是整合酶ΦC31在哺乳动物细胞中应用的重要定量评估系统。
文档编号C12Q1/04GK1827781SQ200510112200
公开日2006年9月6日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者张茂祥, 朱焕章, 陈金中, 王韧诚, 贾韦国, 薛京伦 申请人:复旦大学