专利名称：从米曲霉中克隆脯氨酰二肽基肽酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的新重组脯氨酰二肽基肽酶，编码此酶的基因，表达此酶的重组细胞，以及水解包含蛋白的物质的方法。技术状况水解蛋白质被广泛应用于食品工业中，可通过酸、碱或酶水解含蛋白物质进行制备。但另一方面，酸或碱水解在水解过程中破坏必须氨基酸，因而降低营养价值，而酶水解极少进行完全，因而被水解蛋白包含大量的肽。
丝状子囊菌米曲霉已知其分泌大量多种淀粉酶，蛋白酶和肽酶，其反应为其有效溶解和水解原料所必要的(见WO 94/25580)。多种方法可用米曲霉生产食物产品，尤其包括使用日本酒曲培养物的方法。
EP 47481(Nestle)描述了生产发酵酱油的方法，其中日本酒曲通过将米曲霉日本酒曲培养物与煮过的黄豆和焙小麦的混合物混合制备，然后日本酒曲在含水悬浮液中45℃-60℃水解3至8小时，其中有在米曲霉日本酒曲悬浮液发酵过程中的酶，酱醪通过加氯化钠至水解的日本酒曲悬浮液而进一步制备，酱醪进一步与酵素(酶)混合，压榨，所获溶液进行巴氏消毒，澄清。
EP 429 760(Nestle)描述了生产香味剂的方法，其中制备富含蛋白质物质的含水悬浮液，蛋白质在pH6.0-11.0时被悬浮液和蛋白酶水解，悬浮液在pH4.6-6.5时热处理，与米曲霉发酵的日本酒曲培养物的酶一起成熟。
同样，EP96201923.8(Nestle)描述了生产肉类香料的过程，此过程中制备包括植物蛋白质源和植物碳水化合物源的混合物，所述混合物含至少45％干物质，混合物用日本酒曲培养物接种，该日本酒曲培养物由米曲霉和其它一或多种传统食物发酵包括的微生物发酵，混合物培养至肉类香味形成为止。
根据蛋白的本性和蛋白水解应用的酶，形成的肽可能有强烈的苦味，为感觉不可接受的，因此需要能导致高程度蛋白水解蛋白水解的方法且水解产物器官感觉良好。
此外，在酶水解的富含蛋白物质中，需高水平的谷氨酰胺酶，用于将谷氨酰胺转换为谷氨酸，谷氨酸为重要的天然的口味增进剂(见WO95/31114)。对米曲霉水解的谷物，例小麦谷蛋白，进行残余肽的生化分析，显示在包含脯氨酸的肽中，可观量的谷氨酰胺保持汇集(Adler-Nessen，食物蛋白的酶水解。Elseviet应用科学出版社LTD，p120，1986)。因此需要蛋白水解方法以释放大量的谷氨酰胺。
在从日本酒曲霉菌所知的不同蛋白水解酶中，两种中性内肽酶(Nakadai等，农业生物化学，37，2695-2708，1973)，一种碱性内肽酶(Nakadai等，农业生物化学，37，2685-2694，1973)，一种天冬氨酸蛋白酶(Tssujita等，生物化学生物物理现状(Biochem.Biopys.Acta)，445，194-204，1976)，几种氨肽酶(Ozawa等，农业生物化学，37，1285-1293，1973)，几种羧肽酶(Nakadai等，农业生物化学，371237-1251，1970)被分辨并纯化。
近来在米曲霉中检测到脯氨酰二肽基肽酶的活性，此酶提供针对X-Pro起始的蛋白和肽特异性高水平水解，从而释放X-Pro型的二肽，其中X为任意氨基酸(Tachi等，植物化学，31，3707-3709，1992)。发明概述本发明从米曲霉中获得新重组脯氨酰二肽基肽酶(DPP IV)或其功能衍生物，该肽酶包括SEQ ID NO2的从氨基酸1到氨基酸755的氨基酸序列。
第二，本发明还提供编码本发明的酶的DNA分子。
第三，本发明通过重组技术提供表达本发明的酶的细胞。
第四，本发明提供天然具脯氨酰二肽基肽酶活性的曲霉，与天然指导编码脯氨酰二肽基肽酶活性的基因表达的曲霉天然启动子的多拷贝结合。
第五，本发明提供天然具脯氨酰二肽基肽酶活性的曲霉，其活性由基因工程操作从而使dpp IV基因失活。
第六，本发明提供生产本发明的酶的方法，包括在细胞表达此酶的条件下，在适当的生长培养基中培养本发明的细胞，并任选以浓缩物的形式选择性分离酶。
第七，本发明提供运用本发明的酶或细胞水解含蛋白的物质的方法。
另一方面，本发明提供运用具脯氨酰二肽基肽酶活性的酶和/或细胞，与至少一种提供脯氨肽酶的酶共用，水解含蛋白的物质。
最后一方面，本发明提供一种食物产品，该产品包括至少用一种微生物发酵获得的蛋白水解产物，该微生物在含1％(w/v)小麦谷蛋白的基本培养基中生长时，具有超过50mU/ml的脯氨酰二肽基肽酶的活性。发明详述以下描述中，百分比均为重量百分比，除非另作说明，且氨基酸或核酸序列以“SEQ ID NO”形式在后面的序列表中给出。
同样的，所谓“酶的功能性衍生物”包括所有因取代、缺失、添加某些氨基酸，例1-20氨基酸而区别的氨基酸序列，但保持其原始活性或功能。对功能性衍生物的选择对本领域技术人员而言十分明显，通过采用本领域技术人员熟知的方法容易地产生DPP IV(见SEQ IDNO2的氨基酸序列)的变种，例Adams等(EP 402450，Genencor)，Dunn等(蛋白工程，2，283-291，1988)，Greener等，(策略，7，32-34，1994)和/或Deng等，(分析化学，200，81，1992)描述的方法。
当一个蛋白与另一蛋白的序列至少有80％相同，优选至少90％相同，尤其优选95％相同时，称此蛋白为另一蛋白的衍生物。在本公开内容的上下文中，同一性根据衍生物序列中与具SEQ ID NO2(成熟序列1-755)氨基酸序列的DPP IV相同的氨基酸数与所述衍生物序列的氨基酸总数的比值确定。
此外，术语“日本酒曲”代表具有碳水化合物来源和蛋白来源混合物的日本酒曲霉培养的发酵产物，该混合物尤其是豆科植物或煮过的含油植物和煮过或烤过的谷物来源的混合物，例如大豆或煮过的菜豆和煮过或烤过的小麦或稻米的混合物。
本发明因而涉及来源于米曲霉的脯氨酰二肽基肽酶，包括SEQ IDNO2氨基酸1-755的氨基酸序列及其功能性衍生物。此酶可在表达它的宿主中融合到有利其分泌的前导肽上，例如米曲霉前导肽，具来自SEQ ID NO2的氨基酸-16至-1的氨基酸序列或其衍生物。
编码根据本发明的DPP IV的dpp IV基因，至少包括核苷酸序列SEQ ID NO1的编码部分，或因遗传密码的简并性产生的功能性衍生物。此序列实际上被非编码序列，称为内含子所间断，在体内转录时被剪接(外显子I在1836-1841bp；外显子II在1925-1924bp；内含子在1842-1924bp)。
dppIV基因可通过以下实施例描述的方法从米曲霉的任何菌株中以基本上纯化形式获得。可选择地，dppIV基因可(1)在其它种属的微生物中用衍生自核苷酸序列SEQ ID NO1的DNA探针严格杂交分析来检测，和(2)运用合适的引物例如引物SEQ ID NO8和9；通过熟知的反向PCR方法重获。进一步的，dppIV基因可在体外合成，而后用聚合酶链式反应扩增。
根据本发明的DNA分子至少包括编码本发明的DPP IV的dpp IV基因。此分子可存在于载体的形式，即复制型质粒或整合环状或线性非复制型质粒。DNA分子因此可包括，可操作地与dpp IV基因相连的，来源本基因的生物体的天然调节序列。所述天然调节序列可为启动子，终止子，和/或编码原始调节dpp IV基因分泌的信号序列的DNA序列，如编码来自SEQ ID NO1(无内含子)或因遗传密码的简并性产生的功能性衍生物的核苷酸1836-1966的信号肽的米曲霉核苷酸序列。在另一实施方案中，调节序列可为所述起源的生物体中调节不同基因或在外源生物体中调节不同基因的天然序列。除天然调节序列之外的调节序列因其高效率或所需特性而被选择，例对启动子的诱导性或编码容许蛋白分泌的肽信号的序列。
如果优选异源表达，则意味着本发明的基因在除起源宿主(菌株，变种，种，属，科，目，纲或门)之外的其它生物体中表达，调节序列优选从与表达宿主相同或相似的生物体衍生。例如表达宿主为酵母细胞，则调节序列衍生自酵母细胞。适于组成性表达的启动子优选在真菌宿主中，可为来自以下基因的启动子例甘油醛-3-磷酸脱氢酶，磷酸甘油醛激酶，丙糖磷酸异构酶和乙酰胺酶。适于诱导型表达的启动子，优选在真菌宿主中，可为来自以下基因的启动子内木聚糖酶IIA，葡糖淀粉酶A，纤维二糖水解酶，淀粉酶，转化酶，醇脱氢酶和淀粉葡糖苷酶。本领域技术人员可容易地选择本发明的序列可操作性，连接并且能够指导所述核苷酸序列表达的所期待的调节序列。
根据本发明的DNA分子还可包括选择标记，用以从不包括所述重组物质的细胞中辨别导入重组DNA物质的宿主细胞。这些标记基因为，例如，优选真菌表达的例如，已知ga-2、pyrG、pyr4、pyrA、trpC、amdS或argB基因。此DNA分子还至少包括一个合适的复制起始点。在许多生物体中包括不同的细菌真菌植物种中，文献中已知合适的转化方法和有适当转录启动子的合适表达载体，合适的转录终止信号以及选择被转化细胞的适当标记基因。此事件中需真菌表达，可特别采用EP 278355(Novartis)中描述的表达系统。
重组日本酒曲霉菌可通过任何将外源DNA导入细胞的方法而获得。这些方法包括转化，电泳，或任何其它本领域技术人员熟知的方法。
本发明包括本发明的DNA分子的重组细胞，所述细胞可表达本发明的DPP IV或其功能性衍生物。这些细胞可衍生自真菌、酵母、细菌和植物细胞。优选地，酵母细胞为糖酵母属(Saccharomyces)，克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)，汉逊酵母属(Hansenula)和毕赤酵母属(Pichia)，细菌细胞为革兰氏阴性或阳性菌，即埃希氏杆菌属(Escherichia)，芽孢杆菌属(Bacillus)，乳杆菌属(Lactobacillus)乳球菌属(Lactococcus)，链球菌属(Streptococcus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)，植物细胞属植物种群，真菌细胞为传统用于制造日本酒曲的细胞，如曲霉属，根霉属(Rhizopus)和/或毛霉菌属(Mucor)种，值得注意的有酱油曲霉(Aspergillus soyae)，米曲霉(ATCC 20386)，海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)(ATCC14332)，黑曲霉(Aspergillus niger) (ATCC 1004)，泡盛曲霉(Aspergillus awanori) (ATCC 14331)，米根菌(Rhizopusoryzae)(ATCC 4858)，寡孢根霉(Rhizopus oligosporus)(ATCC22959)，日本根霉(Rhizopus japanicus) (ATCC 8466)，台湾根霉(Rhizopus formosaensis)，卷枝毛霉(Mucor cirlnelloides)(ATCC 15242)，日本毛霉(Mucor japanicus)，灰绿青霉(Penicillium glaucum)和褐色青霉(Penicillium fuscum)(ATCC10447)。称为ATCC号码的菌株在美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland 20852，U.S.中找到。本发明不受上述使本领域技术人员执行本发明的表示所限制。
本发明的重组细胞包括与染色体或复制型质粒稳定结合的DNA分子。在本发明创建的所有重组细胞中推荐菌株米曲霉CNCM I-1887，米曲霉CNCM I-1888和巴斯德毕赤氏酵母CNCM I-1886。
优选dpp IV基因的功能性拷贝结合在宿主细胞染色体DNA预先确定的基因座结合。
相应地，为了使至少一个未与任何启动子融合的功能性dpp IV基因可操作地与原核细胞的染色体结合，本发明的DNA分子通过运用EP564966中描述的方法结合，即(1)使用在宿主菌中不复制的供体质粒转化宿主菌生物体，其中供体质粒包括载体主链，和本发明的dpp IV基因在无启动子时，可操作性地结合到宿主菌操纵子部分，仍保持宿主菌的基因组操纵子的框和功能；(2)辨别完全供体质粒结合在宿主菌的基因组操纵子的共结合转化体；和(3)从共结合转化体中选择整合的转化体，其中所选的整合转化体的基因组不包括供体质粒的载体主链，但包括dpp IV基因，它可操作地结合于保守的基因组操纵子，并由于必要顺反子在生长中正确发挥功能的选择压力，在标准培养基中稳定保留并表达。
在第2个实施方案中，为了把宿主生物天然来源的启动子和终止子融合的仅一个功能性dpp IV序列稳定地整合到真核细胞染色体中，本发明的DNA通过de Ruiter-Ja cobs称为改编的方法结合，Y.M.J.T.，Broekhuijsen等，(基因转移系统基于同源pyrG基因和细菌基因在米曲霉中有效表达，现代遗传学，16159-163，1989)，即，(1)由连接dpp IV制备一种非制得性DNA片段，该片段与天然来源于宿主生物的启动子和终止子操作性连接在一起，位于编码任何必需基因的DNA序列下游，所述必需基因通过至少一个突变或缺失失活(此必需氨基酸可为尿嘧啶生物合成中的基因，如米曲霉例中的pyrG基因)；(2)选择包含通过其它突变或缺失失活的必需基因的宿主生物体；(3)以非复制DNA片段转化所述宿主生物体；(4)辨别整合转化体，其中DNA片段为结合其中，重现必需基因的天然功能，(5)选择仅有一个DNA片段结合的结合转化体。
本发明还包括根据本发明的DNA分子的表达宿主的后代，相应地，本发明的优选实施方案定向在包括以上描述的任何实施方案中本发明的重组DNA分子的细胞，其中所述细胞能结合dpp IV至细胞壁或细胞膜或能分泌此酶到壁膜间隙或培养基。根据本发明的重组蛋白的分泌途径依赖于所选宿主细胞和根据本发明的重组DNA的组成。最优选蛋白被分泌到培养基中。最后，根据本发明的细胞可包括进一步可操作地连于编码外源前导序列(前或前原蛋白)的DNA上的重组dpp IV基因。
优选过表达本发明中DPP IV的细胞，尤其是在含1％(w/v)小麦谷蛋白的基本培养基，如MMWG培养基中生长，每ml上清可提供至少50mU，尤其至少100mU DPP IV活性的曲霉属细胞。
这些细胞可通过在表达宿主中掺入本发明的DNA分子而得到，所述DNA分子包括增加本发明的蛋白表达水平的一或更多调节序列。
过表达可通过引入本发明的DNA分子的多拷贝进一步进行。令人惊奇的，结合本发明多重组功能性dpp IV基因的曲霉属细胞每ml上清提供的DPP IV活性超过根据其结合拷贝数所预测的量，可能是由于负作用转录因子的滴定作用。例如，以下实施例1的米曲霉转化体6根据布达佩斯条约保藏在国立微生物保藏中心，保藏号CNCM I-1888。
此外，DPP IV的过表达可在天然提供脯氨酰二肽基肽酶活性的曲霉属的种中进行，通过结合指导编码脯氨酰二肽基肽酶活性的基因表达的曲霉属天然启动子的多拷贝得到。米曲霉的启动子区包含在SEQ IDNO1的核苷酸1到核苷酸1835的核苷酸序列中，对此目的有特别意义。例如，以下实施例4的米曲霉转化体B2根据布达佩斯条约保藏在国立微生物保藏中心，保藏号CNCM I-1887。
本发明还给出了生产本发明DPP IV的方法，包括，在细胞表达DPPIV的条件下提供根据本发明在适当生长培养基中的重组细胞，以及以浓缩物形式选择性分离所述重组蛋白。适当培养基的选择基于表达宿主的选择和/或DNA重组物的调节需要。这些培养基为本领域技术人员所熟知。
发酵之后，细胞经离心或过滤从发酵培养液中转移。宿主细胞分泌本发明的DPP IV至培养基或DPP IV仍以某种形式与宿主细胞关联，存在于胞质，壁膜间隙或与细胞壁或细胞膜相连，依赖DPP IV存在位置的不同，细胞经过进一步处理获得重组蛋白。在后者情况下，重组酶仍与细胞相连，破裂细胞，可用高压，超声处理，酶消化或细胞自溶，而后进行期待的产物的分离重新获得。DPP IV可用多种方法从细胞材料中分离，如超滤，而后加入有机溶剂沉淀。分离的DPP IV通过方便的方法如沉淀和/或层析进一步纯化。
本发明还涉及运用纯化的DPP IV或以上提到的细胞水解含蛋白的物质，如蛋白源和糖源的混合物，尤其是豆科植物或烧煮的豆科植物和煮或烤的谷物源的混合物，例大豆或煮熟的豆和煮或烤小麦或稻米的混合物。包括小麦谷蛋白的混合物尤其适合本发明的目的，因当小麦谷蛋白通过传统日本酒曲培养水解后，在含脯氨酸肽中保持汇集可观量的谷氨酰胺。
为获得满意的水解，纯化的DPP IV可适当加入到蛋白物质，每100g蛋白质0.05-15单位，尤其为100g蛋白0.1-8单位。孵育在pH 4-10之间进行，优选5-9之间。孵育可在任何酶制剂不失活的方便的温度下进行，即范围在20℃-70℃。
另外，DPP IV水解过程中或之后，为进一步释放与脯氨酸残基相连的尽可能多的谷氨酰胺，本发明提供一种方法，本发明的DPP IV与至少一种提供肽酶活性的酶联用，即一种对X-Pro型二肽高水平特异性的酶。(Ezespla等，应用环境微生物学63，314-316，1997；这类酶Sigma有售E.C.3.4.13.9)。
进一步的，本发明涉及食物产品，包括可从发酵获得的蛋白水解产物，发酵中至少有一种在含1％(w/v)小麦谷蛋白的基本培养基中生长时可提供每ml高过50mU的脯氨酰二肽基肽酶活性的微生物。
本发明重要的食物产品是婴儿的母乳替代物成分，或水解的植物蛋白成分，即，日本酒曲。实际上，如果DPP IV活性(酶或微生物)与其它蛋白水解活性(酶或微生物)联合，即典型地，如果运用巴斯德毕赤氏酵母CNCM I-1886或米曲霉CNCM I-1887或CNCM I-1888或其纯化酶，可获得高程度的水解，与未水解蛋白相比导致非苦味和显著降低的反感。奶替代品可进一步如此种产品文献所述方法制备(参照EP 96202475.8)。
本发明不限于在此描述的具体实施方案的范围。实际上，除了本发明的许多修改方法在此所述的，对本领域技术人员而言从叙述和附图
来看，是显而易见的。这些修改方法在权利要求范围内。在此引用的多种出版物，为理解本发明起见，其公开内容全部收入仅作参考。DNA操作，克隆及细菌细胞转化，除另外说明，都根据Sambrook等教材进行(Sambrook等，分子克隆实验指南，冷泉港实验室出版社，美国，1989)。这些实施例大概描述了使用的质粒和菌株，以及不同培养基的成分。菌株米曲霉TK3，米曲霉转化体6(实施例1)，米曲霉转化体B2(实施例4)，包括pKJ115的巴斯德毕赤氏酵母(实施例3)按布达佩斯条约保藏在国立微生物保藏中心25 rue du docteutRoux，75724巴黎，法国，6月24，1997，保藏号CNCM I-1882，CNCM I-1888，CNCM I-1887和CNCM I-1886。这些保藏物使用的限制性包括在本申请的首次公布或本申请权利要求优先权的另一份权利要求中。菌株和质粒米曲霉44和TK3来源于Nestle菌株收集中心。但其它野生型米曲霉菌株也可运用在以下实施例的上下文中。
米曲霉NF1通过定向破坏(尿苷营养缺陷)衍生自TK3。
构巢曲霉(Aspergillus nidulans)033(biA1，argA1)从真菌遗传贮备中心，Glasgew获得，用作pyrG(GenBank登记号M19132)的基因来源。但其它野生型构巢曲霉菌株也可运用在以下实施例的上下文中。
巴斯德毕赤氏酵母(Invitrogen公司，美国)，包括烟曲霉(Aspergillus fumigatus)dpp IV基因的质粒pMTL21-H4.6由巴斯德研究所，巴黎，法国提供(Beauvais等，人致病真菌烟曲霉分泌CD26的同源物，传染免疫学，待发表1997，GenBankEMBL，登记号V87950)。
质粒pNFF28含有米曲霉TK3 pyrG基因(GenBank EBI/UK，登记号Y13811)。
质粒pMTL20(Chamber等，基因；68，139-149，1988；GenBank EMBL，登记号M21875)，pNEB193(Biolabs，NewEngland)和pBluescriptSK-(Stratagene，US)使用在亚克隆方法中。
质粒pCL1920b是质粒pCL1920(Lerner和Inouye核酸研究，18，4631，1990)的衍生物，其中多克隆位点改变，在BamHI和SalI位点之间包括Sma I和EcoRI位点。
巴斯德毕赤氏酵母表达载体pK115通过在pCL1920b中克隆pPIC9(Invitrogen)的表达盒构建，在pK115中，pPIC9(Invitrogen)的表达盒由2个Sma I位点位于两侧，使DNA在转化巴斯德毕赤氏之前线性化。生长培养基米曲霉生长在根据Pontecorvo等(高级遗传学5，141-239，1953)的方法制备的基本培养基(MM)上。
米曲霉NF1在35℃生长于含10mM NaNO3作为氮源并含10mM尿苷的MM上。
MMWG包含MM，外加1％(w/v)(小麦谷蛋白)(WG)(Sigma)，MMWGH包括MM和0.1％(w/v)WG(Sigma)外加0.1％(w/v)WG水解产物，此水解产物通过用产碱酶(Alcalase)2.4L(Novo Nordisk，丹麦)水解非活力小麦谷蛋白粉末(Roquetto，法国)制备。水解以20％(w/v)底物浓度和酶底物比(E/S)1∶50(蛋白重)，60℃进行6小时，恒定pH 7.5。产碱酶(Alcalase)90℃热灭活10分钟。水解产物离心，上清冻干产生WGH，室温保存。WGH包括大部分肽和极少量自由氨基酸，WGH的肽质量分布从200至10,000Da，由在Superdex肽柱上进行的大小排阻层析确定。
巴斯德毕氏酵母可生长在RDB(再生葡萄糖基质)1M山梨糖醇，1％(w/v)葡萄糖，1.34％(w/v)酵母氮基质(YNB)，4×10-5％(w/v)生物素，5×10-3％氨基酸(即5×10-3％(w/v)的L-谷氨酸，L-甲硫氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸和L-异亮氨酸。
MMM(基本甲醇培养基)1.34％(w/v)YNB，4×10-5％(w/v)生物素，0.5％(w/v)甲醇。
BMGY(缓冲型基本甘油-复合物培养基)1％(w/v)酵母抽提物，2％(w/v)胨，10mM磷酸钾pH 6.0，1.34％(w/v)YNB，4×10-5％(w/v)生物素，1％(w/v)甘油。
BMMY(缓冲型基本甲醇复合物培养基)1％(w/v)酵母抽提物，2％(w/v)胨，10mM磷酸钾pH 6.0，1.34％YNB，4×10-5％(w/v)生物素，0.5％(w/v)甲醇。实施例1 dpp IV的克隆基因组文库的筛选运用来自米曲霉44的DNA制备基因组DNA文库，以含烟曲霉的dpp IV基因的DNA片段筛选(Beauvais等，GenBank EMBL，登记号V87950)。
为此目的，根据Raeder和Broda描述方(应用微生物学通讯，1，17-20，1985)的改进方法进行基因组DNA的分离，过滤收获菌丝体，立即液氮冷冻，冻干。而后使用研钵和研杵将菌丝体粉碎为粉末。200mg的粉状菌丝体重悬在2.5ml抽提缓冲液(200mM Tris-HClpH 8.5，150mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS)中，溶液用1.75ml抽提缓冲液平衡的酚和0.75ml氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)抽提。混合物离心(20分钟，3000g)。收集水相，与125μl RNA酶(Boehringer)溶液(10mg/ml)孵育37℃10分钟。加1.25ml 2-丙醇(Merck)。沉淀用70％乙醇洗，重悬在500ml TE缓冲液(10mMTris-HCl pH 8.0，1mM EDTA)。加500μl 2×QBT(1.5MNaCl，100mM MOPS，30％乙醇，pH 7.0)到样品中，而后应用到“Genomic-tip”(Qiagen)，按生产商说明冲洗，洗脱。
基因组DNA用Sau3A部分消化，低熔点胶(Biorad)分离12-20kb的DNA片段。这些片段插入到噬菌体中，运用λEMBL3 BamHI臂克隆系统(Promega，US)。
λEMBL3中米曲霉44基因组文库的40000重组噬斑固定到尼龙膜(Genescreen Dupont)上。这些滤膜用32P标记的PCR扩增的pMTL21-H4.6 2.3kb dpp IV插入片段探测，杂交5×SSC溶液中包括20％甲酰胺，1％十二烷基硫酸钠(SDS)，和10％硫酸葡聚糖，42℃进行20小时。DNA的标记通过运用随机引物DNA标记试剂盒(Boehringer)和(α32P)-dATP进行。膜在3×SSC-1％SDS中40℃20分钟清洗2次，之后曝光到X-射线胶片上。
分离并纯化10个阳性克隆。对纯化的噬菌体DNA的限制性酶分析揭示克隆携带相似但不完全相同的DNA片段。通过Southern分析可知dpp IV基因分配在ApaI-EcoRV 4.8kb片段，它被亚克隆入pBluscriptSK-，产生质粒pNFF125。功能检查质粒pNFF125通过与质粒pNFF28共转化导入米曲霉NF1，结果携带用于选择转化体的pyrG基因。为此目的，米曲霉NF1在加50mM葡萄糖，5mM谷氨酰胺，10mM尿苷的MM中生长过夜。菌丝体通过无菌干酪布过滤收获，无菌双蒸水洗1次，K0.8MC(20mM MES-HCl pH 5.8，0.8M KCl，50mM CaCl2)洗1次。2g菌丝体重悬在20ml滤膜除菌的K0.8MC中含5mg/mlNovozyme 234的溶液中。菌丝体悬浮液轻柔振荡(120rpm)，30℃2小时。用吸管轻柔重悬使原生质体从菌丝中释放，20ml S1.0TC(10mM Tris-HCl pH 7.5，lM山梨醇，50mM CaCl2)洗2次，以108/ml的终浓度重悬在S1.0TC中。20ml DNA与200ml原生质体和50ml 10mM Tris-HCl pH 7.5，50mM CaCl2中的25％PEG6000(BOH)混合，冰浴20分钟。此混合物中加入2ml 10mMTris-HCl pH 7.5，50mM CaCl2溶液中的25％PEG6000，轻柔混合，室温孵育5分钟。加4ml S1.0TC，10ml的等份与5ml 2％低熔点琼脂糖(Sigma)SMM(MM附加50mM葡萄糖，5mM谷氨酰胺，用1.0M蔗糖进行渗透平衡)混合，置于SMM琼脂(Difco)上。MMWGH孵育12天，30℃)后95 pyrG+转化体按其DPP IV活性筛选。为此目的，转化体的孢子在SP2缓冲液(20mM KH2PO4用HCl和0.9％NaCl调pH 2.0)中重悬在微量滴定板上，复制模板到用Whatman滤膜(Chrl)覆盖的含MMWGH的培养皿。平皿在30℃孵育2天。根据Lojda(组织化学，54，299-309，1977)和Aratake等(美国临床病理学杂志，96，306-310，1991)在滤膜上检测DPP IV活性。滤膜与含0.25ml N，N-二甲基甲酰胺(Merck)中溶3mg甘氨酰脯氨酸4-β萘胺(Bachem)的溶液和5mg邻联茴香胺的溶液反应，在4.6ml 0.1M磷酸钠缓冲液中pH 7.2，室温下四唑化(Sigma)10分钟。内切蛋白酶酶活性根据Boehringer方法及底物用9-羟基-3-异吩唑酮标记的酪蛋白测量。(9-羟基-3-异吩唑酮标记的酪蛋白，Cat.No.1080733)。亮氨酸氨肽酶和二肽肽酶IV活性通过UV光谱各自测定合成底物Leu-pNa和Ala-Pro-pNa(Bachem，Switzerland)而确定，根据Sarath等方法(蛋白水解酶的蛋白酶分析方法一种实有途径，IRL出版社，牛津，1989进行)。二甲基亚砜(DMSO)中10mM的底物贮液用100mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0稀释至终浓度为0.5mM。加入20-100μl培养物上清，反应37℃进行60分钟。平行试验以空白底物和空白上清为对照。生色基团4-硝基苯胺(ε10’500 M-1cm-1)的释放在400nm测量，活性以mU/ml(nmol/ml)表示。
结果表明，比野生型相比，16个转化体表现为明显增加的染色。7个转化体编号1-7因其高DPP IV活性而被选择。对它们进行Southern印迹，结果表明这种DPP IV活性的增加是由于4.8kb ApaI-EcoRV片段的多拷贝在转化体基因组中的结合。从Southern印迹的光密度扫描推测，在转化体1中，至少有4个额外拷贝功能性地结合到基因组DNA，而在转化体6中，它们至少为9个拷贝。
为了在转化体1和6中确定DPP IV活性的增加，让它们与对照米曲霉NF1 pyrG+平行生长，在100ml液体MMWG中无振荡30℃生长7天。对上清的分析显示在表1。转化体1和6显示至少8和17倍超过米曲霉pyrG+转化体的DPP IV活性，而它们的亮氨酸氨肽酶(LAP)和内切蛋白酶(ENDO)活性保持不变。这些数据显著说明pNFF125包括功能dpp IV基因。另外，当引入功能性基因时DPP IV的活性与比其结合拷贝数相比更增多。差异可能缘于负作用转录因子(阻抑物)的滴定。表1
DPP IV的特征超量生产脯氨酰二肽基肽酶的转化体6和对照米曲霉NF1 pyrG+的液体培养物进行SDS-PAGE分析。与米曲霉pyrG+对照相比，脯氨酰二肽基肽酶超量生产的菌混有染色更强的单条带。但在脯氨酰二肽基肽酶超量生产菌株中，可见95kDa周围区域的广泛弥散(成片条带)，在对照米曲霉NF1 pyrG+中无。这种异常的电泳行为可能由酶的糖基化造成。所以，液体培养物用N-糖基化酶F处理重新分析。在去糖基化样品中，对照NF1 pyrG+和脯氨酰二肽基肽酶超量生产转化体中，显出一条85-90kDa的带。转化体6的培养物培养基经N-糖基化酶F处理的样品，相当于100mU脯氨酰二肽基肽酶活性，装入制备型凝胶并印迹到Immobilon PSQ膜。假定的脯氨酰二肽基肽酶带被切下，进行自动Edman降解分析。成熟蛋白的N-末端序列被确定为Leu-Asp-Val-Pro-Arg-……。ApaI-EcoRV片段测序 来自pNFF125的4.8kb片段双链测序。dppIV基因的核苷酸顺序在Licor型号4000自动测序仪测定。具有核苷酸序列SEQ ID NO3的IRD41标记引物用于对部分重叠亚克隆的双链测序，通过Sanger等的双脱氧核苷方法。(美国国家科学院院报，74，5463-5467，1977)。DNA序列分析因GCG电脑程序实施(Devereux等，核酸研究，12，387-395，1987)。
转录起始点的位置通过引物延伸作图。RT-PCR确定外显子和内含子位置。为此目的，米曲霉TK3菌丝体在MMWGH培养过夜，从中分离总RNA，使用“RNeasy总RNA纯化试剂盒”(Qiagen)逆转录PCR(RT-PCR)使用“RT-PCR cDNA第一链合成试剂盒”(Boehringer)实施。10μg总RNA，1×反应缓冲液(10mM Tris，50mM KCl pH8.3)，5mM MgCl2，1mM脱氧核苷混合物，1.6μg寡聚-p(dT)15引物，50单位RNA酶抑制剂，10单位AMV逆转录酶混合，25℃孵育10分钟，42℃60分钟，75℃5分钟，4℃5分钟。1μl，2μl和3μl获得的cDNA，2mM寡核苷酸和250mM dNTPS(Boehringer)溶在50ml 1×PCR缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.55，16mM (NH4)2SO4，2.5mM MgCl2，150mg/ml BSA)中。每个反应加1.5单位Taq聚合酶(Biotaq)，1滴Nujol矿物油(PerkinElmex)。dpp IV基因的靶区域用引用对SEQ ID NO4和SEQ IDNO5，Stratagene Robo Cycler梯度40。扩增反应混合物先进行2个循环98℃1分钟，56℃2分钟，72℃2分钟，而后进行27个循环94℃1分钟，56℃1分钟和72℃2分钟，1个循环94℃1分钟，56℃1分钟，72℃10分钟。凝胶纯化的PCR产物用QiaexII(Qiagen)收获，直接连入pGEM-T载体(Promega)，根据生产商说明建立质粒pNFF137。
结果显示开放阅读框(ORF)被一个83bp内含子分为2个外显子。进一步的，根据Von Heijwe(核酸研究；14，4683-4690，1986)描述的信号序列规则，辩认与烟曲霉序列同源的16氨基酸长的N-末端分泌信号序列。dpp IV基因具核苷酸序列SEQ ID NO1，编码分子量85.4kDa的755氨基酸的成熟蛋白(见SEQ ID NO2)。dpp IV的信号序列从1835(ATG)到1966位，包括内含子。Edman降解确认成熟蛋白在位1967以氨基酸序列LeuAspValProArg起始。外显子1起始于位点1836，终止于1841位；内含子起始于位点1842，终止于位1924；外显子II在位1925起始，终止于位4231。实施例2 dpp IV基因的破坏为确定是否克隆的dpp IV基因唯一负责MMWGH上观察的DPP IV活性，它被破坏。
作为异源选择标记，阻止破坏结构靶向pyrG基因座。从构巢曲霉033扩增构巢曲霉pyrG基因。为此，PCR扩增pyrG基因(Oakley等，基因，61，385-399，1987)第500位到2342位间的序列。200ng构巢曲霉033基因组DNA，2mM寡核苷酸和250mM dNTPS(Boehringer)溶解在50ml 1×PCR缓冲液(20mM Tris-HClpH 8.55，16mM (NH4)2SO4，25mM MgCl2，150mg/ml BSA)中。每个反应加1.5单位Taq聚合酶(Biotaq)，1滴Nujol矿物油(Perkin Elmer)。使用Stratagene Robo Cycler梯度40，引物对SEQ ID NO6和SEQ ID NO7，扩增靶区域。反应混合物进行30个循环95℃1分钟，52℃1分钟，72℃3分钟为1个循环。QiaexII(Qiagen)收获凝胶纯化的1.8kb PCR产物，克隆至pGEM-T(promega)，根据生产商说明，建立pNFF39。
平行实验中，dpp IV的突变型等位基因通过用来自pNFF39的1.8kb NcoI片段取代pNFF125的间隔1.5kb NcoI片段，产生pNFF129。
将ApaI-EcoRV消化的pNFF129引入米曲霉NF1，转化体在MM上生长。95个在MMWGH测试的转化体中。18个转化体不表现DPPIV活性。选择6个DPP IV阴性转化体，编码8到13，选择4个仍表现DPP IV活性的转化体，编号14到17。来自这10个转化体的NcoI消化的基因组DNA用dpp IV PCR片段探测，进行Southern印迹(见实施例2)。在不表现DPP IV活性的转化体中，1.5kb NcoI片段缺失，证明野生型被破坏结构置换。在DPP IV活性保留的转化体中，1.5kb片段仍存在，与其它分子量的片段杂交显示该破坏结构与基因组的另一位点结合。
为确定DPP IV活性，转化体10，11和15以及米曲霉NF1 pyrG+转化体在液体MMWG中30℃生长7天。上清液的酶分析(表2)显示转化体10和11具残留脯氨酸二肽肽酶活性，可能是由于一些非特异性酶。通过对照，转化体15与野生型相比具更高的DPP IV活性(至少4倍)。对DPP IV破坏突变型原初筛选的检查与野生型相比，揭示了高活性的克隆。因破坏性结构不包括功能基因，活性的增加可能缘于对阻抑物的滴定。表2
实施例3 米曲霉DPP IV在巴斯德毕赤氏酵母中的表达巴斯德毕赤氏酵母的转化以质粒pNFF125为模板PCR扩增dpp IV基因。200ng pNFF125 DNA，164 pmol寡核苷酸，120mM dNTP溶解在50ml PCR缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.8，2mMMgSO4，10mM (NH4)2SO4，0.1％Triton X-100，100mg/ml无核酸酶(BSA)。加一滴dynawax(Dynazyme)。每个反就应加2.5单位克隆的pfu DNA聚合酶(Stratagene)至50ml 1×PCR缓冲液中。米曲霉dpp IV基因用引物对SEQ ID NO8和SEQ ID NO9(这些引物覆盖成熟蛋白编码区的N-和C-末端)扩增。反应混合物进行30个循环，每个循环为95℃1分钟，44℃1分钟，72℃3分钟，使用Perkin Elmer DNA热循环仪。
PCR产物用EcoRV和NotI消化，克隆至SnaBI，NotI消化的pK115，产生质粒pNFF134。巴斯德毕赤氏酵母原生质球用10μgpNFF134转化，EcoRI线性化，如毕赤氏酵母表达试剂盒(Invitrogen)手册2.0版所述。
巴斯德毕赤氏酵母表达盒pKJ115可插入巴斯德毕赤氏酵母基因组，通过在乙醇氧化酶(AOX1)位点同源重组并在感兴趣的克隆的编码序列之外携带his4基因用于选择。转化体首先在组氨酸缺陷培养基(RDB)上选择，随后在基本甲醇培养基(MMM)上筛选aox1位点结构的插入。不能在仅含甲醇作碳源的培养基(BMMY)上生长的转化体被认为通过在aox1基因座的结合条件置换aox1编码区域，因而在正确的酵母基因组位置包括了该结构。所选的转化体在10ml甘油基质的酵母培养基(BMGY)中30℃生长近饱和(OD20 600nm)。收获细胞在2ml BMMY中重悬，孵育2天。孵育2天后，收获上清，取10ml SDS-PAGE分析，根据Laemmli(1970)的方法，7.5％(w/v)聚丙烯酰胺分离胶有效辨认表达克隆。在平行实验中，检查上清活性。
结果显示所获DPP IV浓度为100μg/ml。上清中测得活性为1385mU/ml。在所有转化体中，六月份选取一个按布达佩斯条约保藏在国立微生物保藏中心(CNCM)，25 rue du docteur Roux，75724巴黎，法国，保藏号CNCM I-3。大小排阻层析(SEC)判断肽分布 检测DPP VI对水解产物中肽的效力。95℃10分钟使dpp IV破坏子11上清中的酶热失活。如产自巴斯德毕赤氏酵母CNCM I-3的140mU纯化的DPP IV到500μl上清，45℃孵育到24小时。平行进行不加DPP IV的对照实验。每2小时间隔取1等份，10％TFA酸化，离心，SEC分析，使用Superdex PeptideHR 10/30柱(Pharmacia Biotech，瑞典)。分离基于氨基酸和肽的分子大小(范围100-7000 Da)。无梯度条件下层析，水中加0.1％TFA，20％乙腈，流速0.5ml/min。在215nm测得氨基酸和肽的峰。使用肽和氨基酸标准校准层析系统(在此不显示数据)。
结果显示孵育2小时后小肽(200-500 Da)开始增加。继续孵育(至24小时)释放更多二肽。在2小时和24小时孵育时间的对照样品中未检测到变化。所以，显然是DPP IV的活性使二肽从小麦谷蛋白水解产物中释放，确证了此酶在肽降解中的效力。实施例4 dpp IV天然启动子的转化质粒pNFF126包括含启动子区的2094 bp ApaI-BamHI片段和DPP IV基因的起始部分(见SEQ ID NO1)，将其引入米曲霉NF1以pyrG基因为选择标记。染色筛选米曲霉NF1 pyrG+转化体，根据其脯氨酰二肽基肽酶活性，两个转化体(B2，C7)显示比其它转化体更强的染色。因此将它们置于液体MMWG 30℃无振荡培养7天，选取任意3个其它转化体和仅用pyr G转化的对照米曲霉NF1对照进行平行实验。
分析液体培养物的脯氨酰二肽基肽酶活性。结果显示转化体B2和C7与对照相比其脯氨酰二肽基肽酶活性分别有4倍和2倍的增加而所有其他转化体未出现该活性的增加。在破坏实验(见实施例2)中，转化体15的脯氨酰二肽基肽酶活性最高增加4倍。此增加是由于在米曲霉NF1基因组中阻抑物被启动子的多拷贝异源结合滴定，或是阻抑物被2094 bp ApaI-BamHI片段编码的正作用因子滴定。实施例5 DPP IV的功能衍生物DPP IV(SEQ ID NO2)的功能性衍生物根据来自Adams等(EP 402450，Genencor)描述的方法制备。简而言之，包括DPP IV的表达盒pKJ115以羟胺造成体外化学诱变。根据实施例3，以突变的DNA转化巴斯德毕赤氏酵母的DPP IV功能性衍生物表现为某些氨基酸缺失，添加和/或取代，根据它们从用纯化的DPP IV衍生物水解小麦谷蛋白获得的肽谱探测。(见实施例3)。实施例6为制备发酵大豆酱汁，先将米曲霉CNCM I-1日本酒曲培养物与煮过的大豆和烤小麦的混合物混合制备日本酒曲，此日本酒曲与米曲霉CNCM I-1培养物发酵过程制备的酶在水性悬浮液中水解，45℃～60℃3-8小时，加入适当量的氯化钠到水解的日本酒曲悬浮液进一步制备酱醪，酱醪发酵，压榨，获得的溶液消毒，澄清。实施例7为制造香味剂，制备煮过的大豆和烤小麦混合物的水性悬浮液，蛋白经蛋白酶的悬浮液在pH 6.0-11.0水解溶解，悬浮液在pH 4.6-6.5热处理，而后悬浮液用米曲霉CNCM I-2发酵的日本酒曲培养物的酶催熟。
序列表(1)概况(i)申请人(A)名字Societe DES PRODUITS NESTLE(B)街道AV.NSTLE 55(C)城市VEVEY(D)州VAUD(E)国家瑞士(F)邮政编码(ZIP)CH-1550(ii)发明题目米曲霉中脯氨酰二肽基肽酶的克隆(iii)序列数9(iv)机读形式(A)介质类型软盘(B)电脑IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度5496碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名字/关键词外显子(B)位置1836..1841(ix)特征(A)名字/关键词外显子(B)位置1925..4231(ix)特征(A)名字/关键词内含子
(B)位置1842..1924(ix)特征(A)名字/关键词信号肽(B)位置1836..1841(ix)特征(A)名字/关键词信号肽(B)位置1925..1976(ix)特征(A)名字/关键词启动子(B)位置1..1835(ix)特征(A)名字/关键词终止子(B)位置4232..4771(xi)序列描述SEQ ID NO1GGGCCCTGAG TTTAACGGTG CTGGGTGTGT TATTACGCAT CATACTCTTC ACCCGCCTTG 60CAGTAGTTCG GTTCTATTGT CAATAGCTGC TGTCGCAATA TTCTGTCTTT TGCCAATAAG 120GTGACCAGGA GGGGTCTTTC CAGGATAGAT AGATGGCGAC ATTTATCTCG TCGCGGCGGT 180GATTGTCTGT TTGATTGATG ATGATCTCTG AAACATGTTG AATCTGGGGT ACGTAACTTG 240GGGTGATCAA TTGACATCCA CTTAGATATG GTACAGCAAA GTATACCTCC TGGATTCTGT 300GAACAAGAAT ATAAAATAAG CCTCGCGACC GGGAGTCTTG TCCCTCAAAT CATCACAATC 360CCATCGAACA TCCGCATCTA ATTTCCTCAC TCATCCTTCT ATCCACCGCC AAAATGAAGG 420CCGCTACCCT CCTCTCTCTT CTGAGCGTTA CCGGACTCGT CGCCGCTGCT CCAGCTGGCA 480ACGGTACGTA TCCTGAACGA CAATGTAAGA CGCTTGACTG ATGATTAGTA GGCCCAGCTG 540GTGGAATCAT CGACCGCGAT CTTCCCGTCC CTGTCCCTGG ACTCCCTACC AAGGGTCTCC 600CTATTGTTGA CGGATTGACT GGCGGCAATA AGGGTGGCGA GAAGCCTGGA AGCAAGGTTA 660CTCCTCGTGA AGACCCTACC GGCAGCGCCC CTGATGGCAA GGGCAATGAT GGCCCCGACG 720GTGATCTTAC 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GAACTCTACA CGACCAACAG TACCAAACCA CTCCGCACAA TCACCGACAA3360CGCCAAAGTA CTCGAGCAAA TCAAGGACTA TGCATTGCCC AACATCACCT ACTTCGAGCT3420TCCCCTCCCC TCCGGAGAAA CCCTCAATGT GATGCAGCGC TTACCCCCCG GGTTCTCCCC3480GGATAAGAAG TACCCCATAC TTTTCACCCC ATACGGCGGC CCAGGCGCCC AAGAAGTGAC3540CAAGAGATGG CAAGCCCTGA ATTTCAAGGC CTATGTCGCC TCCGACAGCG AACTCGAGTA3600CGTAACCTGG ACTGTCGACA ACCGCGGCAC AGGTTTCAAA GGACGCAAGT TCCGCTCCGC3660CGTCACGCGC CAACTCGGCC TCCTCGAAGC AGAAGACCAG ATCTACGCCG CGCAACAGGC3720GGCCAACATC CCCTGGATCG ATGCAGACCA CATCGGCATC TGGGGCTGGA GTTTCGGAGG3780CTACTTGACC AGCAAGGTCC TGGAGAAGGA CAGCGGTGCT TTCACATTAG GAGTCATCAC3840CGCCCCTGTT TCTGACTGGC GTTTCTACGA CTCAATGTAC ACGGAGCGCT ACATGAAGAC3900CCTCTCGACC AATGAGGAGG GCTACGAGAC CAGCGCCGTC CGCAAGACTG ACGGGTTCAA3960GAACGTCGAG GGCGGATTCT TGATCCAGCA CGGAACGGGC GACGATAACG TCCATTTCCA4020GAACTCGGCT GCGCTGGTGG ATCTCCTGAT GGGCGATGGC GTCTCTCCTG AGAAGCTCCA4080TTCGCAATGG TTCACAGACT CAGACCACGG AATCAGCTAC CATGGTGGCG GCGTGTTCCT4140GTACAAGCAA CTGGCCCGGA AGCTCTACCA GGAGAAGAAC 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Ile Asp Ala Phe Glu Ser Thr Asp Leu Ile260 265 270Ile Gly Glu Val Ala Trp Leu Thr Asp Thr His Thr Thr Val Ala Ala275 280 285Lys Ala Phe Asn Arg Val Gln Asp Gln Gln Lys Val Val Ala Val Asp290 295 300Thr Ala Ser Asn Lys Ala Thr Val Ile Ser Asp Arg Asp Gly Thr Asp305 310 315 320Gly Trp Leu Asp Asn Leu Leu Ser Met Lys Tyr Ile Gly Pro Ile Lys325 330 335Pro Ser Asp Lys Asp Ala Tyr Tyr Ile Asp Ile Ser Asp His Ser Gly340 345 350Trp Ala His Leu Tyr Leu Phe Pro Val Ser Gly Gly Glu Pro Ile Pro355 360 365Leu Thr Lys Gly Asp Trp Glu Val Thr Ser Ile Leu Ser Ile Asp Gln370 375 380Glu Arg Gln Leu Val Tyr Tyr Leu Ser Thr Gln His His Ser Thr Glu385 390 395 400Arg His Leu Tyr Ser Val Ser Tyr Ser Thr Phe Ala Val Thr Pro Leu405 410 415Val Asp Asp Thr Val Ala Ala Tyr Trp Ser Ala Ser Phe Ser Ala Asn420 425 430Ser Gly Tyr Tyr Ile Leu Thr Tyr Gly Gly Pro Asp Val Pro Tyr Gln435 440 445Glu Leu Tyr Thr Thr Asn Ser Thr Lys Pro Leu Arg Thr Ile Thr Asp450 455 460Asn Ala Lys Val Leu Glu Gln Ile Lys Asp Tyr Ala Leu Pro Asn Ile465 470 475 480Thr Tyr Phe Glu Leu Pro Leu Pro Ser Gly Glu Thr Leu Asn Val Met485 490 495Gln Arg Leu Pro Pro Gly Phe Ser Pro Asp Lys Lys Tyr Pro Ile Leu500 505 510Phe Thr Pro Tyr Gly Gly Pro Gly Ala Gln Glu Val Thr Lys Arg Trp515 520 525Gln Ala Leu Asn Phe Lys Ala Tyr Val Ala Ser Asp Ser Glu Leu Glu530 535 540Tyr Val Thr Trp Thr Val Asp Asn Arg Gly Thr Gly Phe Lys Gly Arg545 550 555 560Lys Phe Arg Ser Ala Val Thr Arg Gln Leu Gly Leu Leu Glu Ala Glu565 570 575Asp Gln Ile Tyr Ala Ala Gln Gln Ala Ala Asn Ile Pro Trp Ile Asp580 585 590Ala Asp His Ile Gly Ile Trp Gly Trp Ser Phe Gly Gly Tyr Leu Thr595 600 605Ser Lys Val Leu Glu Lys Asp Ser Gly Ala Phe Thr Leu Gly Val Ile610 615 620Thr Ala Pro Val Ser Asp Trp Arg Phe Tyr Asp Ser Met Tyr Thr Glu625 630 635 640Arg Tyr Met Lys Thr Leu Ser Thr Asn Glu Glu Gly Tyr Glu Thr Ser645 650 655Ala Val Arg Lys Thr Asp Gly Phe Lys Asn Val Glu Gly Gly Phe Leu660 665 670Ile Gln His Gly Thr Gly Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala675 680 685Ala Leu Val Asp Leu Leu Met Gly Asp Gly Val Ser Pro Glu Lys Leu690 695 700His Ser Gln Trp Phe Thr Asp Ser Asp His Gly Ile Ser Tyr His Gly705 710 715 720Gly Gly Val Phe Leu Tyr Lys Gln Leu Ala Arg Lys Leu Tyr Gln Glu725 730 735Lys Asn Arg Gln Thr Gln Val Leu Met His Gln Trp Thr Lys Lys Asp740 745 750Leu Glu Glu755(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO3GCCTGGACCA CACTGACC 18(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO4TCCACCATGA AGTACTCC18(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO5ATCGCCGAGG ATCTCCTC 18(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)长度23碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO6GAATTCCATG GTGTCCTCGT CGG 23(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)长度24碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO7GAATTCGAGC CGTCAGTGAG GCTC 24(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)长度32碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO8TGGTCGATAT CCTGGATGTG CCTCGGAAAC CA 32(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO9TTGCGGCCGC TACTCCTCCA AGTCCTTCTT 30
权利要求
1.一种来自米曲霉的重组脯氨酰二肽基肽酶(DPP IV)包括SEQID NO2 1-755氨基酸的氨基酸序列或其功能性衍生物。
2.权利要求1的重组脯氨酰二肽基肽酶，该酶与一导肽相融合。
3.权利要求2的脯氨酰二肽基肽酶，该酶与具有SEQ ID NO2-16～-1位氨基酸序列的米曲霉导肽相融合或其功能性衍生物。
4.米曲霉导肽含有SEQ ID NO2 -16～-1位的氨基酸序列或其功能性衍生物。
5.一种DNA分子，包括编码根据权利要求1的酶的dppIV基因。
6.一种根据权利要求5的DNA分子，它是包括dppIV基因的载体。
7.一种根据权利要求5的DNA分子，其中dppIV基因可操作地与至少一个指导基因表达的调节序列相连。
8.一种根据权利要求7的DNA分子，其中调节序列衍生自非dppIV基因来源的生物体。
9.一种根据权利要求5的DNA分子，其中dppIV基因包括SEQID NO1核苷酸序列的编码部分或其因遗传密码简并性产生的功能性衍生物。
10.一种通过重组技术表达根据权利要求1-4的酶的细胞。
11.一种根据权利要求10的细胞，它为巴斯德毕赤氏酵母CNCM I-1886。
12.一种根据权利要求10的细胞，它可过量表达所述的酶。
13.一种根据权利要求12的细胞，它为一种在含1％(w/v)小麦谷蛋白的基本培养基中生长时，每毫升上清能提供至少50mU脯氨酰二肽基肽酶活性的米曲霉。
14.一种根据权利要求12的米曲霉，它与根据权利要求5到9的多个重组功能性dppIV基因结合。
15.一种根据权利要求14的米曲霉，它为米曲霉CNCM I-1888。
16.一种天然提供脯氨酰二肽基肽酶活性的曲霉，它与天然指导编码脯氨酰二肽基肽酶活性的基因表达的曲霉天然启动子的多拷贝结合。
17.一种根据权利要求16的曲霉，它与包括在核苷酸序列SEQ IDNO1中的启动子的多拷贝结合。
18.根据权利要求17的曲霉，它与具有SEQ ID NO1的核苷酸1836到核苷酸1966的编码核苷酸序列的启动子的多拷贝结合。
19.一种根据权利要求18的米曲霉，它为米曲霉CNCM I-1887。
20.一种天然提供脯氨酰二肽基肽酶活性的曲霉，它被遗传操纵从而使dppIV基因失活。
21.一种生产根据权利要求1所述的酶的方法，包括在细胞表达酶的条件下，在适当生长培养基中培养根据权利要求10-19的重组细胞，并任选以浓缩物形式选择分离所述的酶。
22.根据权利要求1的蛋白或根据权利要求10-19的细胞水解含蛋白物质的用途。
23.提供脯氨酰二肽基肽酶活性的酶和/或微生物，与至少一种提供脯氨酰氨基酸二肽酶活性的酶共用在水解含蛋白物质中的用途。
24.一种食物产品，包括通过用至少一种微生物酵解含蛋白物质获得的蛋白水解产物，所述的微生物当其在含1％(w/v)小麦谷蛋白的基本培养基中生长时，提供超过50mU/ml的脯氨酰二肽基肽酶活性。
全文摘要
本发明从米曲霉中提取新的重组脯氨酰二肽基肽酶(DPP Ⅳ),包括SEQ ID NO:2从氨基酸1到氨基酸755的氨基酸序列或其功能衍生物,并提供对以X－Pro起始的蛋白和肽的高水平水解特异性从而释放X－Pro型的二肽,其中X可为任意氨基酸。本发明还提供根据本发明编码该酶的DNA分子;及通过重组技术表达本发明的酶的细胞,提供脯氨酰二肽基肽酶活性的曲霉(Aspergillus),可与指导编码脯氨酰二肽基肽酶活性的基因表达的曲霉的天然启动子的多拷贝结合;以及具脯氨酰二肽基肽酶活性的曲霉,其活性可被基因工程操作,使dpp Ⅳ基因失活。本发明提供生产本发明的酶的方法,包括在细胞表达此酶的条件下在合适的生长培养基中培养本发明的细胞,以及选择性以浓缩物的形式分离酶。本发明提供应用本发明的细胞或酶水解包含蛋白的原料的应用方法。本发明提供具有脯氨酰二肽基肽酶的细胞或酶与至少一种具有脯氨肽酶活性的酶联合共用以水解包含蛋白的物质的应用方法。最后一方面,本发明提供一种食物产品,包括可从发酵获得的蛋白水解产物,发酵过程中至少有一种微生物当其在含1%(w/v)小麦谷蛋白的基本培养基中生长时,提供超过每毫升50mU的脯氨酰二肽基肽酶活性。
文档编号C12N1/19GK1261917SQ98806905
公开日2000年8月2日 申请日期1998年5月6日 优先权日1997年7月5日
发明者M·莫诺特, A·杜马斯, M·阿弗尔塔, P·范登布鲁克 申请人:雀巢制品公司