与二肽基肽酶有关的疾病状态的诊断和预后的制作方法

专利名称：：与二肽基肽酶有关的疾病状态的诊断和预后的制作方法
技术领域：
：本发明一般地涉及疾病或病症的诊断和预后。
背景技术：
：当前评价疾病风险或诊断疾病的方法通常依赖于耗费时间的诊断、排除法或通过侵入性手术或活组织检查。甚至在获得确定的诊断后，预后也一般是基于主观因素。在某些疾病例如代谢性疾病中，通过客观诊断进行的方法通常是麻烦的，耗费时间并且昂责。例如，诊断2型糖尿病的主要方法是空腹血糖测试，评价血浆中的血糖水平。该测试需要患者禁食8-14小时，通常需要数小时到数天的多个血液图。此外，尽管空腹血糖测试可以用于诊断2型糖尿病的存在，但是该测试在提供疾病预后的能力方面非常有限。9在医学领域，一直在探索侵入性较小、身体费力较小和更准确的方法来诊断和治疗疾病或病症。由于展开更深入了解这些生物学过程和与这些过程有关的生物化学，已经产生了一些理论，关于哪些成分可能鉴定为某些疾病或病症的标志或指示。蛋白酶和肽酶作为一类物质，人们已经研究了它们在诊断中的应用，并将其作为治疗患者的靶点。在一般
背景技术：
中，通常根据很多标准例如作用的位点、底物选择和机制将蛋白酶/肽酶分类。例如，氨基肽酶优先作用于多肽的N-末端残基，羧肽酶优先作用于C-末端，内肽酶作用于这两个末端之间的位点。二肽基肽酶(DPPs)是从它们的特异性底物中特异性地分裂二肽单元，即两个氨基酸单元的肽酶。有很多不同的DPPs，底物选择通常是用紧挨切割位点的N-末端的氨基酸残基来表达的。例如，DPP-I(IUBMB酶命名法EC.3.4.14.1)是一种溶酶体的半胱氨酸-型肽酶，释放N-末端二肽，Xaa-Yaa-i-Zaa-，除了当Xaa是Arg或Lys,或Yaa或Zaa是Pro时。DPP-II(IUBMB酶命名法EC.3.4.14,2)是一种溶酶体的丝氨酸-型肽酶，释放N-末端二肽Xaa-Yaa-l-，优选地当Yaa是Ala或Pro时。DPP-III(IUBMB酶命名法EC.3.4.14.4)是一种细胞溶质性肽酶，它对于肽具有广泛活性，尽管在pH9.2下它对于Arg-Arg-Z具有高度选择性，其中Z是任意的氨基酸。DPP-IV(IUBMB酶命名法EC.3.4.14.4)是一种膜结合的丝氨酸-型肽酶，从Xaa-Yaa-1-Zaa-中释放N-末端二肽，优选地当Yaa是Pro时，条件是Zaa不是Pro也不是羟基脯氨酸。DPPs涉及范围广泛的生理学重要的活性，与神经系统、内分泌系统、免疫系统和消化系统的调节有关。已经以很多的细胞内和细胞外功能例如蛋白质降解和酶活化证明了DPP活性。至于上述的特定DPPs，已经广泛研究了DPP-IV，以及它们伴随的亚型以及同工酶或结构同系物，以及显示DPP-IV-样活性的那些蛋白质。显示DPP-IV-样活性的蛋白质称作二肽基肽酶IV活性和10/或结构同系物，或"DASH"。DPP-IV是一种II型膜蛋白，有很多名字，包括但不限于，DPP4、DP4、DAP-IV、FAP^腺苷脱氨酶络合蛋白2、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、二肽基氨基肽酶IV;Xaa-Pro-二肽基-氨基肽酶；Gly-Pro萘酰胺酶；后脯氨酸二肽基氨基肽酶IV;淋巴细胞抗原CD26;糖蛋白GP110;二肽基肽酶IV;甘氨酰脯氨酸氨基肽酶；甘氨酰脯氨酸氨基肽酶；X-脯氨酰二肽基氨基肽酶；pepX;白细胞抗原CD26;甘氨酰脯氨酰二肽基氨基肽酶；二肽基-肽水解酶；甘氨酰脯氨酰氨基肽酶；二肽基氨基肽酶IV;DPPIV/CD26;氨基酰基-脯氨酰二肽基氨基肽酶；T细胞触发分子Tpl03;X-PDAP.(Burgess等人，U.S.专利7,169,926)。已经报道了4艮多的DASH蛋白，例如seprase、成纤维细胞活化蛋白oc、DPP6、DPP8、DPP9、attractin、N-乙酰化-ot-连接的-酸性二肽酶I、II和L，休眠细胞脯氨酸二肽酶、胸腺-特异性丝氨酸蛋白酶和DPPIV--P(Busek等人，Int.J.Biochem.CellBiol.36:408-421(2004))。DPP-IV组成性地在很多不同组织包括肠、肝、肺、肾和胎盘的上皮和内皮细胞上表达(Hartel等人，Histochemistry89(2):151-161(1988);Yaron和Naider，CriticalRev.Biochem.Mol.Biol.28(1):31-81(1993))。DPP-IV在循环的T-淋巴细胞上表达，并已显示它与细胞表面抗原CD-26是同义的(Sedo等人，ArthritisRes.Ther.7:253-269(2005))。除了膜-结合形式，DPP-IV也以可溶形式存在，可以在体液例如血浆和关节液中发现DPP-IV活性(Sedo等人，ArthritisRes.Ther.7:253-269(2005);Gorrell，ClinicalSci.108:277-292(2005))。据信，DPP-IV在神经肽代谢、T细胞活化、细胞粘附、肾和肠中包含脯氨酸的肽的消化、HIV感染和细胞凋亡，和某些黑色素瘤细胞中致肿瘤性的调节中发挥重要作用(Mattem等人，Scand.J.Immunol.33:737(1991);Pethiyagoda等人，Clin.Exp.Metastasis18(5):391-400(2000))DPP-IV的天然底物包括数种趋化因子、细胞因子、神经肽、循环性激素和生物活性肽(Lambeir等人，J.Biol.Chem.276(32):29839-29845(2001))。人们已经提出了在肽激素的代谢和在氨基酸运输中DPP-IV的关键调节作用(Hildebrandt等人，Clin.Sci.(Lond.)99(2):93-104(2000))。在促有丝分裂或抗原刺激下T细胞中DPP-IV表达增加，表明了其在免疫系统中的作用(Mattem等人，Scand.J.Immunol.33:737(1991))。T-淋巴细胞的其他各种功能例如产生细胞因子、IL-2介导的细胞增殖和B-细胞辅助细胞活性也已经显示出依赖DPP-IV活性(Schon等人，Scand.J.Immunol.29:127(1989))。此外，在T-细胞活化和增殖期间，DPP-IV似乎具有共刺激功能(vonBonin等人，Immunol.Rev.161:43-53(1998))。DPP-IV也涉及其他的生物学过程，包括用于细胞外酶腺苷脱氨酶(ADA)定位的膜-锚定功能(Franco等人，Immunol.Rev.161:27-42(1998))以及通过与胶原和纤连蛋白结合参与到细胞基质粘附(Loster等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.217(1):3"-348(1995))。据信，DPP-IV还在内分泌调节和代谢生理学中发挥作用。例如，DPP-IV分裂了胰高血糖素样肽-1(GLP-I)的氨基-末端His-Ala二肽，产生了GLP-I受体拮抗剂，因此，缩短了对GLP-1的生理学应答。DPP-IV也涉及葡萄糖代谢的控制，因为它的底物包括促胰岛素激素GLP-I和抑胃肽(GIP),通过除去它们的两个N-末端氨基酸将其灭活(Mannucci等人，Diabetologia48:1168-1172(2005))。除了正常的生理学功能外，已经研究了DPPs对于疾病状态，包括癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病、代谢性疾病和传染性疾病的作用。例如，有人已经提出，DPP-IV是肺-转移型乳腺和前列腺癌细胞的粘附分子(Johnson等人，J.Cell.Biol.121:1423(1993))。在良性前列腺肥大的患者的组织匀浆和前列腺体中已经发现了较高的DPP-IV活性(Vanhoof等人，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.30:333(1992))。在自身免疫性疾病例如牛皮裤、类风湿性关节炎(RA)和扁平苔藓的患者的人皮肤成纤维细胞中已经发现了高水平的DPP-IV表达(Raynaud等人，J.Cell.Physiol.152:378(1992))。DPP-IV与很多的代谢性疾病例如肥胖和食欲调节有关。例如，被更广泛地研究的与DPP-IV有关的代谢性疾病之一是2型糖尿病。Mannucci等人定义和描述了糖尿病中'漫性高血糖和DDP-IV的关系。这种研究确定了，在II型糖尿病中循环的DPP-IV活性与高血糖的程度直接相关。其他研究讨论了DPP-IV和涉及调节血糖水平的激素级联的各种激素之间的关系。这些研究表明，DPP-IV降解了对于胰岛素分泌非常重要的激素。特别地，已经有人提出，DPP-IV降解了胰高血糖素样1肽(GLP-I)，其会导致胰岛素分泌降低，因此提高了血糖。根据这种现象，可以发展DPP-IV的抑制剂来治疗II型糖尿病(Green等人，Diab.Vase.Dis.Res.3(3):159-165(2006))。显然，DPP-IV对于CD4+T-细胞中HIV-I和HIV-2病毒的渗透和感染性是重要的(Wakselman等人，J.Dermatol.Sci.22:152-160(2000))。因此，一些人提示，抑制DPP-IV也可以抑制这种机制。近来，DPP研究的一些途径已经聚焦于将改变DPP水平作为一种手段来发展处理和治疗与DPP有关的疾病状态和病症。但是，迄今为止这项工作几乎没有产生任何处理和治疗方法。发明简述仍然探索了基于DPP及其对生物学过程作用的治疗和诊断工具的发展。本文所述的本发明的一个实施方案涉及一种与DPP有关的疾病状态或病症的预后或诊断方法。具体地，测定特异性的DPP的可区分部分的一种或多种参数，该测定值与疾病状态或病症的存在、不存在或严重度有关。本文所述的本发明的另一个实施方案涉及一种与DPP有关的疾病状态或病症的预后或诊断方法。具体地，测定DPP亚型的可区分部分的一种或多种参数，该测定值与疾病状态或病症的存在、不存在或严重度有关。所述发明的另一个实施方案涉及一种II型糖尿病的诊断或预后方法。具体地，测定患者样品中DPP-IV亚型的一个或多个可区分部分的至少一种参数，该测定值与II型糖尿病的存在、不存在或严重度有关。附图简述附图1描述了各亚型的自由流动电泳分离的工作流程。附图2A和B的图，显示了在天然IEF-FFE后猪的DPP-IV的活性试验的结果。附图2B显示了可区分的猪的DPP-IV亚型的特异活性(U/ng酶)。附图3是从猪的DPP-IV的天然FFE(pH3-10)分离的第27到47部分的银-染色的丙烯酰胺凝胶。附图4A和B显示的是从IEF凝胶分离的受胰蛋白酶作用的蛋白带的肽质量指紋图镨，大多是酸性的(4A)亚型，稍多是碱性(4B)亚型。PMF测定鉴定了所有的亚型都是DPP-IV。附图5A和B显示的是用MALDITOF/TOF确认的所选择的DPP-IV峰。附图6A和B显示的是来自两个健康受试者的人的血浆中FFE可区分的DPP-IV亚型的DPP-IV活性。附图7显示的是来自正常人受试者的FFE可区分的亚型的DPP-IV活性特性。附图8显示的是来自葡萄糖水平为538mg/dL的糖尿病人受试者的FFE可区分的亚型的DPP-IV活性特性。附图9显示的是由健康人受试者的FFE可区分的亚型去唾液酸化导致的DPP-IV特性移动的例子。活性用RFU/分钟表示。黑柱代表处理过的样品；线紋柱代表未处理的样品。附图IO显示的是来自健康(空柱)和糖尿病(黑柱)患者的血浆的pi可区分的DPP-亚型，以及糖尿病患者(黑线)的去唾液酸化亚型之间DPP-IV活性的比较。虛线代表每个部分都可区分时的pH。附图11是pHvs.健康和糖尿病患者的pi可区分的DPP-亚型的DPP-IV活性的点状图。S04、Sll、S07和S02是健康者的，剩余的是糖尿病患者的。附图12是pH的图，在该pH下，每个受试者的pl可区分的DPP-IV亚型达到了90%的DPP-IV活性。S04、Sll、S07和S02是健康者的，剩余的是糖尿病患者的。附图13是pH的图，在该pH下，每个受试者的pl可区分的DPP-IV亚型达到了60%的DPP-IV活性。S04、Sll、S07和S02是健康者的，剩余的是糖尿病患者的。附图14的图，描述了可以将可区分的DPP亚型的测定参数与疾病之间关联的各种方法。实施本发明的最佳方式本文所述的方法为与二肽基肽酶(DPP)-有关的疾病状态或病症提供了风险评估、诊断或预后。特别地，所述方法涉及与特定DPP参数有关的疾病状态或病症的风险评估、诊断或预后的方法。根据所述方法的实施方案，测定可区分的DPP部分的参数。然后将测定值与所述疾病状态或病症的存在、不存在或严重度关联。为达到本申请的目的，术语"蛋白酶"和"肽酶"可互换地使用，指催化肽酰胺键水解的酶。二肽基肽酶(DPPs)是从多肽中分裂出二肽的蛋白酶。本文使用的术语"特异性的DPP的可区分部分"涉及患者样品中以某种方式已经互相区别、分离或隔离的特定DPP(例如，特定DPP族中的一种或多种亚型，例如DPP-I、DPP-II、DPP-III、DPP-IV等等)。在一个实施方案中，使特异性的DPP经受某种将特定DPP的至少一种亚型与DPP的至少一种其他亚型区别开的条件。每个可区分部分可以包含该特定DPP的一种或多种DPP亚型，一些部分可以不包含DPP亚型。在另一个实施方案中，使DPP(可以包含一族或一族以上的DPP)经受某种将DPP的至少一种亚型与该DPP的至少一种其他亚型区别开的条件。特别地，DPP亚型个体可以完全或仅部分区分成各部分并彼此区分。因此，一个可区分部分可包含一种或多种亚型，或者每个可区分部分可以仅包含一种亚型。同样地，一个可区分部分可以包含一种亚型，而其他可区分部分包含一种以上的亚型。此外，一些可区分部分可以不包含DPP亚型，只要一个或多个其他部分包含一种或多种DPP亚型。该特异性的DPP可以是任何特异性的DPP或DASH族的一员，包括DPP-I、DPP-II、DPP-III或DPP-IV。在一个示例性的实施方案中，DPP是DPP-IV。不特别指定的DPP包括非特异性和特异性的DPP。本文使用的术语DPP的"亚型"是指某些物理方面不同，但是都具有共同的特征性催化活性、同源的一级结构/氨基酸序列或都来源于相同的基因位点的一种或多种DPP酶的多种形式中的任何一种。DPP亚型的催化活性不需要是在催化的程度或速率方面相同，仅仅具有共同的底物特性。同样地，亚型的一级结构不需要相同，但是可以是酶的氨基酸序列的较小加成、删除或突变的结果。亚型可以具有类似或相同的一级结构，可以具有相同的催化活性或不同的催化活性。所述亚型的一级结构可以显著不同，同时保留相同的催化活性。亚型可以具有相同或不同的二级结构、三级结构和/或四级结构，但仍是彼此的亚型，只要它们保留相同或类似的一级机构和/或酶活性和/或来源于相同的基因位点。亚型可以来源于相同的基因位点，或来源于不同的基因位16点。它们可以是不同等位基因；多个基因位点；由相同的基因产生的信使RM的交替剪接的结果，或者是翻译后修饰例如加入多糖、磷酸酯、巯基、唾液酸或其他基团的结果。当在本文中使用时，"亚型"也包括同工酶。本文使用的术语"同工酶，，(可替代地，同功酶)是亚型的一个类型，是指起源于一级结构/氨基酸序列的基因确定差异的酶的多种形式中的任意一种。具有相同的催化活性、基因位点或一级结构的任意类型的酶互为亚型。已知多种DPP亚型。例如，DPP-1由相同基因(EntrezGeneGeneID:1075)编码的转录变异而存在至少两种亚型。同样，已经^l道了DPP-II(DiCarlantonio等人，GameteRes.15(2):161175(2005))、DPP-III(Mazzocco等人，FEBSJournal273(5):10561064(2006))和DPP-IV(Schmauser等人，Glycobiol.9(12):12951305(1999))的多种亚型。例如，断裂后-脯氨酸二肽键的任意的酶都是一种DPP-IV亚型。本领域技术人员很容易即可知道DPP的很多亚型。不是所有亚型都已经在此鉴定出来了。仅用于说明但非限制性地，DPP-IV亚型包括但不限于DPP-IV;DPP-IV的各种唾液酸化形式；膜结合型DPP-IV;可溶性DPP-IV;和任何的二肽基肽酶IV活性和/或结构同系物(DASH)，例如seprase、成纤维细胞活化蛋白ct、DPP6、DPP8、DPP9、attractin、N-乙酰化-a-连接的-酸性二肽酶I、II和L，休眠细胞脯氨酸二肽酶、胸腺-特异性丝氨酸蛋白酶和DPPIV-3。可以测定的DPP参数包括量、浓度、活性、表达或者翻译后修饰的量或类型。DPP的"量"包括DPP的存在、不存在或量。DPP的"活性"包括酶活性包括特异性活性的存在、不存在、量、程度或速率。DPP的"表达"包括DPP表达的存在、不存在、速率或量。DPP的"浓度"为在一个部分中存在的每个单位体积的DPP亚型的量。可以直接或间接测定DPP参数，可以是定性或定量的。可以用可以定性或定量测定DPP活性的任何测定方法来测定DPP活性。适合测定DPP活性的测定方法包括检测DPP水解产物的存在或量对可检测的标记底物的活性的测定。标记物可以是可直接或间接检测的，可以是荧光的、化学发光的、色度的或放射性的。荧光标记物包括7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)和7-氨基_4-三氟甲基香豆素(AFC)。本领域技术人员将会理解，信号的检测模式将取决于测定中使用的精确检测系统。检测系统可以检测质量的改变，氨基酸序列或肽长度的改变、产色改变或荧光改变。在本领域所述的范围广泛的检测方案中，该检测方法可以使用次级检测方案，包括产生可检测改变的次级酶反应。例如，如果使用放射标记的检测试剂，可以使用某种技术测定该信号，其中该技术能够定量生物样品中的信号或将生物样品中的信号与参照样品中的信号相比较，例如是闪烁计数、放射自显影(典型地与扫描光密度测定法组合)等等。如果使用化学发光检测系统，那么典型地使用光度计检测信号。如果使用荧光检测系统，可以用荧光分度计测定荧光。由检测系统检测信号的方法是本领域公知的。在一些实施方案中，DPP活性是通过检测DPP对于可检测标记底物作用而产生的水解产物的存在或量的测定来测定的。可以用检测任何可检测的标记底物的水解的测定来测定DPP-IV活性，其是由DPP-IV,即X-Y-R催化的，其中X是任意的氨基酸；Y是Pro(脯氨酸)、Ala(丙氨酸)或Arg(精氨酸)；和R是任何直接或间接可检测的标记物。可以用定性或定量测定一种或多种DPP亚型的量的测定方法来测定DPP的量。适合测定DPP的量的测定方法包括但不限于，蛋白印迹分析、蛋白质分光光度法、放射性免疫测定、竟争性结合测定和ELISA测定。在该方面，对于一种或多种DPP亚型具有特异性的抗体是特别有用的。可以用定性或定量测定一种或多种DPP亚型浓度的任何测定方法来测定DPP的浓度。适合测定DPP浓度的测定方法包括蛋白18印迹分析、蛋白质分光光度法、放射性免疫测定、竟争性结合测定和ELISA测定。在该方面，对于一种或多种DPP亚型具有特异性的抗体是特别有用的。可以用定性或定量测定一种或多种DPP亚型表达的任何测定方法来测定DPP表达。适合测定DPP的表达的测定方法，一般检测DPPmRNA或蛋白质，并包括RNA转移分析和蛋白质印迹分析或其变形(例如，FarWestern分析、微阵列芯片)。可以用定性或定量测定一种或多种DPP亚型^^饰的任何测定方法来测定翻译后修饰的类型或程度。适合测定翻译后修饰的类型或程度的测定方法包括凝集素结合、蛋白印迹分析、蛋白质分光光度法、放射性免疫测定、竟争性结合测定和ELISA测定。可以测定一种或一种以上的参数。例如，可以测定单个参数(例如，量、浓度、活性、表达、翻译后修饰的量或类型)。可替代地，可以测定两种或更多种参数，例如量和浓度，量和活性，量和表达，浓度和活性，浓度和表达，或者可以测定活性和表达。同样，可以测定量、活性和表达；量、浓度和表达；或浓度，活性和表达。如果取两个或更多个测定值，可以同时或连续测定它们。例如，可以同时测定量和活性。可替4戈地，可以在测定活性前或后测定量。如果取三个或更多个测定值，可以同时或连续测定它们。例如，可以在测定翻译后修饰的类型和活性前测定量，其中同时测定翻译后修饰的类型和活性，或者彼此同时或连续测定量、翻译后修饰的类型和活性。同样，如果取更多个测定值，可以彼此同时或连续测定它们，或者以各种可能的方法分组测定，以使得相对于每个其他组，同时或连续测定各个组。换句话说，可以以因素或分配方式将每个测定值分组，可以相对于所有的其他组同时或连续测定每个组。除了多个测定值，不管一种还是多种参数，可以不止一次，即重复地采用任何所给予的患者样品的任何给定的测定值。此外，可以采用各部分的测定值的任意组合。例如，可以测定一个、一些或所有部分的一种参数。同样，可以测定一个、一些或所有部分的一种以上的参数。可以测定一个或一些部分的一种参数，而测定其他或所有部分的另一种参数。例如，可以仅测定一个部分的量，同时可以测定所有部分的活性。例如，可以仅测定一个部分的活性，同时可以测定所有部分的量。当测定一种或多种DPP参数时，可以将患者样品分成很多的等分部分，各个部分用于测定不同的DPP参数或进行重复的测定。另外地或可替代地，每个可区分的DPP部分可以分为很多的等分部分，用于测定不同的DPP参数或重复测定。重复测定对于本发明的方法并不是必要的，但是本发明的很多实施方案都使用了重复试验，特别是重复两次和重复三次的试验。可替代地，可以使用能够在单个测定中测定不同DPP参数的个体水平的测定方法测试患者样品或其等分部分以在单个反应中确定多种DPP参数的水平，其中单个测定是例如排列型测定或使用多种检测技术的测定(例如，使用用不同荧光染色标记物标记的检测试剂的测定)。本文使用的术语"与DPP有关的疾病或病症"涉及那些特征在于一种或多种特定的可测定的DPP参数不同的疾病或病症。与DPP有关的疾病或病症并不必然是由DPP的改变导致的，但是可以通过测定一种或多种DPP参数来诊断或监测。与DPP有关的疾病状态和病症包括，但不限于代谢性疾病、自身免疫性疾病、癌症和病毒感染。本文使用的术语代谢性疾病是代谢障碍，包括后天和遗传性疾病。在Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine中描述了很多这样的疾病。一般地，代谢性疾病分为三个主要的类型糖原积累病(即，影响糖代谢的那些疾病，例如II型糖尿病)，脂肪酸氧化性疾病(即，影响脂肪组分代谢的那些疾病，例如法布里病)和线粒体性疾病(即，影响线粒体的那些疾病，例如Leigh综合征)。可以用本发明检测的代谢性疾病状态包括但不限于II型糖尿病、低血糖症、高血糖症、格雷夫斯病、柯兴综合征、尿黑酸尿症、白化病、组氨酸血症、高鸟氨酸血症、威尔逊病、泰-萨克斯病、尼曼-皮克病、克腊比病、佩吉特病、枫糖尿症或苯丙酮尿症。在一个示例性的实施方案中，DPP是DPP-IV，该疾病是II型糖尿病。可以用本发明检测的自身免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、扁平莒藓、牛皮癣、葡萄膜炎、溶血性贫血、风湿热、克罗恩病、格-巴二氏综合征、牛皮癣、甲状腺炎、格雷夫斯病、重症肌无力、肾小球肾炎、自身免疫性肝炎或全身性红斑狼疮。在某些实施方案中，自身免疫性疾病是牛皮癣、类风湿性关节炎或扁平苔藓，DPP是DPP-IV。可以用本发明检测的癌症包括但不限于原发和转移性实体瘤和下列部位的癌症乳腺；结肠；直肠；肺；口咽；喉咽；食管；胃；胰脏；肝；胆嚢；胆管；小肠；尿道包括肾、膀胱和尿路上皮；女性生殖道包括宫颈、子宫、卵巢，绒毛膜癌和妊娠性滋养层细胞病；男性生殖道包括前列腺、精嚢、睾丸和生殖细胞瘤；内分泌腺包括曱状腺、肾上腺和脑垂体；皮肤包括血管瘤、黑素瘤、起源于骨或软组织的肉瘤以及卡波西肉瘤；脑、神经、眼和脑膜的肿瘤包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、恶性胶质瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经梢瘤和脑膜瘤；起源于造血恶性病例如白血病的实体瘤，包括绿色瘤、浆细胞瘤、革样霉菌病的斑块肿瘤以及表皮T细胞淋巴瘤/白血病；淋巴瘤包括Hodgkin,s和非一Hodgkin,s。可以用本发明检测的病毒感染包括但不限于由对于人和其他动物是致病性的病毒类导致的感染，例如腺病毒科、双核糖核酸病毒科、布尼亚病毒科、日冕型病毒科、黄病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、乳多空病毒科、微小病毒科、微小核糖核酸病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科(例如，HIV)、弹状病毒科或披膜病毒科。在某些实施方案中，DPP是DPP-IV，病毒性疾病是HIV。本文使用的术语"患者"是指任何需要进行与DPP有关的疾病状态或病症的诊断、预后、疾病进程监测或风险评估的活体，其中患者具有与DPP表达有关的生理学。这些患者包括但不限于，人、21高级灵长类动物、其他哺乳动物(例如，家养哺乳动物例如，猫、狗和马，啮齿类动物例如大鼠和小鼠，以及野生动物例如狮子、老虎和熊)、鸟类(例如，鸡、鹦鹉)及其他动物。本文使用的术语"患者样品"或"生物样品"是指从可以期望包含目标酶的患者中取用或来自所述患者的任何样品，包括细胞和无细胞样品。患者样品包括但不限于组织，例如肌肉、肝、肺、脾脏、脂肪、乳房和肿瘤组织；血液和血液制品，例如全血、血浆、血清和血细胞；以及其他生物液，例如尿、唾液、泪、粘液、羊水、脑脊液、关节液和精液。患者样品也可以包含液体和/或组织的组合。样品可以是通过任何临床可接受的方法例如静脉穿刺、腰推穿刺、羊膜穿刺和组织活检从患者中获得的。尽管可以直接使用从患者获得的样品，但是本发明的一个方面关注的是在区分DPP为各部分(例如，将可区分的DPP亚型区分成各个部分)或测定DPP参数前处理样品。处理方法包括但不限于，匀化、稀释、浓缩、声处理、冷冻、与防腐剂或其它试剂混合，或其组合。此外，可以处理包含其中期望DPP是膜结合的细胞或其他组织的样品，以从细胞膜中释放DPP，这样就允许将其用于本领域认可的用于从样品中分离/隔离蛋白质/酶的任何方法。释放膜结合的蛋白质的方法是本领域公知的，包括冷冻/融化、匀化、声处理以及从膜中进行活性酶的化学或酶性释放。在一些例子中，将患者样品收集在容器中，该容器包含EDTA、蛋白酶抑制剂或者一些其他适合运输、防腐和处理生物样品的组分。当患者样品由液体构成时，处理可以包括排除有核和/或无核细胞例如血样中的红细胞、白细胞和血小板(例如为了获得血浆)的方式，或者也可以包括排除某些蛋白质例如从血中排除某些凝固级联蛋白(例如，为了获得血清)。例如，可以将血收集在含有肝素、柠檬酸盐或蛋白酶抑制剂的容器中，或者在收集后与肝素、柠檬酸盐或蛋白酶抑制剂接触。其他处理可以包括浓缩或稀释样品，以，例如在区分或测定前将总蛋白质含量标准化。进行这些操作的方案是本领域公知的。在将所测定的DPP参数与疾病状态或病症进行关联后，可以将结果传达给操作者。结果包括疾病状态或病症的存在、不存在或严重度。"操作者"可以是医生、护士、医生助手、医疗技师、实验室技术人员、或操作进行本发明的一个或多个步骤的机器或装置的任何人，或接受诊断或预后信息的任何人，包括患者。例如，诊断或预后信息可以通过传真、电话、文件传递或电子邮件自动传达给患者或患者的代表。可以通过电话、文件传递、电子邮件或传真使用传递结果的任何方法，包括但不限于，在介质例如电子屏、数码屏或可印刷底物中显示疾病状态；产生可听的信号例如蜂鸣声、铃声、电产生的声音或记录的声音。可以在测定任何DPP参数前或同时部分或完全将DPP亚型区分成各DPP部分。例如，假设在样品中存在两种以上类型的DPP亚型，可以将该亚型仅区分成两个部分，一个部分包含一种以上类型的亚型(即，部分区分)；或可以将亚型区分成其中每个部分仅包含一种类型的亚型(即完全区分)的部分。同样，可以将亚型部分区分为两个或更多个部分，一个部分仅包含一种类型的亚型，另外的部分包含一种以上类型的亚型。可以通过任何方法包括物理分离或隔离或者其他鉴定或区别各个亚型的方法来区分DPP部分。例如，区分可以基于生化性质和动力学性质的差异，其中生化性质是例如电移动性或等电点(pi);热稳定性；分子量；氨基酸序列，在一级结构不同的亚型的情况中；抗体亲和力或亲和性；翻译后修饰的程度或类型；动力学性质是例如Kn或速率常数。可以使用对于不同DPP亚型具有特异性的抗体或凝集素来物理分离各DPP部分，或不经物理分离而区别各部分。例如，可以将对于不同DPP亚型具有特异性的抗体载有不同的可检测标记物，无需物理分离即可区分各部分。可替代地，可以将抗体在栽体或柱使用，以将不同的DPP亚型物理分离成各个部分。分离方法包括等电聚焦，其基于PI分离；电泳法，在基质例如凝胶或过滤器或无凝胶，可以基于电荷和/或分子量区别；对亚型具有亲和力的凝集素结合的程度或凝集素的种类；抗体结合；以及亲和或大小区别色谱法。本文使用的术语"等电点"(PI)是分子不栽有净电荷时的pH。PI也称作等电点pH。因此，根据本申请的目的，术语"PI"和"等电点pH"可以互换使用。在一个示例性的实施方案中，该DPP部分是基于PI区分的，该特异性的DPP是DPP-IV。等电聚焦的方法包括自由流动电泳、等电聚焦电泳或色镨聚焦或其他固相介导的，由随通过固相的时间而pH改变的緩冲系统的流动而推进的分离。在等电聚焦电泳中，将感兴趣的样品注射或直接用于凝胶平板、过滤器或其他包含固定的pH梯度的其他介质中。pH梯度平行于电场的方向延伸，通过向一个方向的移动将样品中的蛋白质彼此分开，在达到等于其PI的pH环境以前使其通过不同的pH环境。当蛋白质已经达到其PI时，它将会固定在基质物内。在这时，可以从基质物中获得样品，并用于进一步的测定，例如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(Zuo等人，AnalyticalBiochem.284:266-278(2000))，在平面片上进行的次级大小分离(Becker等人，J.Micromech.Microeng.8:2428(1998))，检测酶活性的测定例如焚光比色法，或适合测定任意DPP参数的测定。自由流动电泳是一种不使用传统电泳的固体基质例如丙烯酰胺凝胶，或在色镨中使用的分离相的电泳法。作为代替，根据电荷和/或在连续层流中的电泳迁移率或在垂直于流动方向使用电场中的緩冲溶液来分离分析物。24进行自由流动电泳的机器的一个例子是BD自由流动电泳系统(BectonDickensonmodel#441117)。使用该系统时，将可区分的样品收集在分离槽末端的96毛细管中，这允许进行连续分段分离以流入到收集分开中，其中流出物保持物理分离成多个部分。该方法适合通过至少三种分离原理来分离样品等电聚焦(IEF)、分段电泳(ZE)和等速电泳(ITP)。当收集后，各部分可以通过在等电聚焦后使用的所述的任何测定，即SDS-PAGE、在平面片上的次级大小分离和酶活性测定来进一步测定。区分和测定并不限于任何特定的顺序。可以在参数测定前或后进行区分，或者与测定同时进行。例如，可以用方法例如电泳将特异性的DPP物理分离成各部分，然后可以测定一些或所有部分的一种或多种参数。可替代地，当同时进行测定和区分时，可以通过下列方法将特异性的DPP区分成各部分，例如将患者样品与对不同DPP亚型具有特异性的抗体接触，将每个抗体与不同的可检测标记物连接，可以测定可检测标记物的信号。在另一个实施方案中，可以用双重检测系统来区分各部分或亚型。例如，可以将DPP亚型和与固相结合的抗体接触，其中抗体与所有或大部分DPP亚型和对于较小部分的DPP亚型具有特异性的一种或多种抗体或凝集素结合。每个更特异性的抗体或凝集素都包含一种独特的可检测的标记物。该亚型可以与抗体或抗体和凝集素同时接触，或者以任意顺序接触，例如，与结合抗体接触，然后与更特异性的抗体/凝集素接触，或者先与更特异性的抗体/凝集素接触，然后与结合抗体接触。DPP可以区分为两个或更多个部分。部分的数目取决于所期望的区分程度和所使用的区分方法。对于DPP可以区分的部分的数目并没有限制，但是例如，DPP可以区分成2或更多个部分，例如2，3,4，5，6，7，8，9，10，11，12，18,24，36，48，96,100，200，300，384,400，500或1536个部分。例如，在一些实施方案中，方便地将DPP亚型区分为例如96个部分，以在标准的96孔板中进行处理和参数测定。为了完全区分亚型，每个DPP部分应当不包含一种以上的DPP亚型，一些部分可以不包含DPP亚型。为了部分区分亚型，至少一个DPP部分应当包含一种以上的DPP亚型，而其他部分可以不包含DPP亚型、一种DPP亚型，或一种以上的DPP亚型。在本发明的某些实施方案中，可以在一个以上的时间点从个体获得患者样品。这种"系列"取样非常适合在典型的医学异常情况发生前确定疾病的早期发作，因此促进了早期的补救性治疗策略，产生了更有效的疾病管理或者甚至避免了疾病。这种系列取样也非常适合本发明涉及监测患者的疾病例如II型糖尿病进程的方面。这尤其可以用于评价任何患者所经受的与疾病有关的治疗的有效性。系列取样或重复取样也可以用于确定发生该疾病或病症的个体风险。可以以任何期望的时间线例如每小时、半日、每日、每周、每月、每季度(即，每三个月)、每半年、每年、每两年或频率更小来进行系列取样。可以每次测定一个新样品来进行测定水平和对照水平之间的比较，或者可以保留与水平相关的数据以用于频率更小的测定。优选离体或在体外进行测定或区分。在一个实施方案中，离体进行测定和区分。本领域技术人员将会理解，本文所述的方法可以包括测定多种DPP或非-DPP参数(其可以是或可以不是与疾病有关的参数)中的任意一种来确定患者样品的完整性和/或性质。例如，雌激素水平(一般在女性中更高)可以测定作为性别标记，或者其他的化学血液测定项目例如胆固醇水平。可以测定其他与疾病有关的非-DPP参数，以证实诊断或预后。在一些实施方案中，该非-DPP参数是血红蛋白A1C水平，该疾病是糖尿病。血红蛋白A1C水平低于全部血红蛋白的7%表明没有患糖尿病；水平高于全部血红蛋白的7%表明存在糖尿病。可以在DPP参数前或后测定非-DPP参数，或者可以同时测定。为了将所测定的DPP参数与疾病状态或病症关联，可以将所测定的DPP参数与参考值，即标准值或内对照值对比。与参考值相比，DPP参数分别或累加地升高、降低或移动，不管是阳性或阴性，都可以与疾病状态相关联。可替代地，该可区分的酶的一个部分的DPP参数可以与可区分的酶的另一个部分的参数相比较，或者它可以与两个或更多个可区分部分的总测定值相比较。当然，所测定的参数应当与对应的参数相比较。例如，如果所测定的是DPP的量，那么该DPP的量的值应当与参照物或其他部分的DPP的量的值相比较。如果如果所测定的是DPP的表达，那么它应当与参照物或其他部分的DPP的表达相比较。在一些实施方案中，测定连续范围的各部分的参数。例如，对于基于等电点分离的亚型，可以测定在邻近pH或等电点分离的两个或更多个部分的一种或多种参数。可以获得连续范围的各部分内的所测定参数(群)的特性。可替代地，可以基于测定非连续范围的各部分来获得所测定参数(群)的特性。该特性可以基于所有部分，或者它可以基于各部分的子集。可以在4艮多部分两两间和多者之间<坎出的以确定与疾病状态的关联的各种比较是很多的。分析所测定的参数的数据或将该数据与其他数据比较的技术是本领域技术人员公知的。因此，所有这些技术都不会在本文中详细讨论。分析数据以引申出所期望的结论(即，疾病状态存在或不存在)的一种示例性的技术通过参考附图14中的图来进行说明。在附图14中，y轴代表DPP参数[例如，活性、表达、量、浓度、翻译后修饰的类型或量]。X轴代表区分的大小(例如，PI、pH或亚型类型)。关于该图，突出显示了三个区域，区域"a"、区域"b"和区域"c"。对于每个区域，可以测定一个范围内的总测定值(例如，一个给定范围的曲线下面积)，给出值"a"和"b"，总值"c"。可以测定的其他值包括范围内的峰值，在一个范围内达到峰值的点，在该范围内任意点(例如在特定PI或pH下)的特异性活性，所测定的参数提高或降低时的点(例如，拐点)，与其他测定值相比所测定的参数随x轴的改变，及其任意组合。可以根据通过测定连续范围的各部分获得的曲线去来计算该值，或者可以根据单个或多个部分的测定值来计算它们。为了将疾病状态与一个测定值相关联，我们可以比较范围"a"的值和范围"b"的值；范围"a"的值和范围"c"的值；范围"b"的值和范围"c"的值；范围"a"的值和内对照值或标准值；范围"b"的值和内对照值或标准值；和/或范围"c"的值和内对照值或标准值。可替代地，可以得到与区分的给定大小有关的任意范围或任意比例的定量测定值中的各个定量测定值，并与已知的参照值或这些测定值的范围相比较，通过临床试验确定的参照范围提供了确定疾病存在、不存在或严重度的标尺。定量测定也可以通过加入内或外标物，将其与可以用于将定量读数标准化以预先确立参照范围的区分大小(例如亚型区分)同时或按顺序进行。本文使用的术语"标准值"是指从一部分人群获得的一个值，一般是一个平均值、中位值或平均值。标准值可以是阳性标准值或阴性标准值，可以由年龄匹配的人群中获得。年龄匹配的人群(可以获得标准值)与受试个体年龄相当，但是年龄大概匹配的人群也是可接受的。年龄大概匹配的人群与受试个体的年龄的差别可以在1-20年内，包括约1,约5,约10，约15或约20年，或者可以是包括受试个体年龄的不同年龄的组。年龄大概匹配的人群可以提高2,3，4，5，6，7，8，9或10年(例如，用作62岁个体的标准值来源的"提高5年组"可以包括58-62岁的个体，59-63岁的个体，60-64岁的个体，61-65岁的个体或62-66岁的个体)。阳性标准值是从具有特定疾病状态的人群获得的某种值，例如平均值。阴性标准值是从不具有特定疾病状态的人群获得的某种值，例如平均值。本文使用的术语"内对照值"是指从其疾病状态已知的单个患者或一组患者的一个或多个样品获得的值。内对照值可以是阳性对照值、阴性对照值或相同患者的对照值。例如，内对照值可以是来自具有特定疾病状态的一个或多个患者的阳性对照值；或者它可以是来自具有特定疾病状态的一个或多个患者的阴性对照值。最后，内对照值可以是从诊断的患者，来源于不同身体位点(即，血vs.肝)的样品，在不同时间测定疾病进程而获得的，或者是在测定前从不同进程的两个或更多个样品获得的，或者是收集在相同类型或不同类型的分开的容器[例如，两个EDTA血浆管或一个EDTA血浆管和一个血清管]中的值。内对照值可以与要诊断的患者的测定值并发或同时获得，或者可以在其他某个时间获得。测定值之间或测定值和参照值之间的比较结果用于诊断或用于疾病的诊断或预后，根据疾病的严重度将患者分层，或者在特定患者中监测疾病的进程。因此，如果比较表明测定值和暗示/指示疾病的参照值之间有差异(即，升高或降低)，那么就有助于或可以做出适当的诊断。相反，如果所测定的水平与参照水平的比较不能出现提示或指示疾病诊断的差异，那么就不能有助于或做出适当的诊断。当测定一种以上的与疾病有关的DPP参数但各种测定值不能一致提示或指示疾病的诊断时，使用"多数的"提示或指示(例如，当该方法使用4种与疾病有关的DPP参数时，其中三种提示/指示疾病)。这样的结果可以认为是提示或指示个体疾病的诊断。可以以任何适合所讨论的与糖尿病有关的DPP参数的测可以用定量或定性测定技术来进行"测定"，根据所使用的测定技术，比较测定值和参照值的方式可以不同。例如，当使用定性分析来测定DPP活性水平时，可以通过视觉比较荧光反应产物的完整性，或通过比较分光光度计的数据(例如，比较来源于测定装置的数字数据或图形数据，例如直方图)来比较该水平。但是，期望的是，在本发明的方法29中使用的测定值最常见的是定量值(例如，浓度的定量测定值，例如每毫升样品的DPP亚型毫微克数，或绝对量)。在另外的例子中，测定值是定性的。当定量测定时，可以通过检查数字数据，以及通过检查数据的图(例如，检查图表例如直方图或线图)来进行比较。比较方法可以是手动的(例如，通过医生的视觉检查方法)，或者可以是自动的。例如，试验装置(例如测定化学发光信号的光度计)可以包括电路系统和能使其比较DPP参数的测定值和参照值的软件。可替代地，可以使用单独的装置(例如，数字计算机)来比较测定值和参照值。用于比较的自动装置可以包括储存所测定的与疾病相关的DPP参数的参照值，或者它们可以比较测定值和来源于同时测定参照样品而得到的参照值。在一些实施方案中，本发明的方法在所测定水平和参照水平之间使用"单一"和"二元"比较，例如，所测定水平和参照水平之间的比较确定了所测定水平是否高于还是低于参照水平。在一些实施方案中，值之间的任何差异都可以指示疾病。如本文所述，可以定量(绝对值)或定性(相对值)测定参数。用于给定评价的代表性的与疾病有关的DPP参数水平可以重叠或不重叠。如本文所述，对于一些实施方案，定性数据表示给定水平的疾病状态(轻度、中度或重度)，在另外的实施方案中，定量数据表示给定水平的疾病状态。在本发明的某些方面，进行比较以确定测定值和参照值之间的差异大小，例如比较测定值和参照值之间差异的"倍数"或百分比。比某些最小倍数差异低或高约2倍的倍数差异提示或指示，例如存在疾病。确定倍数差异，通过测定DPP的绝对量、浓度、活性或表达，并与参照物的绝对值相比较，或者测定倍数差异，通过确定参照值和样品值的相对差异，其中这两种值都不是绝对量、浓度、活性或表达的测定值，和/或这两种值是同时测定的。可替代地，可以在试验数据本身内来测定倍数差异，例如比较"a"和"c"的倍数差异，以及比较"b，，和"c"，或测定系统内可测定参数的任何其他比率。因此，提示或指示特定诊断的测定值和参照值之间的差异大小将取决于用于产生测定值和参照值的所测定的特定参数。如本文所述，将由通过pi分离的连续范围的DPP-IV亚型获得的DPP-IV活性特性和II型糖尿病的存在、不存在或严重度进行关联。该关联是用于II型糖尿病的诊断或预后方法，该方法包括测定患者样品中可区分的DPP-IV部分的一种或多种DPP-IV参数，并将所测定所述DPP-IV参数与患者中II型糖尿病的存在、不存在或严重度关联。在一些实施方案中，DPP-IV参数是DPP-IV活性。在一些实施方案中，DPP-IV部分是基于pi区分的。可以将DPP-IV参数与一组标准值或内对照值相比较。阴性组标准值或阴性内对照值的任意差异与糖尿病的存在或严重度有关。所测定DPP-IV参数和阴性参照值之间的差异程度越高，预后就越严重。同样，阳性组标准值或阳性内对照值的任意差异与糖尿病的不存在有关。如上述讨论，参数包括活性、量、表达或浓度。可以通过本文所述的任何特征或方法来区分各DPP-IV部分。在示例性的实施方案中，各DPP-IV部分是基于pi区分的。在一些实施方案中，通过自由流动电泳分离各DPP-IV部分。附图10显示的是一个健康者和一个糖尿病患者的血浆中pi可区分的各DPP-IV部分之间的DPP-IV活性特性的比较。本发明人已经表明，在糖尿病患者中，DPP-IV活性特性向较高pH移动。任意健康者在任一点或任何点的DPP-IV活性特性值的任意差异如所示，或者将在任一点或任何点群由内阴性对照物或组标准物获得的值的任何差异可以与糖尿病相关联。因此，DPP-IV活性特性由本文所示的任何阴性标准值或组阴性标准值向更高PH移动指示了糖尿病。同样，DPP-IV活性特性由内阴性对照值向更高pH移动指示了II型糖尿病。活性特性的移动越显著，疾病越严重。可以通过所讨论的pi范围内的最极端的亚型的测定值来表示与健康样品或组"相反"的极端测定值有关的阳性标准值。确定31此阳性标准值，可以通过例如，用化学或酶方法处理患者样品以完全除去所有的糖基化物，完全没有任何糖基化物代表与典型的健康样品所包含的亚型差距最大的可测定亚型条件。应当注意的是，该处理导致的极端亚型并不是实际上可能存在于实际的样品中，但是仍然可以出于提供用于测定的可测定对照值的目的而用于确定pH最大可能的范围。作为替代，该"极端"阳性亚型可以是外对照物，可以分开测定或在掺入到要分析的样品中后测定。在一些实施方案中，这样的阳性对照物也可以用于帮助将所得到的样品测定值标准化。活性的"移动"是指在一个或多个DPP-IV部分中DPP-IV活性的任何差异。例如，在一个可区分部分中DPP-IV活性的测定值可以与参照值不同，或者在一些或所有部分中它可以都不同。DPP-IV活性水平的趋势，例如在更高pH下活性更高，对于检测II型糖尿病是特别有用的。当基于pi来区分DPP-IV时，糖尿病患者和健康者也显示了DPP-IV活性特性的两个主峰。糖尿病患者在约pH4.4和约pH4.8处显示峰。这些峰中的每个都与pi可区分的亚型的总测定活性的约10%有关。健康患者在约pH3.9和约pH4.l处显示峰。"峰"是指所有测定值中少数局部极限值中的一个。每个值都与可区分部分相关。峰值可以与一个可区分部分或一组可区分部分相关。因此，该值可以是单个可区分部分的不连续的值或者是一个范围的可区分部分的不连续的值的总体。例如，该值作为可区分部分的函数的特性可以仅包含一个峰，或者它可以包含一个以上的峰。一般地，仅仅最高的第1,2，3,4或5个值可以认为是峰。任选地，例如，峰可以是优选多个邻近值的特征或附近的相关值，其中所述值从一个高点改变成某一下落数量值。因此，在或约pH3.9和/或在或约pH4.1下pi可区分的DDP-IV亚型的DPP-IV活性的最大峰与糖尿病的不存在相关。同样，在或约pH4.4和/或在或约pH4.8下pi可区分的DDP-IV亚型的DPP-IV活性的峰与糖尿病的存在相关。为连续范围32的DPP-IV的总测定活性的至少约10%的峰对于糖尿病的存在是特别有用的。在或约pH4，4和/或pH4.8下的峰越高，诊断越严重。附图11的图显示的健康者和糖尿病患者的pi可区分的亚型的累积DPP-IV活性特性。图中的每个点代表总活性的累积百分比，其是连续范围的可区分亚型的pH升高的函数。如前面所解释，可以通过分离成分散的可区分部分来区分DPP亚型，其中每个部分与特定窄范围的pH相关。附图12显示的是个体患者的pi可区分的DPP-IV部分的累积活性达到所测定范围的总活性的90%时的pH，概括了从酸性开始到所测定的pH范围的可区分的亚型部分的活性。在和约pH4.2以下，健康者的可区分亚型达到了90%DPP-IV活性。相反，在和约pH4.4以下，糖尿病患者的可区分亚型没有达到90。/。DPP-IV活性。患病者的累积DPP-IV活性没有达到总累积DPP-IV活性的90%,直至将可区分亚型置于甚至更高的pH下。因此，可以用样品中pi可区分的DPP-IV部分的累积活性达到样品总活性90%时的pH将DPP-IV活性-测定值与疾病相关联。因此，如果与在和约pH4.4以下的pH范围有关的等电点处在可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比不超过约90%,那么就检测到了糖尿病的存在。如果与在和约pH4.4以上的pH范围有关的等电点处在可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比是至少约10%，那么就检测到了糖尿病的存在。达到90%活性时pH比pH4.4更高，则表明预后更严重。如果与在和约pH4.2以下的pH范围有关的等电点处在可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比是至少约90%，那么就检测到不存在糖尿病。如果与在和约pH4.2以上的pH范围有关的等电点处在可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比不超过约10%，那么就检测到不存在糖尿病。附图13显示的是个体患者的pi可区分的DPP-IV部分的累积活性达到总活性的60°/。时的pH，概括了从酸性开始到所测定的pH范围的亚型的活性。在约pH3.9，健康者达到DPP-IV活性的60%。相反，糖尿病患者达不到DPP-IV活性的60%,直至约pH4.15及以上。患病者的累积DPP-IV活性没有达到总累积DPP-IV活性的60%，直至将可区分亚型置于甚至更高的pH。因此，可以用样品中pi可区分的DPP-IV部分的累积活性达到样品总活性60%时的pH将DPP-IV活性-测定值与疾病相关联。因此，如果与在和约pH4.15以下的pH范围有关的等电点处在可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比不超过约60%,那么就检测到了糖尿病的存在。如果与在和约pH4.15以上的pH范围有关的等电点处在可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比是至少约40%，那么就检测到了糖尿病的存在。达到60%活性时pH比pH4.15更高，则表明预后更严重。如果与在和约pH3.9以下的pH范围有关的等电点处在可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比是至少约60°/。，那么就检测到不存在糖尿病。如果与在和约pH3.9以上的pH范围有关的等电点处在可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比不超过约40%,那么就检测到不存在糖尿病。实施例1使用自由形式的电泳(FFE)(BDTM自由流动电泳系统)，基于电荷分离蛋白质，将DPP-IV的亚型分成各部分并表征。优选分离蛋白质亚型来检验特异性修饰对于活性的作用。活性测定表明特异性活性的提高与亚型pi的升高相关。这提示，翻译后修饰在DPP-IV活性的调节中发挥作用。FFE可以促进进一步的关于酶修饰和疾病状态关系的研究。如下使用BDTM自由流动电泳系统来进行FFE:将从Sigma获得的猪DPP-IV(1-100mg)在pH适当的分离介质中稀释(一般1:5)。然后将稀释后的蛋白质负载到BeetonFFE室的最大的负极进样口中，然后使用1200-1500V和20-25mA来分离，使用3-10的pH梯度，分离介质的流速是约60mL/小时。如下进行活性测定将45iu1的测定緩冲液(IOOmMTris-Cl[pH8.0];0.05%v/vDMSO)加入到5u1蛋白质样品中，从Tinitial测定荧光的增加。将活性表达为在30^C下由底物Gly-Pro-AMC(250juM)的水解导致的相对焚光单位(RFU)/分钟的增加。结果如附图2A和2B所示进行蛋白质的胰蛋白酶消化，包括在PAGE(IEF)或SDS-PAGE后将可见的SyproRuby染色带删除，随后根据试剂盒的介绍(Pierce/Sigma)来消化。如下进行基质-辅助激光解析/电离(MALDI)MS:提取"在凝胶中"消化的肽(如直接的)，并用ZipTip吸管端(Millipore)清洁。将消化的肽以1:1与基质(ot-氰基-4-羟基肉桂酸的60%乙腈的饱和溶液)混合，并在不锈钢耙(BrukerDaltonics)上喷点。开始时的基质-辅助激光解析/电离飞行时间(TOF)肽质量指紋分析(PMF)用于在TOF/TOF鉴定特异性肽(都使用Mascot)后鉴定消化的蛋白质。结果如附图4A和4B所示。实施例2在实施例2中描述的实验是按照与实施例l相同的方案进行的，除了蛋白质样品来源于健康者的人血浆。人血浆样品(EDTA抗凝血剂)来自两个个体，如实施例1所述将DPP-IV亚型分离成各个部分。如实施例1所述测定活性。检查DPP-IV活性的模式，以观察是否存在与猪的DPP-IV亚型类似的活性特性。结果存在于附图6A和6B中。根据附图6A和6B所报告的结果，可以观察到，人血浆中DPP-IV活性的延伸类似于在猪的DPP-IV中所见。在较高pH值(最大约pH5.2)下观察到了活性增强。需要进行精确的蛋白质(DPP-IV)定量来确定特异性活性。通过实施例1和2，证明了可以用FFE(IEF)来分离蛋白质亚型并能够对所分离的亚型进行生化表征。猪的DPP-IV模型显示了具有不同特异性活性的多种亚型(用MassSpec鉴定)。当在FFE后分析时，人DPP-IV(在血浆中分离)显示了类似的趋势。翻译后修饰(PTMs)可以在调节DPP-IV的特异性活性中发挥作用。FFE可以促进DPP-IV个体亚型以及其他蛋白质的潜在PTMs的鉴定和推断。如前所述测定DPP-IV。结果如附图6A和6B所示，当与猪的DPP-IV实验结果相比较时，该结果表明，当在FFE后如猪的DPP-IV测定类似地进行测定时，人DPP-IV显示了类似的活性趋势。总之，实施例1和2的结果表明，翻译后修饰(PTMs)可以在调节DPP-IV的特异性活性中发挥作用，FFE可以促进DPP-IV个体亚型以及其他蛋白质的潜在PTMs的鉴定和推断。实施例3在实施例3中描述的实验是按照与实施例l相同的方案进行的，除了蛋白质样品来源于人血浆，以及用3-7的pH梯度进行IEF。具体地，获得2种肝素化处理的人血浆样品，一种来源于2型糖尿病患者(血糖水平为538mg/dL)，一种来源于健康者。结果如附图7和8所示，表明糖尿病样品显示了具有更高等电范围的DPP-IV亚型特性。实施例4通过pi区分4名健康者和5名糖尿病患者的血浆。如下使用BectonTMFFE室进行FEE:将25jiL血浆(l:8稀释)与25juL甘油、25yL0.08%HPMC、125yL分离緩沖液pH3-7混合。然后将稀释的蛋白质负载到BectonFFE室的最大的负极进样口中，然后使用3-10的pH梯度和天然条件，并使用1200-1500V和20-25mA，通过间隔等电聚焦(IIEF)-FFE分离。在IOC下进行IIEF-FFE，驻留时间共64分钟。使用5分钟间隔(5分钟向前，然后5分钟向后)下緩冲液流速为50mL/小时，共60分钟。以6000jiL/小时进行点样，共2分钟，在点样期间，介质流速为180mL/小时。在点样后，使用电压，将介质流速设置为5分钟间隔(5分钟向前，然后5分钟向后)下为50mL/小时，共60分钟。在间隔分离后，通过将緩冲液流速提高至300mL/小时，共2分钟，停止，然后在2分钟内收集到96孔中来收集样品。如实施例1所示测定DPP-IV活性。结果如附图10和11所示。在附图10中，亮柱代表在每个pi下从一个健康者中获得的值，黑柱代表在每个pi下从一个糖尿病患者获得的平均值。在约pH3.9和约pH4.1，在健康者中观察到两个主要的峰。同样地，在约pH4.4和约pH4.8，在糖尿病患者中观察到两个主要的峰。糖尿病血浆曲线向更高pH移动，或者向健康者的血浆曲线的右侧移动。在本实施例中，第1组是健康的(S04,Sll,S07和S02)，第2组是i貪断为糖尿病的L205-血糖=~139mg/dL;S09-血糖未知；SOS-血糖-~90mg/dL，用药物控制患者的疾病；SOI-BG=~150mg/dL;和S139-BG-~350mg/dL。将健康者的血浆分成等分部分，一半用唾液酸苷酶去唾液酸化，剩下的一半作为对照品。在本实施例如上所述的条件下分离每个部分，通过酶测定来测定亚型特性。除去唾液酸导致特性从约pH4.0向约pH5.0移动。结果用附图9中的直方图表示。去唾液酸化也导致特异性活性增强了2到3倍，如表1所示。表1.特异性的DPP-IV活性(mU/mg)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>显然，过度的唾液酸化降低了DPP-IV的有效性(即特异性活性)。因此，具有不同疾病状态的患者可以显示不同的亚型特性的一个原因在于翻译后修饰，例如唾液酸化。为了解释多种样品的实际pH梯度，将pH读数vs.%局部活性(在该pH下)半积分。然后加上pH范围内的活性百分比。如附图11所示。实际上，这样就允许视觉检查在什么pH下达到了活性的某个"阈值"。健康者和糖尿病患者的数据如所示在附图12中为60%，在附图13中为90°/。。健康者的90%活性在pH4.2下都非常紧密地下降；而糖尿病患者在pH4.4以上都松散地下降，在更高pH下则疾病的严重性增加。健康者的601活性在约pH3.9下都紧密地下降；而糖尿病患者在pH4.5以上都松散地下降。尽管已经参考具体的实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解的是，这些实施方案仅是对本发明的原理和应用的说明。因此，应当理解，可以对说明性的实施方案进行很多改变，可以设计出其他的排列而不脱离如附属的权利要求所限定的本发明的精神和范围。权利要求1.一种特征在于一种特定的二肽基肽酶(DPP)参数的疾病状态或病症的诊断或预后方法，包括测定患者样品中特异性的DPP中一个或多个可区分部分的至少一种参数，和将所测定的所述DPP参数和所述疾病状态的存在、不存在或严重度关联。2.权利要求l的方法，其中每个部分包含一种或多种DPP亚型。3.权利要求2的方法，其中每个部分包含一种DPP亚型。4.权利要求l的方法，其中一个或多个部分不包含DPP亚型，并且其他部分包含一种或多种DPP亚型。5.权利要求l的方法，其中所述疾病状态选自代谢性疾病状态、癌症、病毒感染和自身免疫性疾病.6.权利要求5的方法，其中所述疾病状态是II型糖尿病。7.权利要求l的方法，其中所述参数选自量、浓度、活性、表达、翻译后修饰的类型和翻译后修饰的量。8.权利要求7的方法，其中所述参数是DPP活性，所述测定是通过检测DPP对于直接或间接的可检测底物活性而产生的水解产物的存在或量的测定而完成的。9.权利要求8的方法，其中所述特异性的DPP是DPP-IV，所述参数是DPP-IV活性。10.权利要求9的方法，其中所述底物是X-Y-R，其中X是任意的氨基酸，Y是脯氨酸、丙氨酸或精氨酸，R是任意的可检测的标记物。11.权利要求l的方法，其中所述参数是用对一种或多种DPP亚型具有特异性的抗体或凝集素测定的。12.权利要求l的方法，其中测定一种以上的DPP参数。13.权利要求l的方法，其中所述患者样品选自組织、血液、血浆、血清、唾液、眼泪、粘液、尿、羊水、关节液、精液、脑脊液及其组合。14.权利要求l的方法，进一步包括给操作者传达疾病状态的存在、不存在或严重度。15.权利要求14的方法，其中所述传达包括在选自电子屏、数码屏、可印刷底物和听觉信号的介质中显示疾病状态。16.权利要求l的方法，进一步包括区分在患者样品中存在的特定DPP的DPP部分。17.权利要求16的方法，其中所述区分是在所述测定前进行的。18.权利要求16的方法，其中所述区分是与所述测定同时进行的。19.权利要求l的方法，其中所述患者样品是在所述测定前进行处理的。20.权利要求19的方法，其中所述处理选自匀化、稀释、浓缩、冷冻及其组合。21.权利要求16的方法，其中所述区分是通过物理分离或隔离进行的。22.权利要求21的方法，其中所述区分是用无凝胶方式进行的。23.权利要求22的方法，其中所述无凝胶方式选自自由流动电泳和自由基质电泳。24.权利要求16的方法，其中所述DPP部分是基于DPP亚型的等电点区分的。25.权利要求16的方法，其中有至少两个所述的DPP部分。26.权利要求l的方法，其中所述关联包括比较所测定的参数和标准值的对应参数。27.权利要求l的方法，其中所述关联包括比较所测定的参数和内对照值的对应参数。28.权利要求25的方法，其中测定所述至少两个部分的所述参数。29.权利要求28的方法，其中所述关联包括比较至少一个部分的参数和至少两个部分的总测定的对应参数。30.权利要求29的方法，其中所述关联包括比较至少一个部分的参数和所有部分的总测定的对应参数。31.权利要求28的方法，其中所述关联包括比较至少一个部分的测定参数和至少一个其他部分的对应测定参数。32.权利要求28的方法，其中所述关联包括比较两个或更多个部分的总测定参数和标准值的对应总参数。33.权利要求28的方法，其中所述关联包括比较两个或更多个部分的总测定参数和内对照值的对应总参数。34.权利要求l的方法，其中所述特异性的DPP是DPP-IV。35.—种特征在于一种二肽基肽酶(DPP)参数的疾病状态或病症的诊断或预后方法，包括测定患者样品中一种或多种可区分的DPP亚型的至少一种参数，和将所测定的所述DPP参数和所述疾病状态存在、不存在或严重度的关联。36.权利要求35的方法，其中所述疾病状态选自代谢性疾病状态、癌症、病毒感染和自身免疫性疾病。37.权利要求35的方法，其中所述参数选自量、浓度、活性、表达、翻译后修饰的类型和翻译后修饰的量。38.权利要求35的方法，其中测定一种以上的DPP参数。39.权利要求35的方法，其中所述患者样品选自组织、血液、血浆、血清、唾液、眼泪、粘液、尿、羊水、关节液、精液、脑脊液及其组合。40.权利要求35的方法，进一步包括给操作者传达疾病状态的存在、不存在或严重度。41.权利要求35的方法，进一步包括区分患者样品中的DPP亚型。42.权利要求41的方法，其中所述区分是在所述测定前进行的。43.权利要求41的方法，其中所述区分是与所述测定同时进行的。44.权利要求41的方法，其中所述患者样品是在所述测定前进行处理的。45.权利要求41的方法，其中所述区分是通过物理分离或隔离进行的。46.权利要求45的方法，其中所述DPP部分是基于DPP亚型的等电点区分的。47.权利要求35的方法，其中所述关联包括比较所测定的参数和标准值的对应参数。48.权利要求35的方法，其中所述关联包括比较所测定的参数和内对照值的对应参数。49.权利要求35的方法，其中所述关联包括比较至少一种亚型的参数和两种或更多种亚型的总测定的对应参数。50.权利要求49的方法，其中所述关联包括比较至少一种亚型的参数和所有亚型的总测定的对应参数。51.权利要求35的方法，其中所述关联包括比较至少一种亚型的所测定的参数和至少一种其他亚型的对应的总测定参数。52.权利要求35的方法，其中所述关联包括比较两种或更多种亚型的总测定参数和标准值的对应的总参数。53.权利要求35的方法，其中所述关联包括比较两种或更多种亚型的总测定参数和内对照值的对应的总参数。54.—种II型糖尿病的诊断或预后方法，包括测定患者样品中DPP-IV亚型的一个或多个可区分部分的至少一种参数,和将所述的测定参数和II型糖尿病存在、不存在或严重度的关联。55.权利要求54的方法，其中每个测定部分包含一种或多种DPP-IV亚型。56.权利要求54的方法，其中每个测定部分包含一种DPP-IV亚型。57.权利要求54的方法，其中一种或多种部分不包含DPP-IV亚型，其他部分包含一种或多种DPP-IV亚型。58.权利要求54的方法，其中所述参数选自量、浓度、活性、表达、翻译后修饰的类型和翻译后修饰的量。59.权利要求58的方法，其中所述参数是DPP-IV活性。60.权利要求59的方法，其中所述DPP-IV活性是通过检测DPP-IV对于标记底物活性而产生的水解产物的存在或量的测定而完成的。61.权利要求60的方法，其中所述底物是X-Y-R，其中X是任意的氨基酸，Y是丙氨酸、脯氨酸或精氨酸，和R是任意的可检测标记物。62.权利要求54的方法，其中所述参数是用对一种或多种DPP亚型具有特异性的抗体或凝集素测定的。63.权利要求54的方法，其中测定一种以上的DPP-IV参数。64.权利要求54的方法，其中所述患者样品选自血液、血浆、血清及其组合。65.权利要求54的方法，进一步包括给操作者传达II型糖尿病的存在、不存在或严重度。66.权利要求54的方法，进一步包括区分DPP-IV成各个部分。67.权利要求66的方法，其中所述区分是在所述测定前进行的。68.权利要求54的方法，其中所述DPP-IV亚型是根据等电点区分的。69.权利要求68的方法，其中所测定的参数是DPP-IV活性。70.权利要求69的方法，其中测定连续范围的各部分的活性。71.权利要求70的方法，进一步包括获得连续范围的各部分的活性特性。72.权利要求71的方法，其中糖尿病的存在与选自下列的活性特性相关a.在与约pH4.4及以下的pH范围有关的等电点上，可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比不超过约90%;b.在与约pH4.15及以下的pH范围有关的等电点上，可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比不超过约60%;c，在与约pH4.4及以上的pH范围有关的等电点上，在可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比是至少约10%;d.在与约pH4.15及以上的pH范围有关的等电点上，在可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比是至少约40%;e.在约pH4.4处有DPP-IV活性特性的峰，其中所述峰与连续范围的总测定活性的至少约10%有关；f.在约pH4.8处有DPP-IV活性特性的峰，其中所述峰与连续范围的总测定活性的至少约10%有关；g.与内阴性对照物相比，DPP-IV的活性特性向更高pH移动；h.与阴性标准值相比，DPP-IV的活性特性向更高pH移动；和i.其组合。73.权利要求71的方法，其中糖尿病的不存在与选自下列的活性特性相关a.在与约pH4.2及以下的pH范围有关的等电点上，可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比是至少约90%;b.在与约pH3.9及以下的pH范围有关的等电点上，可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比是至少约60%;c.在与约pH4.2及以上的pH范围有关的等电点上，在可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比不超过约10%;d.在与约pH3.9及以上的pH范围有关的等电点上，在可区分的亚型中存在的连续范围的所有测定部分的总DPP-IV活性的百分比不超过约40%;e.与内阳性对照物相比，DPP-IV的活性特性向更低pH移动；f.与阳性标准值相比，DPP-IV的活性特性向更低pH移动；和g.其组合。全文摘要提供了一种疾病状态的诊断或预后的方法，包括测定患者样品中可区分的二肽基二肽酶的参数，并将该参数和疾病相关联。文档编号G01N33/68GK101460851SQ200780016051公开日2009年6月17日申请日期2007年3月13日优先权日2006年3月13日发明者C·A·捷尔芬德,P·奥姆兰申请人:贝克顿·迪金森公司