使用固体培养基的基于花粉的转化系统的制作方法

专利名称：使用固体培养基的基于花粉的转化系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物的遗传工程领域，特别是涉及用基于花粉的农杆菌转化技术将外源遗传物质转化进植物的种系。
背景技术：
用重组农杆菌转化培养的植物细胞，随后将转化的细胞再生成完整植株这一技术已成为生产转基因植物的标准技术。现有技术中已开发并已知各种采用农杆菌载体的方法，如美国专利4,940,838(Schilperoort等人，1990年7月10日)所公开的双向质粒系统，以及美国专利4,693,976(Schilperoort等人，1987年9月15日)所公开的所谓的共整合质粒系统。最常用的方法是采用“解除危险”的农杆菌，即已缺失或失活了肿瘤诱导功能的农杆菌，从而转化不会导致肿瘤性生长，但仍能使能再生成正常植株的正常愈伤组织生长。
与大多数转化技术一样，使用农杆菌也有缺点。为了获得均匀转化的植物(即在每一细胞中均存在异源DNA的植物)，需要转化各个细胞并从中再生出体细胞克隆。某些植物种类的细胞不能很容易地在组织培养物中维持，并且不能很容易地再生成体细胞克隆。已被研究用来克服这些障碍的一项技术是使用花粉作为载体，通过转化花粉，然后用转基因花粉对感受植物受精，可以生产含有异源DNA的转基因种子，转基因种子可以萌发从而天然产生转基因植物。
本发明中所用的术语“转基因花粉”或“转化的花粉”是指农杆菌处理的花粉或萌发的花粉，其能将花粉内、萌发的花粉内或与花粉管相接的农杆菌内的DNA输送到卵中。尽管不希望受理论限制，但是至少有两种可能的机制使本发明的处理的萌发花粉(即下文所用的术语“转基因花粉”或“转化的花粉”)能将异源DNA输送至植物卵中。一种可能的机制是将异源DNA导入花粉生殖细胞本身，然后在受精过程中异源DNA与内源DNA一起被携带延花粉管到达卵。另一种可能的机制是农杆菌粘附于延伸的花粉管，从而该细菌被花粉管携带至卵，在此发生卵的转化或合子发育。由于存在几种可能的机制，所以需要如上精确定义术语“转基因花粉”和“转化的花粉”。
然而用花粉作为载体不是不存在问题。为了有效获得转基因花粉，需要首先萌发花粉粒。在基于农杆菌的系统中，需要这一步以将异源DNA从细菌转移至花粉生殖细胞或者将细菌有效地附着于生长的花粉管。由于时间的因素，这需要一体外的系统以萌发花粉和使花粉管生长。已证明体外培养萌发的花粉和花粉管是很困难的，这是因为花粉粒在培养基上易破碎，导致其DNA被释放和降解。花粉存活率很低，因而植物转化效率很低。某些类型的花粉，即所谓的“干”或“干柱头”花粉(如棉花花粉)对湿度非常敏感，以致于获得花粉萌发及延长花粉管生长的尝试均告失败。因此，已证明很难有效地体外培养和获得能用作生产转基因植物的载体的转化的花粉。美国专利5,066,594(DeBonte等，1991年11月19日)中记载了体外花粉萌发方法和基于花粉的植物转化方法的综述及其使用中遇到的问题。DeBonte等指出本领域公认的是钙、硼和渗压剂(通常是蔗糖)是由于花粉萌发的萌发培养基的关键组分，第2栏，第10-22行。DeBonte等还注意到在不含琼脂的花粉萌发培养基中发现有花粉壁的溶解，第2栏，第44-49行。发现含有钙、硼、赖氨酸、谷氨酸和蔗糖的培养基对于在开花后储存12小时的花粉能给出相当的萌发率，但是发现花粉粒稳定性差且在培养基中随时间延长易于破裂，第2栏，第50-63行。
应注意的是DeBonte仅深入讨论了湿柱头花粉的萌发，并且使用的是液体和半液体萌发培养基。
DeBonte建议一种水性“稳定溶液”与水性萌发培养基一起使用，以便使萌发的花粉维持在培养基中一段时间足以被农杆菌转化。萌发后将花粉转移至稳定溶液中并与农杆菌载体温育以实现花粉的转化。DeBonte没有证明这一方法对于转化花粉是否实际有效，也没有证明经如此处理后的花粉是否能使感受植物受精。
其它所建议的用于转化花粉的方法包括微粒轰击(美国专利5,100,792；美国专利5,120,657)，微量注射(美国专利4,743,548)和电穿孔(美国专利5,629,183)。第一种方法需要复杂而昂贵的设备，而第二种方法需要对各个花粉粒进行精细的操作。没有一种方法显示能有效产生能对感受植物受精的活转基因花粉。第三种方法虽然有效，但是也需要复杂而昂贵的设备和训练有素的人员，并且花粉需暴露于水性条件，通常水性条件对于干柱头花粉是致死环境。
目前仍需要体外萌发和获得转基因花粉特别是干柱头花粉的方便有效的手段，这种手段应该是高效的并且能用转基因花粉容易地对感受植物受精。
发明概述本发明涉及遗传转化植物的方法，包括下列步骤产生能体外诱导和支持花粉管生长并添加了也能促进花粉管生长的农杆菌的培养基；将一片能促进花粉管生长的转基因农杆菌菌苔置于萌发培养基的表面；将花粉置于萌发培养基上；将花粉和农杆菌在受控的温度和湿度环境下保温以使花粉萌发，随后产生转基因花粉；将转基因花粉转移至感受植物优选去雄植物的柱头上以使感受植物受精；从受精植物中获得转基因种子；用标准的选择剂系统筛选来自萌发的转基因种子的籽苗以证实转化已经发生；将籽苗进一步培养成成熟的可育的转基因植物。本发明的方法提供了比现有技术方法更优越的花粉萌发和植物转化，并且简便而经济。本发明具有萌发干柱头花粉和产生转基因干柱头花粉的实用性。本发明还具有不需要体外培养植物组织以及不需要从培养的植物细胞再生体细胞克隆的优点。
附图概述

图1描绘了用作本发明的测试质粒的质粒pBin19GmBar。
发明的详细描述本发明涉及用基于农杆菌的转化系统产生转基因植物的有效方法。与使用花粉作为转化载体的早期尝试相反，本发明提供了一种在固体生长培养基上体外萌发和保持花粉、特别是干柱头花粉而不溶解花粉的方法，从而与农杆菌共培养时，能有效产生转基因花粉。转基因花粉提供了有效的转化植物种系的手段，其不需要使用植物细胞培养物以及完整植物的体细胞再生。本发明方法因此提供了转化不容易转化的或目前有效体细胞再生手段未知或不可能的各种植物的手段。
本发明所用的萌发培养基是包括琼脂糖、蔗糖、KNO3、MnSO4、H3BO3、MgSO4和赤霉酸的固体培养基。尽管通过用麦芽糖或葡萄糖作为渗压剂可以支持花粉萌发，但是在所测试的糖中，延长的棉花花粉管生长需要存在蔗糖。萌发百分率在含有蔗糖的培养基中也比用麦芽糖、葡萄糖或果糖观察到的百分率得以增加。优选的培养基包括10％琼脂糖、25％蔗糖、0.52mM KNO3、3.06mM MnSO4、1.66mMH3BO3、0.42mM MgSO4·7H2O和1.0μM赤霉酸。培养基的pH应为6.0-8.0，优选约7.6。优选在高压灭菌后立即将培养基倒入培养皿中，盖盖，并储存在冰箱内直至使用。
尽管这些培养基是特殊为干柱头植物(即棉花)而设计的，但是其可以支持各种植物的花粉的萌发和生长，其也支持湿柱头植物(烟草和大豆)的萌发和花粉管生长。该培养基还被开发与农杆菌协同作用促进花粉管生长，这种现象的精确机制尚不清楚。
转基因花粉能用任何基于农杆菌的载体系统产生，包括美国专利4,940,838的双向载体系统和美国专利4,693,976的共整合载体系统。
优选使用解除危险(不致瘤)的农杆菌，优选的载体系统是美国专利4,940,838的双向载体系统。从现有技术所公开的各种载体系统和转化方法中选择合适的载体系统和转化方法，以及将其用于本发明属于本领域的技能范围。类似地，体外培养和保持农杆菌的方法也是本领域已知的，本领域普通技术人员能毫无困难地从文献中发现合适的方法。
选择经花粉导入的异源基因序列并最终将其导入植物对本发明的应用没有任何限制，对基因的选择根据需赋予转基因植物的性状而定。可用于本发明的种类包括赋予除草剂抗性、昆虫抗性、疾病抗性、改良的淀粉产生、改良的蛋白质产生、改良的脂肪酸产生、改良的氨基酸产生、改变的花颜色、改变的花期、干旱抗性的基因、抑制内源基因功能的反义基因或编码能以纯化形式从植物中分离的产物如药物或抗体的基因。能在植物中表达的、可导入农杆菌的以及能从农杆菌转移至植物细胞中的任何基因构建体均可用于本发明中。优选的构建体包括能筛选农杆菌或植物转化子的一或多种选择标记，以及与编码序列连接的植物活性启动子。这类构建体在现有技术中已知有很多。组装这类构建体并将其导入农杆菌的方式不构成本发明的一部分，其是现有技术的技能范畴。
植物嵌合基因和农杆菌载体构建的例子见美国专利5,352,605，5,149,645，5,034,322，5,068,193和4,762,785。
用于本发明的花粉通过在金属箔上摇动花或任何其它不损坏花粉粒的方式从花药上优选从新开裂的花药上收集。优选在使用前收集花粉，收集后，将花粉置于固体萌发培养基的表面使之萌发。优选地，在置放花粉前、优选地在即将置放花粉前将一片用所需的异源基因序列转化的农杆菌菌苔放在培养基的表面。发现存在农杆菌能增强花粉萌发和生长。优选地将花粉均匀地在培养基上涂成一薄层，如通过轻轻摇动平板并倒掉过量的花粉。花粉的萌发优选地在受控的温度和湿度环境下进行，温度为20-32℃，最优选为24-28℃，湿度水平优选在约50-100％，最优选在80％。用于控制湿度水平在80％的一种方便的方法是将培养基平板置于一层饱和硫酸铵上用于萌发。萌发和花粉管生长通常在3-4小时内发生，极少或没有发生花粉粒和花粉管溶解。优选的实施方案是本发明使用干柱头花粉，最优选使用棉花花粉。花粉管萌发并与农杆菌保温一段足以使细菌附着或DNA转移的时间(通常34小时)后，可用处理的花粉对感受植物(同种植物或能与花粉供体植物杂交的植物)施粉。
这可以简单地通过将萌发平板的表面与感受植物的花的柱头接触而完成。在一优选的实施方案中，感受植物的花是雄性不育的或去雄的。使用雄性不育的或去雄的花防止了自花授粉并降低了被其他植物的未转化花粉授粉的可能性。将棉花花去雄的优选的方法是用水充满新开的花使花药和柱头饱和，通过将花药和柱头保持水饱和状态一段时间，优选30秒至30分钟，花中存在的花粉甚至是萌发的花粉均破裂被毁坏。花粉被破坏后，从花中吸去水，这样的花可以被授粉。去雄的花的柱头优选用某些设施覆盖直至被授粉，以防止偶然发生的交叉授粉。最优选地在午后中(约230)之前进行这一程序，因为在这一时间前去雄的花对于种子形成没有明显的下降。用这一技术对棉花花去雄的有效率为95-100％。
感受植物被处理的花粉授粉后，优选采取步骤防止进一步的偶然交叉授粉。这些步骤包括隔离植物(如在温室中)，覆盖柱头或整个花以防止昆虫进入或风媒非转基因花粉的进入。被授粉的植物可以正常生长和结种。这种种子可被视为潜在的转基因种子，因为它们由在整个一群体中的各个种子组成，这一群体在其基因组中含有导入花粉中的异源DNA。潜在的转基因种子将萌发生长成潜在的转基因植物。本发明因此可被视作不需植物组织培养物和体细胞克隆再生而能产生潜在的转基因植物。可用任何标准的选择和筛选标记如卡那霉素抗性或指示蛋白(例如水母发光蛋白或萤光素)或用除草剂，除草剂抗性基因被用作经农杆菌处理的花粉导入的基因构建体中的选择标记，筛选潜在的转基因植物的群体的种子、萌发的种子、籽苗或成熟植物以分离真正的转基因个体植物。对转基因植物的筛选自动选择了稳定的转化子(具有稳定整合进其染色体的异源DNA的植物)，因为只有稳定转化的植物才能保持导入的序列，从而其能在筛选中存活。附图的详细描述图1示出了用作本发明方法的测试质粒的质粒pBin19GmBar。该质粒是通过将嵌合的35S-bar基因插入质粒pBin19(Bevan，基于分离根癌农杆菌Ti质粒的Vir区和T区的双向植物载体策略，自然，303179-180(1983)；ATCC37327)。该质粒含有T-DNA右边界序列，与NPTII编码序列连接的NOS启动子，后接NOS终止子序列，与Bar编码序列连接的CaMV 35S启动子，后接35S聚腺苷酸序列，最后是以反义方向插入的作为选择标记的庆大霉素基因，后接T-DNA左边界序列。
实施例1花粉萌发培养基制备含有10％琼脂糖、25％蔗糖、0.52mM KNO3、3.06mM MnSO4、1.66mM H3BO3、0.42mM MgSO4·7H2O和1.0μM A3赤霉酸的支持花粉萌发的固体培养基。培养基的pH最终调节为7.6。高压灭菌后立即将培养基倒入35mm×10mm培养皿中，用parafilm密封，在冰箱中储存备用。
实施例2转基因根癌农杆菌用含有嵌合35S-bar基因的测试质粒pBin19GmBar(含有细菌卡那霉素抗性标记的pBin19)转化根癌农杆菌菌株EHA101。这一质粒见图1所示。嵌合35S-bar基因是通过将来自pAHC25(Christensen等，1992)的bar编码区(编码膦丝菌素乙酰转移酶)插入双35S启动子的下游35S终止序列的上游的pRTL2(Gupta等，1993)的多克隆位点以得到pRTL2bar而得到的。从pRTL2bar以HindIII片段分离嵌合35S-bar基因，并克隆进pBin19Gm的多克隆位点，得到最终的测试质粒pBin19GmBar。经标准电穿孔方法(Walkerpeach and Velten，1994)将构建的pBin19GmBar导入根癌农杆菌菌株EHA101。在含有25μg/ml的庆大霉素的LB琼脂(Miller，1973)平板上选择转化子。进一步经PCR证实pBin19GmBar质粒的存在。然后将转化的农杆菌在含有25μg/ml庆大霉素和50μM乙酰丁香酮的1ml LB肉汤中于28℃培养18小时。18小时培养后，将200μl细菌培养物转移至含有乙酰丁香酮和庆大霉素的L肉汤平板上，接种的L肉汤平板在28℃培养过夜。
24小时后，通过将覆盖无菌天鹅绒片的50ml烧杯压在接种的L肉汤平板的表面上，然后将天鹅绒压在花粉萌发平板的表面上来用一片转化的农杆菌接种实施例1的花粉萌发平板。
实施例3转基因花粉的萌发和产生通过在一片金属箔上摇动从新开花的棉花花中获得花粉，然后将花粉置于实施例2的一个接种的花粉萌发培养板上，轻轻摇动平板以用花粉完全覆盖其表面，将过量的花粉转移到第二个花粉萌发平板上，重复这一过程直至获得若干个用花粉覆盖的萌发平板。然后将萌发平板不加盖地置于密封的湿度箱的一层饱和硫酸铵上，使湿度水平约为80％，在28℃保温30分钟，然后在24℃保温3-4小时，使花粉萌发并产生转基因花粉。如此处理的花粉的萌发率为＞75％。极少或没有观察到花粉管溶解。湿度水平为100％时导致花粉管溶解，湿度水平低于60％时会降低花粉萌发。
用来自烟草和大豆的花粉重复上述过程得到基本相同的花粉存活率、萌发率和花粉管生长动力学。
实施例4转基因植物的授粉和产生通过用足够的水充满花而覆盖柱头和花药使棉花花去雄。30秒后，去除水并用塑料囊覆盖柱头以防止受精。发现这一过程通过破裂花粉和萌发的花粉管而使棉花花去雄，从而防止自花受精，其有效率为95-100％。通过简单地除去柱头的覆盖、用Kimwipe干燥柱头表面并将干柱头与花粉萌发平板的表面接触而用实施例3的萌发的处理的花粉对如此去雄的花授粉。
被授粉的植物在温室中在石棉垫上于水培条件下生长至结种子。从这些植物获得的种子经轧棉、去绒和热水处理以促使萌发，将种子种在含有Sunshine #3(特殊的精细盆栽混合物)(Sun GroHorticultre，Inc.，加拿大)的2加仑花盆中，培养2星期(出现初生叶)后筛选籽苗。通过喷洒1/2至3/4推荐剂量的Liberty(glufosinate)除草剂筛选籽苗中的转化子。发现这一方法对于鉴别表达导入的嵌合基因的转基因植物的有效率为100％，提示转化率为每3000个分析的种子约1个转化子。
参考文献Christensen，A.H.，Sharrock，R.A.，and Quail，P.H.1992.玉米多遍在蛋白基因结构、表达和转录物剪接的热干扰以及经电穿孔转移至原生质体后的启动子活性，植物分子生物学18675-689。Miller，J.1973.分子生物学实验，冷泉港实验室，纽约。Gupta，A.S.，Heinen，J.L.，Holaday，A.S.，Burke，J.J.and Allen，R.D.1993.超量表达叶绿体Cu/Zn超氧化物岐化酶的转基因植物对氧化剂应力的增加的抗性，美国科学院院刊901629-1633。Walkerpeach，C.and J.Velten(1994).农杆菌介导的向植物细胞的基因转移共整合和双向载体系统，《植物分子生物学手册》S.B.Gelvin，R.A.Shilperoort，D.P.S.Verma编辑，Kluwer Academic Publishers.出版，Dordrecht，荷兰，B1节1-19。
权利要求
1.一种生产转基因植物的方法，包括a.从第一个植物中获得花粉，b.将一片农杆菌菌苔加到固体花粉培养基上，该农杆菌包括至少一种能被转移至植物细胞中的异源基因序列，c.将花粉加到该固体培养基上，d.使花粉在培养基上萌发并生长，从而获得转基因花粉，e.将转基因花粉加至能被第一个植物的花粉受精的第二个植物的柱头上，从而使第二个植物受精，f.从第二个植物中获得转基因种子，g.萌发转基因种子获得转基因植物。
2.权利要求1的方法，其中所述的第一个植物和第二个植物选自烟草植物、棉花植物和大豆植物。
3.权利要求1的方法，其中所述的固体花粉培养基包括10％琼脂糖、25％蔗糖、0.52mM KNO3、3.06mM MnSO4、1.66mM H3BO3、0.42mM MgSO4·7H2O和1.0μM A3赤霉酸。
4.权利要求2的方法，其中所述的植物是干柱头花粉植物。
5.权利要求4的方法，其中所述的植物是棉花植物。
6.权利要求5的方法，其中第二个棉花植物是去雄棉花植物。
7.权利要求1的方法，还另外包括在将转基因花粉施加到第二个植物之前将第二个植物去雄的步骤。
8.用于花粉萌发和花粉管生长的培养基，包括琼脂糖、蔗糖、KNO3、MnSO4、H3BO3、MgSO4和赤霉酸。
全文摘要
本发明公开了一种在农杆菌的存在下支持花粉萌发和花粉管生长的培养基,所述的培养基包括琼脂糖、蔗糖、NO
文档编号C12N15/84GK1263434SQ98807068
公开日2000年8月16日 申请日期1998年7月14日 优先权日1997年7月15日
发明者约翰·J·伯克, 梅尔文·J·奥利弗, 杰弗里·P·费尔藤 申请人:由农业部长代表的美利坚合众国