一种象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp，相关蛋白及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物基因工程【技术领域】，具体公开了一种象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp，相关蛋白及应用。所述效应基因Me-tctp核苷酸序列如SEQIDNO:1～3所示，其相关蛋白ME-TCTP的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。本发明研究了Me-tctp基因在线虫不同阶段表达情况；构建该基因过表达载体，转化到农杆菌EHA105中，侵染番茄叶片，荧光观察发现ME-TCTP蛋白定位在植物细胞质上；利用离体RNAi的方法沉默Me-tctp基因，分析结果显示该基因的沉默能够显著的降低象耳豆根结线虫的侵染能力；构建病毒诱导重组RNAi载体，将该载体导入植物，在植物中产生Me-tctp的dsRNA，该植株能显著抑制根结线虫的寄生。通过本发明可获得强抗象耳豆根结根结线虫的植物。
【专利说明】—种象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp，相关蛋白及应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物基因工程【技术领域】，具体涉及一种象耳豆根结线虫效应基因ife-1c ?/7 ,相关蛋白及应用。
【背景技术】
[0002]根结线虫是一类非常重要的植物寄生线虫，广泛分布于世界各地，能侵染超过3000种不同植物。根结线虫每年造成大概770亿美元的经济损失，随着作物复种指数的提高和设施农业的发展，根结线虫的发生和危害将会不断的加剧。由于根结线虫的根内寄生、寄主范围广泛的特性以及抗根结线虫种质资源的缺乏限制了化学防治、轮作和抗病育种等防治方法在控制根结线虫危害中的应用。而且现有的化学防治方法污染严重，因此，寻找其他绿色安全有效的防治根结线虫的方法是植物生产所长期面临的艰巨任务。
[0003]RNA干扰技术(RNAi)的出现使得开发更为有效的防治根结线虫的方法成为可能。RNAi能通过靶向抑制根结线虫特定基因功能而限制根结线虫侵染、寄生和繁殖因而能高效地减少根结线虫的危害而且对其他非靶标生物较为安全。RNAi现象最早在秀丽小杆线虫中发现，随后在植物、无脊椎动物和脊椎动物中都相继发现了这种现象。RNAi技术通过dsRNA特异性的降解靶mRNA，影响或抑制该目的基因功能，从而影响该种生物的生长、发育、繁殖甚至能杀死该种生物。该技术相比其他防治方法的最大优点是能定向作用于特定的某种(某类)害虫而不会影响在该生境中的其他生物。
[0004]应用农杆菌介导的病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术相对于传统的使用组织培养方法获得RNAi转基因植株更加简单快速，使得我们并不需要通过复杂的组培方法就可快速获得抗线虫植株。`
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了克服现有技术中缺乏绿色安全有效的防治根结线虫的方法的缺陷，提供一种新的象耳豆根结线虫效应基因
[0006]本发明的另一目的是提供一种象耳豆根结线虫效应基因的相关蛋白ME-TCTP。
[0007]本发明的又一目的是提供一种象耳豆根结线虫效应基因的应用。
[0008]本发明通过以下技术方案实现上述目的:
一种象耳豆根结线虫iMeloidogyne javanica )效应基因其核苷酸序列如SEQID N0:1~3任意一条所示。其中SEQ ID NO:1为全基因序列(包括5’端非编码区、3’端非编码区、内含子和外显子)，SEQ ID NO:2为编码区序列(包括内含子和外显子)，SEQ IDNO:3为编码序列(即cDNA序列,仅为外显子)。
[0009]在严格条件下与上述象耳豆根结线虫效应基因杂交且编码与象耳豆根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子，或者与上述象耳豆根结线虫效应基因有90%以上同源性且编码象耳豆根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子，也在本发明的保护范围之内。所述严格条件为:可在0.1XSSC、0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0010]一种象耳豆根结线虫效应蛋白ME-TCTP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或该氨基酸序列经过一个或一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且与象耳豆根结线虫寄生相关的衍生蛋白。
[0011]为了使象耳豆根结线虫效应蛋白ME-TCTP便于纯化，可以在该序列(SEQ ID NO:4)的氨基末端或羧基末端连接上特定的标签，所述特定标签为5~6个精氨酸，或2~12个组氨酸，或如SEQ ID NO:5所示序列，或如SEQ ID NO:6所示序列，或如SEQ ID NO:7所不序列。如表1，但不限于表1:
【权利要求】
1.一种象耳豆根结线虫效应基因其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0:1~3任意一条所示。
2.一种象耳豆根结线虫效应蛋白ME-TCTP，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示 ο
3.在严格条件下与权利要求1所述象耳豆根结线虫效应基因杂交且编码与象耳豆根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子。
4.与权利要求1所述象耳豆根结线虫效应基因具有90%以上同源性且编码与象耳豆根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子。
5..—种象耳豆根结线虫效应蛋白ME-TCTP，其特征在于在SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有特定标签，所述特定标签为5~6个精氨酸，或2~12个组氨酸，或如SEQ ID NO:5所示序列，或如SEQ ID NO:6所示序列，或如SEQ ID NO:7所示序列。
6.一种重组表达载体，其特征在于，由出发载体的多克隆位点插入权利要求1所述象耳豆根结线虫效应基因或该基因的部分外显子片段如SEQ ID NO:8~9任一所示序列构建而成。
7.—种重组基因表达盒，其特征在于，含有权利要求1所述象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp 0
8.—种转基因细胞系，其特征在于，含有权利要求1所述象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp。
9.一种重组菌，其特征在于，含有权利要求1所述象耳豆根结线虫效应基因
10.权利要求1所述象耳豆根结线虫效应基因在制备转基因植物中的应用。
【文档编号】C12N15/84GK103509803SQ201310361407
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】廖金铃, 孙凤侠, 卓侃 申请人:华南农业大学