一种快速检测美国白蛾的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测美国白蛾的试剂盒，至少包括1次用量以上的特异性引物COI01/02或SpmR01/02试剂；所述的特异性引物COI01/02与SpmR01/02序列如下：COI01序列：5'-CAGGAACTGGATGAACA-3'，COI02序列：5'-CCTACTGCTCATACGAA-3'，SpmR01序列：5'-ACGCTGTTGTCCGTATTT-3'，SpmR02序列：5'-CTGATTTCTTCGGTGTTG-3'。本发明的试剂盒是一种高效、准确、便捷的美国白蛾分子检测技术，可在分子水平将美国白蛾与灯蛾科其他种类进行区分，能满足使用需求，具有很好的实用性，能产生较好的经济效益和社会效应。
【专利说明】一种快速检测美国白蛾的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于美国白蛾检测【技术领域】，具体涉及一种快速检测美国白蛾的试剂盒。【背景技术】
[0002]美国白蛾[Hyphantria cunea (Drury)]又名秋幕毛虫、秋幕蛾，属鳞翅目(Lepidortera)JT蛾科(Arctiidae)、灯蛾亚科(Arctiinae),是世界著名的检疫性有害生物。原产于北美洲，分布于美国、加拿大、墨西哥等地区，1940年传入欧洲，1945年传入日本，1958年传入韩国，1979年传入我国辽宁丹东。目前，国内公布的疫区有北京、天津、河北、山东、辽宁、陕西、江苏等省市。国务院办公厅曾多次下发文件，要求大力加强美国白蛾查防治理工作。2007年美国白蛾被纳入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。
[0003]在美国，美国白蛾有2个种，分别是黑头种和红头种，而我国主要分布的是黑头型。由于该虫繁殖力强大，传播途径广泛，寄主种类繁多，食性庞杂，食量巨大，生态适应性强，危害程度严重，是我国农、林、果、蔬业的重要害虫。据赵铁珍等人于2004年研究评估全国美国白蛾疫区的非经济损失(环境功能损失、景观美学损失、生产生活损失、心理影响损失、生态系内部失衡损失、区域声誉损失)合计为140.35亿元。所以说，准确的种类鉴定是防止美国白蛾侵入非疫区，保护非疫区生态环境的重要手段。
[0004]美国白蛾成幼虫与灯蛾科其他种类在形态上极难区分，尤其是口岸检疫时截获美国白蛾的卵或不完整的虫体，利用传统的形态分类更难做出快速准确的鉴定。因此需要开发出精准的美国白蛾检测方法。
【发明内容】
[0005]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种快速检测美国白蛾的试剂盒，使其具有准确稳定、`操作方便、特异性强等特点，满足使用需求。
[0006]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种快速检测美国白蛾的试剂盒，至少包括I次用量以上的特异性引物C0101 /02或SpmRO 1/02试剂；所述的特异性引物C0101 /02与SpmR01/02序列如下:
C0101 序列:5’ -CAGGAACTGGATGAACA-3’，
C0102 序列:5’ -CCTACTGCTCATACGAA-3’，
SpmROl 序列:5’ -ACGCTGTTGTCCGTATTT-3’，
SpmR02 序列:5’ -CTGATTTCTTCGGTGTTG-3’。
[0007]所述的快速检测美国白蛾的试剂盒，由I次用量以上的下列试剂组成:
Taq buffer, MgCl2, dNTP mix, Taq DNA 聚合酶，特异性引物 COIOl /02 或 SpmRO 1/02，ddH20。
[0008]所述的快速检测美国白蛾的试剂盒的检测方法，包括以下步骤:
DDNA的制备:采用GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒提取待检测样品和美国白蛾标准对照样的DNA ；2)PCR反应体系与反应条件
50μ? 反应体系组成:5μ? IOXTaq buffer,2 mmol/L MgCl2,200 Mmol/L dNTP mix、2U Taq DNA 聚合酶、3μ? DNA 模板、特异性引物 COIOl /02 和 / 或 SpmRO 1/02 各 I Mmol/L，ddH20补齐；
反应程序为:94°C预变性2 min;94°C变性I min、52°C复性30 s，72°C延伸30 S，进行30个循环；72°C延伸5 min ;4°C保存；
3)PCR结果判定
混合 8 PLPCR 产物与 2 μ? 6XGlycerol DNA loading Buffer 上样，以 DNA MarkerDLlOO为分子量标记，室温下恒压120 V，用3 %琼脂糖凝胶电泳45 min, 0.5% Mmol/L的EB染色，凝胶成像系统检测样品，拍照；照片显示美国白蛾标准对照样有清晰的扩增条带，待检测样品也具有相同条带即为美国白蛾，否则不是美国白蛾。
[0009]步骤I)中，DNA提取的具体过程如下:
直接剪取供试标本足和胸部30mg放入2mL试管，无水乙醇浸泡保存标本用无菌蒸馏水冲洗浸泡4飞次，弃水；干标本无菌蒸馏水浸泡3h后吸干水分。置于2mL离心管，MM400球磨仪中震荡碾磨(30 次/s) 30s,加入 180 μ L Lysis Buffer>20 μ L Proteinase K,震荡混匀，常温过夜，55°C震荡温浴3-5h，12000rpm离心IOmin,取上清，加入200 μ L BindingBuffer和200 μ L无水乙醇，充分混匀，加入20 μ L磁珠，轻柔颠倒混匀lOmin。离心管置于磁力架，吸弃管内液体，保留磁珠，Wash Buffer 500uL颠倒混勻2min置于磁力架,弃去管内液体，Wash Buffer II同样洗漆两次,离心管仍置于磁力架上,缓慢加入Wash BufferIII, Imin后移走管内液体。加入20yL Elution Buffer, 55°C水浴IOmin洗脱磁珠上吸附的DNA，4°C储存备用。
[0010]本发明的快速检测 美国白蛾的方法，普通PCR检测方法以昆虫线粒DNA基因和其它已公布的基因片段为模板，设计并筛选出灵敏度高，特异性强的美国白蛾特异PCR扩增引物。开发出高效、准确、便捷的美国白蛾分子检测技术。该技术可在分子水平将美国白蛾与灯蛾科其他种类进行区分。
[0011]有益效果:与现有技术相比，本发明的快速检测美国白蛾的试剂盒，具有准确稳定、操作方便、特异性强等特点，能满足使用需求，具有很好的实用性，能产生较好的经济效益和社会效应。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是特异引物C0101 /02对样本1-16的扩增效果；
图2是特异引物SpmRO 1/02对样本1_16的扩增效果。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0014]实施例1
快速检测美国白蛾的方法的试剂盒，至少包括I次用量以上的特异性引物C0101 /02或SpmR01/02试剂。在使用时，可以另外补充购买:Taq buffer, MgCl2, dNTP mix, Taq DNA聚合酶，ddH20,—起配合使用即可。其中，ddH20可以自己制备。[0015]同时，该快速检测美国白蛾的方法的试剂盒，可以直接配齐所有溶液，具体由I次用量以上的下列试剂组成:10XTaq buffer, 2 mmol/L MgCl2, 200 Mmol/L dNTP mix, TaqDNA 聚合酶，特异性引物 COIOl /02 或 SpmRO 1/02, ddH20。
[0016]其中，特异性引物C0101 /02与SpmR01/02序列如下:
C0101 序列:5’ -CAGGAACTGGATGAACA-3’，
C0102 序列:5’ -CCTACTGCTCATACGAA-3’，
SpmROl 序列:5’ -ACGCTGTTGTCCGTATTT-3’，
SpmR02 序列:5’ -CTGATTTCTTCGGTGTTG-3’。
[0017]在选取溶液浓度时，根据需要进行配备即可，在用量配备上，优选10次以上用量。
[0018]该特异性引物C0101 /02与SpmR01/02，以美国白蛾基因片段为模板，综合考虑引物的长度、GC含量、目标基因大小和Tm值进行设计的，这2对引物不受供试昆虫虫态限制，可准确鉴定美国白蛾的成幼虫、蛹、卵及残体。
[0019]使用该试剂盒对待测样品直接进行检测，具体如下:
以包括美国白蛾在内的16种灯蛾科昆虫作为供试标本，这16种灯蛾科昆虫成幼虫在外部形态上都与美国白蛾难以区分。供试标本详见表I。
[0020]表I供试标本
【权利要求】
1.一种快速检测美国白蛾的试剂盒，其特征在于，至少包括I次用量以上的特异性引物COIOl /02或SpmRO 1/02试剂；所述的特异性引物C0101 /02与SpmRO 1/02序列如下:
C0101 序列:5’ -CAGGAACTGGATGAACA-3’，
C0102 序列:5’ -CCTACTGCTCATACGAA-3’，
SpmROl 序列:5’ -ACGCTGTTGTCCGTATTT-3’，
SpmR02 序列:5’ -CTGATTTCTTCGGTGTTG-3’。
2.根据权利要求1所述的快速检测美国白蛾的试剂盒，其特征在于，由I次用量以上的下列试剂组成:
Taq buffer, MgCl2, dNTP mix, Taq DNA 聚合酶，特异性引物 COIOl /02 或 SpmRO 1/02，ddH20。
3.权利要求1所述的快速检测美国白蛾的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: DDNA的制备:采用GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒提取待检测样品和美国白蛾标准对照样的DNA ； 2)PCR反应体系与反应条件 50μ? 反应体系组成:5μ? IOXTaq buffer,2 mmol/L MgCl2,200 MmoI/L dNTP mix、2UTaq DNA 聚合酶、3μ? DNA 模板、特异性引物 COIOl /02 或 SpmRO 1/02 各 I Mmol/L, ddH20 补齐； 反应程序为:94°C预变性2 min;94°C变性I min、52°C复性30 s，72°C延伸30 S，进行30个循环；72°C延伸5 min ;4°C保存； 3)PCR结果判定 混合 8 PLPCR 产物与 2 μ? 6XGlycerol DNA loading Buffer 上样，以 DNA MarkerDLlOO为分子量标记，室温下恒压120 V，用3 %琼脂糖凝胶电泳45 min, 0.5% Mmol/L的EB染色，凝胶成像系统检测样品，拍照；照片显示美国白蛾标准对照样有清晰的扩增条带，待检测样品也具有相同条带即为美国白蛾，否则不是美国白蛾。
4.根据权利要求3所述的快速检测美国白蛾的试剂盒的检测方法，其特征在于:步骤I)中，DNA提取的具体过程如下: 直接剪取供试标本足和胸部30mg放入2mL试管，无水乙醇浸泡保存标本用无菌蒸馏水冲洗浸泡4飞次，弃水；干标本无菌蒸馏水浸泡3h后吸干水分；置于2mL离心管，MM400球磨仪中震荡碾磨(30 次/s) 30s,加入 180 μ L Lysis Buffer>20 μ L Proteinase K,震荡混匀，常温过夜，55°C震荡温浴3-5h，12000rpm离心IOmin,取上清，加入200 μ L BindingBuffer和200 μ L无水乙醇，充分混匀，加入20 μ L磁珠，轻柔颠倒混匀IOmin ;离心管置于磁力架，吸弃管内液体，保留磁珠，Wash Buffer 500uL颠倒混勻2min置于磁力架,弃去管内液体，Wash Buffer II同样洗漆两次,离心管仍置于磁力架上,缓慢加入Wash BufferIII, Imin后移走管内液体；加入20 μ L Elution Buffer, 55?水浴IOmin洗脱磁珠上吸附的DNA，4°C储存备用。
【文档编号】C12Q1/68GK103451281SQ201310361163
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】詹国辉, 陈景云, 郑斯竹, 高渊, 陈云芳, 邓海娟, 赵毓郎, 葛华林 申请人:苏州市外来有害生物防控技术中心