含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库，涉及经过遗传基因改造的微生物对遗传毒性致癌物的检测。结合流式细胞仪分选技术、深度测序技术建立一种高通量筛选遗传毒性相关易感基因的方法。本发明的优点在于，可以检测遗传毒性化合物，且高通量，针对性强，操作简便。这种以遗传毒性检测灵敏度检测为基础的筛选与遗传毒性效应相关的易感基因群的文库，其应用前景：一方面可作为分子工具研究这类影响检测系统灵敏的基因的遗传表达与外源遗传毒性化合物的暴露间的相互作用关系，另一方面可通过生物信息学分析，可将酵母的遗传毒性相关易感基因与人类的癌症易感基因建立关联，为提高环境健康风险评价水平提供新方法。
【专利说明】含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术，尤其涉及经过遗传基因改造的微生物对遗传毒性化合物的检测。
【背景技术】[0002]酿酒酵母是一种简单真核生物，单细胞，遗传改造操作简单，培养简便快速且环境友好，适合作为一种模式生物应用于生命科学研究。1996年酿酒酵母全基因组序列分析作为第一个真核生物全基因组序列信息被公布，约有5800个基因序列信息被获得而其中大约有23%基因与人类同源，因此酿酒酵母作为一种简单的模式生物因其已知的全基因组序列信息可为深入研究真核生物乃至高等生物生命机制提供基础。
[0003]基于已知的酿酒酵母全基因组序列，斯坦福大学研究人员为主的多个实验室构建得到酿酒酵母单基因缺失株文库(Saccharomyces Genome Deletion Project) (Giaeveret al., Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiaegenome，2002，Nature418(6896):387-391.)，该文库以野生型酿酒酵母菌株作为背景菌株，利用以PCR为基础的基因敲除策略(PCR-based gene deletion strategy),根据基因同源重组原理逐个对酿酒酵母基因组中的每一个基因进行敲除，最后共得到5396个分别单基因敲除的突变株。由PCR介导的基因敲除策略，即将酵母基因组中每个基因的开放阅读框(ORF)被卡那霉素抗性基因(KanMX)同源重组置换，并利用G418抗性对基因敲除菌进行筛选。PCR扩增KanMX基因所用到的引物由四部分组成，其中包括(I)酵母目的基因ORF片段前ISbp同源序列；
(2)18bp通用引物U1、D1 ;(3)—段20bp长度的仅标示、鉴定目的缺失基因的特异条形码序列(barcoding sequence),即每一个酵母基因都对应一条特异性条形码序列；(4) 18bp与KanMX基因同源的序列。
[0004]目前该文库的应用主要是建立一种合成致死筛选微阵列(Syntheticgenetic array, SGA)方法即通过检测细胞生长速率和致死性来研究酵母中基因功倉泛及分子机制(Baryshnikova et al, Synthetic Genetic Array (SGA) Analysis inSaccharomyces Cerevisiae and Schizosaccharomyces Pombe, 2010, Meth ods inEnzymology, Vol470: Guide to Yeast Genetics: 470:145-179.)并应用于一些化合物毒性的分析。而Boone等人利用SGA手段已绘制了酿酒酵母全基因组范围内的双基因缺失遗传相互作用图谱(Boone et al., The genetic landscape of a cell, 2010, FebsJournal277:7-8.)，其中可定量分析基因间相互作用的基因占全基因组的75%，为酿酒酵母遗传相互作用的研究提供了一个高通量、覆盖面全、意义重大的有力工具。但是这种以致死性为检测指标的分析，限制了对一些化合物的非致死性生物毒性的检测和分析，比如一些遗传毒性化合物，它们可能不会致死，但具有DNA损伤效应。如果将DNA损伤响应的生物传感器转入到酵母单基因缺失文库中，将会扩展文库的应用范围，开展高通量、特异性遗传毒性化合物易感基因群的筛选。
[0005]基于酵母DNA损伤响应的生物传感器是一种用于检测环境遗传毒性化合物的检测系统，该类型生物传感器的构建需具备以下两个基本元件:感应元件和连接于此后的效应元件。前者利用其自身功能可对DNA损伤进行响应，并开启后者的表达，从而产生可检测出的信号。基于酵母DNA损伤响应的生物传感器RNR3-yEGFP (专利申请号201210269407.5)、酵母灵敏型遗传毒性致癌物检测系统HUGl-yEGFP (专利申请号201210263302.9)即分别利用RNR3、HUG1两种基于DNA损伤转录应答的基因启动子作为生物传感器的感应元件，yEGFP酵母增强型绿色荧光蛋白作为效应元件构建而成，这两种生物传感器可检测多种遗传毒性致癌物，可应用于高通量的遗传毒性致癌物环境实时现场监测。
[0006]将酵母DNA损伤响应的生物传感器转入酵母单基因缺失文库已具备成熟的方法。由于酿酒酵母单倍体结合型可分为MATa和MATa两种，这两种结合型的酵母单倍体可进行杂交，杂交后的双倍体酿酒酵母细胞通过有丝分裂产生四个子囊孢子，再通过一系列抗性、营养型标签筛选可将外源质粒、细胞转入酵母单基因缺失文库中形成新的分子功能(具体转化构建方法见 Kainth et al., Comprehensive genetic analysis oftranscription factor pathways using a dual reporter gene system in buddingyeast.Methods, 2009, 48:258 - 264)，因此可利用该技术手段对现有的酵母单基因缺失文库进行遗传改造。
[0007]含有绿色荧光报告基因的生物传感器酵母可以用流式细胞仪进行检测和分选。流式细胞仪(Flow Cytometer)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测技术手段，可以高速分析大量细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，其应用范围非常广泛。其中细胞分选功能是流式细胞仪的重要应用之一，即含有荧光标记或染色的样品细胞悬液上机后，在高压作用下被仪器流动室中的鞘液所包裹，并有序排列，在超声振荡器的作用下含有样品细胞的液流被振荡成为一个个包裹细胞的小液滴，根据荧光强度信号的选择，仪器赋予所需分选的细胞一定正或负电荷，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，而不被选定的细胞液滴则不带电。带有正电或负电的液滴通过高压偏转板时发生不同角度偏转后，达到了分离细胞的目的；它能够根据每个细胞的光散射和荧光特性`，将特定的细胞从细胞群体中分选出来，因此流式细胞技术是分析细胞特性的一个应用手段。
[0008]具有不同荧光强度的酵母细胞意味着所具有的缺失基因对暴露的遗传毒性化合物的响应灵敏度不同，通过对其所具有的缺失基因的特异条形码序列的测定，就可以鉴定缺失基因的种类。DNA测序开始于上世纪70年代，第一代DNA测序技术以末端终止法为核心，又称之为化学测序法(Sanger法)，成型于上世纪80年代。近年来，出现了一种新的DNA测序方法一循环芯片测序法(cyclic-array sequencing),也可将其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”或“深度测序技术”。深度测序技术的核心思想就是边合成(或者连接)边测序；生成新DNA互补链时，要么加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP或者半简并引物，在合成或连接生成互补链时，释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。这一技术不断得到创新和改良，在保证基因组测序足够精确的前提下，操作程序的优化，测序通量急速增加，是传统Sanger法的几百到几千倍，测试的成本也呈现直线下降的趋势，只为原有技术的几十分之一。目前，深度测序技术已经在基因组学、转录组学、表观遗传学和环境基因组学中得到了极大的应用。
[0009]那些具有高荧光强度的酵母单基因缺失株的缺失基因可能与易感基因相关。易感基因主要是指和某种特定疾病的发生和发展具有关联的基因或多个基因，即在分子水平上发现某种疾病的发生与一些基因的表达差异水平存在这相互关联性(Tainsky et al., Genomic and proteomic biomarkers for cancer:Amultitude of opportunities,2009,Biochimica Et Biophysica Acta-Reviews onCancerl796 (2):176-193.)，易感基因这个概念同时也应用在遗传毒理等领域中，意指某基因突变会导致细胞对遗传毒性化合物响应灵敏度的改变。。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是，提供一种含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库，该文库分别将基于酵母DNA损伤响应的生物传感器RNR3-yEGFP、酵母灵敏型遗传毒性致癌物检测系统HUGl-yEGFP通过高通量酵母单倍体结合型杂交筛选方法转入进酵母单基因缺失文库中。该文库可应用于环境中遗传毒性化合物的检测，同时结合流式细胞仪分选技术以及深度测序技术可用于筛选、分析影响于遗传毒性效应相关的酵母易感基因群。本发明高通量、低成本、操作简单，并可作为分子工具进一步研究基因突变与环境危险因子评估预测的相互作用关系。
[0011]为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0012](一 )含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库的构建；
[0013]用高通量酵母单倍体结合型杂交筛选方法(Kainth et al., Comprehensivegenetic analysis of transcription factor pathways using a dual reporter genesystem in budding yeast.Methods，2009，48:258 - 264)分别将基于酵母 DNA 损伤响应的生物传感器RNR3-yEGFP (专利申请号201210269407.5)、酵母灵敏型遗传毒性致癌物检测系统HUGl-yEGFP (专利申请号201210263302.9)转入酿酒酵母单某因缺失t库(httD://www-seauence.stanford.edu/group/yeast deletion pro iect/deleti ons3.html)中，获得两个分别含有RNR3-yEGFP和HUGl-yEGFP遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库。
[0014]( 二)含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库的应用；
[0015]1、酵母单基因缺失遗传毒性检测系统文库暴露于遗传毒性化合物methylmethanesulphonate (MMS)中；
[0016]从上述(一)中获取文库后，我们将文库进行刮板，混合克隆。混合后的文库酵母菌株在选择性培养基中过夜培养，3(TC，200rpm;次日对菌液进行稀释至0D600=0.1，加入浓度剂量为0.01%的MMS，诱导8小时，随后收集细胞用PBS调整细胞浓度至0D600=0.2，加入PI进行染色，避光，4 °C保存直至流式细胞仪分选。
[0017]2、利用流式细胞仪分选技术对文库酵母菌株进行分选；
[0018]将上述2.1中MMS暴露下的文库酵母菌株利用流式细胞仪进行检测,根据流式细胞仪上FITC参数中所反馈的荧光信号按低中高三类荧光强度对文库酵母菌株进行分选，收集。每次分选收集到1O6-1O7个细胞。
[0019]3、分选后酵母菌株细胞基因组的提取及标记单基因缺失的条形码序列的扩增；
[0020]利用Omega酵母基因组提取试剂盒进行分离后酵母菌株细胞基因组的提取，获得不同荧光强度下分离后酵母菌株细胞的基因组复合物。由于酿酒酵母单基因缺失突变体文库基因信息已经获得，我们从 http://www-sequence.Stanford, edu/group/yeast_deletion_project/deletions 3.html中获得标记各单基因缺失突变株的条形码序列(barcode sequence)信息,从Ul和kanMX4间分别设计扩增条形码序列TAGl的上下游引物，扩增含TAGl在内约IOObp长度的片度。PCR反应条件为预变性94°C 3min;94°C 15sec,57°C 15sec，72°C 60sec 共 25 个循环，最后 72°C 3min 终延伸。[0021]4、利用深度测序手段对标记各单基因缺失突变株的条形码序列的测序、鉴定；
[0022]采用高通量的Illumina测序技术对不同荧光强度样品含有的条形码序列(TAGl)的DNA进行双末端(paired-end)测序。根据建库的信息，我们得到了上述六个样品含有TAGl的序列。我们用已知的TAGl序列与所得到的序列做比对，只有测序所得TAGl序列与已知TAGl的序列完全匹配时，认为测序所得结果为阳性。
[0023]使用相对丰度(relativefitness, RF)和突光细胞百分比(percentage of cellwith fluorescence, PCF)两个参数对所得到的某特异条形码序列进行定量分析。定义如下:
[0024]整体相对丰度RF= (NH+NM+NL) /NA*100 ；
[0025]高荧光相对丰度RFH=NH/NA*100 ；
[0026]中荧光相对丰度RFM=NM/NA*100 ;
[0027]低荧光相对丰度RFL=NL/NA*100 ；
[0028]整体荧光细胞百分比PCF= (NH+NM)/(NH+NM+NL)；
[0029]高荧光细胞百分比PCFH=NH/(NH+NM+NL)；
[0030]中荧光细胞百分比PCFM=NM/(NH+NM+NL)；
[0031 ] 其中NA为测序所得含有TAGI序列的总数目；而NH，匪，NL分别是在高(H)、中(M)、低(L)不同荧光强度样品所得到的某特异条形码的数目。
[0032]相关基因名称，基因序列，基因功能注释等犾取于Saccharomyces GENOMEDATABASE http://www.yeastgenome.0rg。
[0033]通过上述参数对所得到的某特异条形码序列进行定量分析后，在全酵母基因组中筛选得到一类影响影响与遗传毒性效应相关的酵母易感基因群。
[0034]本发明的优点与效果:
[0035]通过构建含有RNR3_yEGFP或HUGl-yEGFP遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库，结合流式细胞仪分选技术、深度测序技术分析影响遗传毒性效应的易感基因群。本发明的优点在于，可以筛选与遗传毒性相关的易感基因群，且高通量，针对性强，操作简便。这种以遗传毒性响应灵敏度检测为基础的筛选遗传毒性效应相关易感基因群的文库，其应用前景:一方面可作为分子工具研究这类影响检测系统灵敏的基因的遗传表达与外源遗传毒性化合物的暴露间的相互作用关系，建立特征性遗传毒性化合物的易感基因图谱，应用于环境风险因素的评价，另一方面可通过生物信息学的分析和数据挖掘，将酵母的遗传毒性相关易感基因与人类的癌症易感基因建立关联，为提高环境污染早期预警和健康风险评价水平提供新方法体系和科学依据。
【专利附图】
【附图说明】[0036]图1、含有生物传感器的酵母单基因缺失文库。
[0037]一个含有生物传感器的酵母单基因缺失文库包括4个1536位点的平板，图1A为含有HUGl-yEGFP遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库4-1板；图1B为含有RNR3-yEGFP遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库4_2板。
[0038]图2、利用流式细胞仪分选技术，按照荧光信号强度的不同将MMS暴露下酵母单基因缺失遗传检测文库中的细胞进行分选。
[0039]含有HUGl-yEGFP生物传感器的酵母单基因缺失文库在MMS暴露下yEGFP的诱导表达情况；(A-C)为阴性对照试验，即无丽S的暴露，其中(A)为细胞散点图；(B)为PI染色鉴定文库细胞的存活率，P2为活细胞群；(C) FITC通道下对yEGFP荧光信号的检测，P3为yEGFP诱导表达阴性细胞群；(D-F)为0.01%MMS暴露8小时，其中(D)为细胞散点图；(E)为PI染色鉴定文库细胞的存活率，P2为活细胞群；(F) FITC通道下对yEGFP荧光信号的检测，P3为yEGFP诱导表达阴性细胞群、P4为yEGFP诱导表达中等荧光强度细胞群、P5为yEGFP诱导表达高等荧光强度细胞群；
[0040]图3、分别含有基于酵母DNA损伤响应的生物传感器RNR3_yEGFP、酵母灵敏型遗传毒性致癌物检测系统HUGl-yEGFP的酵母单基因缺失文库按不同荧光强度分选所得样品中不同基因缺失细胞菌株相对丰度的聚类分析。
【具体实施方式】:
[0041]含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库的构建方法，该方法包含下列步骤:
[0042]a、将分别含有RNR3_yEGFP或HUGl-yEGFP遗传毒性生物传感器的BY4347野生型酵母细胞过夜培养的 菌液在SD-Lue长形固体培养平板中涂布，菌液尽量要浓，涂布一定要均均匀，放入30°C培养箱生长2天；
[0043]其中:SD_Lue平板的制备方法:称取1.7g酵母氮源无氨基酸无硫酸铵(YNB,YeastNitrogenBaseff/O Aminoacids and ff/0 Ammonium sulfate)，5g 硫酸铵(Ammoniumsulfate), 0.69g缺亮氨酸的氨基酸混合物(amino acid drop out mix)溶于双蒸水中，定容至0.95L，再加入20g琼脂粉。高压蒸汽灭菌后，加入已减压灭菌好的40%葡萄糖(glucose)至其终浓度为2% ；
[0044]b、利用克隆复制仪(RoToR colony replicator)以及1536位点针板分别将含有 YCplaclll-HUGl-yEGFP 和 YCplaclll_RNR3_yEGFP 重组质粒的 BY4347 菌复制在新鲜的SD-Lue固体平板上，30°C培养I天，形成1536个重组菌克隆；
[0045]C、由于5000多个单基因缺失酵母突变株保存在4个1536位点的固体平板上，每个位点上即是一个特异的单基因缺失突变株。利用克隆复制仪将单基因酵母突变菌株、含有遗传毒性检测系统的BY4347菌株克隆分别按先后复制在一个新的YAPD固体平板上进行杂交(mating), 30°C培养I天；
[0046]其中:YAPD平板的制备方法:称取20g蛋白胨(Peptone), IOg酵母浸粉(Yeastextract), 120mg腺嘌呤(adenine)溶于双蒸水中，定容至0.95L,再加入20g琼脂粉。高压蒸气灭菌后，加入已减压灭菌好的40%葡萄糖(glucose)至其终浓度为2% ；
[0047]d、将杂交后酵母细胞复制到含有G418抗性的SD-Lue营养缺陷固体平板上，进行双倍体筛选，30°C培养2天；
[0048]其中:SD_Lue+G418平板的制备方法:称取1.7g酵母氮源无氨基酸无硫酸铵(YNB, Yeast Nitrogen Base ff/0 Aminoacids and ff/0 Ammonium sulfate)，5g 硫酸铵(Ammonium sulfate),0.69g缺亮氨酸的氨基酸混合物(amino acid drop out mix)溶于双蒸水中，定容至0.95L，再加入20g琼脂粉。高压蒸汽灭菌后，加入已减压灭菌好的40%葡萄糖(glucose)至其终浓度为2%，待培养基温度降至50-60°C加入过滤灭菌的G418溶液至终浓度为200晕克/毫升；
[0049]e、重复步骤Id的抗性、营养型筛选，即再次将菌株复制在新鲜的含有G418抗性的SD-Lue 营养缺陷固体平板上，富集含有 YCplaclll-HUGl-yEGFP 和 YCplaclIl_RNR3_yEGFP的杂合单基因缺失突变菌株，30°C培养I天；
[0050]f、将步骤Ie筛选培养的双倍体突变菌株复制在出孢培养基中，潮湿环境中22°C培养5天；
[0051]其中出孢培养基的配制方法:称取20g琼脂糖溶于双蒸水中，定容至0.95L，高压蒸汽灭菌后加入50mL已过滤灭菌的溶解了 3g醋酸钾的溶液以及ImL已过滤灭菌的20%棉子糖(raffinose)储液；
[0052]g、在含有 canavanine, S-AEC, G418 筛选抗性的 SD-Leu-Arg-His-Lys 营养缺陷型培养基中筛选还有ΜΑΤ α结合型的单倍体突变菌株，30°C培养3天；
[0053]其中SD-Leu-Arg-His-Lys+canavanine+S_AEC+G418 平板的制备方法:称取
1.酵母氣源无氛基酸无硫酸按(YNB, Yeast Nitrogen Base ff/0 Aminoacids and ff/0 Ammonium sulfate)，Ig谷氨酸单钠(MSG)，1.6g缺亮氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸混合物溶于双蒸水中，`定容至0.95L，再加入20g琼脂粉。高压蒸汽灭菌后，加入已减压灭菌好的40%葡萄糖(glucose)至其终浓度为2%，待培养基温度降至50_60°C加入canavanine溶液至终浓度为50毫克/毫升，S-AEC溶液至终浓度为50毫克/毫升及G418溶液至终浓度为200晕克/毫升；
[0054]h、在含有 canavanine, S-AEC, G418, hygromycin B 筛选抗性的SD-Leu-Arg-His-Lys营养缺陷型培养基中再次筛选ΜΑΤ α结合型的单倍体突变菌株，30°C培养2天；
[0055]其中SD-Leu-Arg-His-Lys+canavanine+S_AEC+G418+hygromycin B 平板的制备方法:称取L 7g酵母氮源无氨基酸无硫酸铵(YNB, Yeast Nitrogen Base ff/0 Aminoacidsand ff/0 Ammonium sulfate)，lgMSG, 1.6g缺亮氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸混合物溶于双蒸水中，定容至0.95L，再加入20g琼脂粉。高压蒸汽灭菌后，加入已减压灭菌好的40%葡萄糖(glucose)至其终浓度为2%，待培养基温度降至50_60°C加入canavanine溶液至终浓度为50毫克/毫升，S-AEC溶液至终浓度为50毫克/毫升，G418溶液至终浓度为200毫克/毫升及hygromycin B溶液至终浓度为300毫克/毫升；
[0056]1、重复步骤lh，继续30°C培养2天。这一步的目的是为了继续富集最终得到的含有遗传毒性检测系统的单倍体单基因缺失突变株文库。
[0057]含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库的应用包含下列步骤:
[0058]a、利用涂布棒，加入 SD-Leu-Arg-His-Lys+canavanine+S_AEC+G418 培养基将上述含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库中的所有克隆进行刮板，混合；[0059]b、取刮板后的酵母单基因缺失遗传毒性检测文库中的所有克隆混合液，接种于SD-Leu-Arg-His-Lys+canavanine+S-AEC+G418 培养基中稀释至细胞密度 0D600 为 0.5，在30200转/分钟的条件下，振荡培养12小时，得到酵母单基因缺失遗传毒性检测文库克隆混合液；
[0060]C、将12小时培养后的酵母菌液用新鲜的YPD选择性培养液稀释到细胞密度0D_为0.1，加入遗传毒性化合物MMS，培养8小时；
[0061]d、取出经丽S受试培养8小时后的酵母单基因缺失遗传毒性检测文库克隆混合液，4000转/分钟离心2分钟，弃上清；加入新鲜PBS溶液，悬浮沉淀物；再次4000转/分钟离心2分钟，弃上清；重新加入新鲜PBS，至细胞密度OD6tltl为0.2 ;
[0062]e、加入终浓度为I毫克每毫升的溴化丙啶(PI)溶液3微升，混匀，置于冰上，黑暗保存直至使用流式细胞仪进行分选。
[0063]f、利用流式细胞仪对样品进行检测。同时设定FITC及PE两激光通道，微调电压，如FITC荧光信号直方图所示，将低、中、高三种荧光强度信号门中细胞进行分选，分别分选到约IO7个细胞；
[0064]g、从分选后酵母菌株细胞中中提取基因组DNA (具体提取方法参照Omega酵母基因组提取试剂盒说明)；
[0065]h、扩增标记单基因缺失的条形码序列；
[0066]利用PCR技术，以4a中提取的分选后酵母菌株细胞中中提取基因组DNA作为扩增模板，通过上游引物 Ul: GAT GTC CAC GAG GTC TCT 和下游引物 Dl: GCG CGC CTT AAT TAACCC GG，将一段约93bp的DNA片段扩增出来，其中包含标记单基因缺失的条形码序列；
[0067]其中:PCR的条件`为-MV 3分钟-MV 15秒，55°C 15秒，72°C I分钟，30个循环；72 0C 3分钟；
[0068]1、采用高通量的Illumina测序技术对不同荧光强度样品中的标记单基因缺失的条形码序列(TAGl)的DNA进行双末端(paired-end)测序；
[0069]j、得到不同荧光强度样品中标记单基因缺失的条形码序列信息后，利用已知的TAGl序列与所得到的序列做比对，当测序所得TAGl序列与已知TAGl的序列完全匹配时，即认为测序所得结果为标记单基因缺失的条形码序列；
[0070]k、采用相对丰度(relative fitness, RF)和突光细胞百分比(percentage ofcell with fluorescence,PCF)两个参数对所得到的某特异条形码序列进行定量分析。定义如下:
[0071 ]整体相对丰度 RF= (NH+NM+NL) /NA*100 ；
[0072]高荧光相对丰度RFH=NH/NA*100 ；
[0073]中荧光相对丰度RFM=NM/NA*100 ;
[0074]低荧光相对丰度RFL=NL/NA*100 ；
[0075]整体荧光细胞百分比PCF= (NH+NM)/(NH+NM+NL)；
[0076]高荧光细胞百分比PCFH=NH/(NH+NM+NL)；
[0077]中荧光细胞百分比PCFM=NM/(NH+NM+NL)；
[0078]其中NA为测序所得含有TAGl序列的总数目；而NH，NM，NL分别是在不同荧光强度样品所得到的某特异条形码的数目。
【权利要求】
1.含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库，其特征在于，该文库用高通量酵母单倍体结合型杂交筛选方法分别将基于酵母DNA损伤响应的生物传感器和酵母灵敏型遗传毒性致癌物检测系统转入酿酒酵母单基因缺失文库中，获得两个分别含有RNR3-yEGFP和HU GhyEGFP遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库。
【文档编号】C12Q1/02GK103510161SQ201310360655
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年8月16日 优先权日:2013年8月16日
【发明者】戴和平, 萧伟, 魏婷, 汤花梅, 张超, 许鑫, 袁丽, 张晓华 申请人:中国科学院水生生物研究所