一种基于氨基酸末端羧基的漆酶改性方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种基于漆酶氨基酸残基末端的羧基(-COOH)与L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐的氨基发生交联反应使漆酶活性、稳定性提高的改性方法，包括将漆酶、L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐在一定温度下进行混合反应，得到改性后的漆酶。与未改性漆酶相比，改性漆酶的活性、稳定性得到提高。该改性漆酶可用于再生植物纤维改性，在使再生植物纤维所抄造纸页强度性能提高的同时可节省漆酶用量。
【专利说明】一种基于氨基酸末端羧基的漆酶改性方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及制浆造纸及生物工程领域，具体涉及一种漆酶活性、稳定性提高的改性方法及改性漆酶在再生植物纤维改性的应用。
【背景技术】
[0002]与原生植物纤维相比，再生植物纤维的润胀性能、纤维强度和纸页物理性能均有下降。再生植物纤维强度的降低大大影响了其回收利用，为了提高再生植物纤维的强度性能，提高其利用水平和价值，有必要对其进行改性处理。在再生植物纤维改性的众多方法中，漆酶及漆酶介体体系是目前较为理想的一种再生植物纤维生物改性方法。其优点有:
(I)反应条件温和；(2)对纤维造成的损伤很少；(3)对环境不会造成二次污染。
[0003]漆酶是一类多铜氧化还原酶，可以催化氧化氨基苯酚、多酚、聚胺、芳基二胺和部分无机离子等，广泛存在于植物、真菌、细菌中。由于漆酶的催化氧化反应只需空气中的氧气，副产物只有水，被称为“绿色催化剂”。另外，由于漆酶具有化学试剂所没有的一些独特性质，其在食品工业、化学分析、医学、环保、造纸工业等方面都有很好的应用潜能。然而由于漆酶在高温和其它极端环境下(如pH、温度、盐浓度或酶系统中外来物质的存在)不稳定、极易失活限制了它在工业上的应用。因此，有必要对漆酶进行一定的改性处理，使其活性、稳定性得以提闻。
[0004]研究者已采用聚乙二醇、乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、葡聚糖、右旋糖苷、邻苯二甲酸酐、丁二酸酐、马来酸酐、柠康酸酐对漆酶进行了化学改性，研究了它们的改性效果。研究显示这些物质化学改性后的漆酶稳定性在一定程度上得到了改善，但是改性酶的活性低于未改性酶；或者化学改性后漆酶活性在一定程度上得到了改善，但是改性酶的稳定性下降了。另外，有 些改性后的漆酶活性和稳定性均提高了，但其提高百分比不大，而且目前的改性方法步骤繁琐，反应条件苛刻，处理成本较高，不适用于工厂实际应用。例如，右旋糖苷改性漆酶前，需用活化剂溴化氰进行活化，且需要严格控制右旋糖苷与溴化氰的用量和比例，溴化氰及其产物右旋糖苷亚胺碳酸盐有毒，而且亚胺碳酸盐在水溶液中不稳定，活化的右旋糖苷须通过凝胶色谱进行脱盐处理并须立即使用，此外，右旋糖苷活化时间较长，通常为18?24h，活化产物见光容易分解，所以活化和修饰过程都必须避光进行。本发明用L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐试剂来改性漆酶，不会引入和产生有毒物质，在漆酶活性和稳定性提高的同时，所需改性时间较短。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一解决了现有漆酶改性存在的问题和不足，提出了一种新的漆酶活性、稳定性提高的改性方法。
[0006]本发明通过以下技术方案予以实现:
[0007]( I)向原漆酶水溶液中加入L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐水溶液和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液，进行反应；[0008](2)反应完成后，用醋酸/醋酸钠缓冲溶液或磷酸氢二钾/柠檬酸缓冲溶液透析，得到改性后的漆酶。
[0009]上述方法中，步骤(I)所述原漆酶水溶液中溶质原漆酶来源于可以产生漆酶的植物、真菌或细菌中任一种，包括如桃树、灵芝、嗜热菌、曲霉菌或毛栓菌。
[0010]上述方法中，步骤(I)所述L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐用量为相对于原漆酶固体量的质量百分数0.001%-10%。
[0011 ] 上述方法中，步骤(I)所述1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐用量为相对于原漆酶固体量的质量百分数0.001%-2%。
[0012]上述方法中，步骤(I)所述原漆酶水溶液和L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐水溶液均用pH为2.0-6.5的磷酸二氢钾/磷酸氢二钾(ΚΗ2Ρ04/Κ2ΗΡ04)缓冲溶液配制。
[0013]上述方法中，步骤(I)所述反应的温度为2_25°C，所述反应的反应时间为
0.5-12h。
[0014]上述方法中，步骤(I)所述反应是在搅拌条件下进行。
[0015]上述方法中，步骤(2)所述醋酸/醋酸钠缓冲溶液或磷酸氢二钾/柠檬酸缓冲溶液的 pH 为 3.5-6.0。
[0016]上述方法中，步骤(2)所述透析的时间为12_72h。
[0017]本发明的又一目的 在于解决现有技术的不足之处而提供一种改性漆酶在再生植物纤维改性中的应用。
[0018]本发明所采用的反应原理:
[0019]首先用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化漆酶中氨基酸残基末端的羧基(-C00H)，然后活化的漆酶与L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐中的氨基发生交联反应形成肽键，使得漆酶链上的活性基团羧基得以保护，漆酶天然构象产生一定的刚性，不易伸展失活，并减少了漆酶分子内部基团的热振动，使得漆酶活性、热稳定性得到提高。
[0020]与现有技术相比较，本发明具有以下优点:
[0021](I)本发明的改性方法不但能使漆酶活性得到大幅度提高，而且漆酶稳定性也有明显提高，应用于再生植物纤维改性中可明显减少漆酶使用量，这将带来巨大的社会效益、经济效益和环境效益。
[0022](2)本发明的漆酶改性方法操作步骤简单，所需化学药品加入量少，无有毒化学药品摄入，所需反应条件温和。
【具体实施方式】
[0023]为使本发明更加容易理解，以下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0024]实施例1
[0025]改性步骤:将5mL、10mg/mL漆酶液(漆酶SUKALacc由曲霉菌产生)，与0.4mg/mL、5mL L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐溶液混合，向混合溶液中加入1.0mgl-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 l-Ethyl-3-(3-dimethyl laminopropyl) carbodiimidehydrochloride (EDC),在25°C、磁力搅拌条件下反应4h,其中漆酶溶液和L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐溶液均用PH为5.8、浓度为0.06mol/L的磷酸二氢钾/磷酸氢二钾(ΚΗ2Ρ04/Κ2ΗΡ04)缓冲溶液配制。反应完成后，将混合溶液转入透析袋中，在PH为5.0、浓度0.2mol/L的磷酸氢二钾/柠檬酸缓冲溶液中室温下透析48h除掉多余的L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和EDC，得到改性后漆酶溶液，定容到25mL，冷冻保存备用，测定原漆酶与改性漆酶的活性和热稳定。
[0026]漆酶活性和半衰期分析:漆酶活性由2，2’ -联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)的氧化确定。漆酶活性定义:定义Imin催化I μ mo I ABTS的酶量为一个酶活单位(U)。具体操作步骤为:准确移取pH为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲溶液、0.5mmol/L ABTS各IOmL,混合，摇匀，30°C水浴。测试在紫外分光光度计中进行，取上述混合试剂ImL于比色皿中，420nm处调零。准确加入待测酶液0.5mL,立即记录前3min吸光度的变化，取平均值，折算成每分钟的吸光度变化(OD42tl变化)。
[0027]漆酶活性计算:每升酶液所含有的酶活量计算公式如下:
[0028]
【权利要求】
1.一种基于氨基酸末端羧基的漆酶改性方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)向原漆酶水溶液中加入L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐水溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液，进行反应；(2)反应完成后，用醋酸/醋酸钠缓冲溶液或磷酸氢二钾/柠檬酸缓冲溶液透析，得到改性后的漆酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)所述原漆酶水溶液中溶质原漆酶来源于可以产生漆酶的植物、真菌或细菌中任一种，包括如桃树、灵芝、嗜热菌、曲霉菌或毛栓菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)所述L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐用量为相对于原漆酶固体量的质量百分数0.001%-10%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐用量为相对于原漆酶固体量的质量百分数0.001%-2%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)所述原漆酶水溶液和L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐水溶液均用PH为2.0-6.5的磷酸二氢钾/磷酸氢二钾(KH2PO4/ K2HPO4)缓冲溶液配制。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)所述反应的温度为2-25°C，所述反应的反应时间为0.5-12 h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征`在于步骤(I)所述反应是在搅拌条件下进行。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述醋酸/醋酸钠缓冲溶液或磷酸氢二钾/柠檬酸缓冲溶液的PH为3.5-6.0。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述透析的时间为12-72h。
10.权利要求1所述的一种基于氨基酸末端羧基的漆酶改性方法所制得的改性后的漆酶应用于再生植物纤维改性。
【文档编号】C12N9/02GK103436501SQ201310380060
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年8月27日
【发明者】万金泉, 陈杨梅, 张全升, 马邕文, 王艳, 黄明智 申请人:华南理工大学