多片段dna的酵母快速组装方法
【专利摘要】本发明公开了一种多片段DNA的酵母快速组装方法，包括以下步骤：（1）将多个含有同源臂的DNA分子与线性化的酵母穿梭载体共转化酵母；（2）将整个筛选培养板上的全部转化后的酵母菌落洗脱下来，离心，弃上清，得到转化后的酵母菌细胞；（3）提取步骤（2）获得的酵母菌细胞的质粒DNA，转化大肠杆菌感受态细胞；（4）筛选大肠杆菌克隆，得到大片段DNA。本发明的方法组装大片段DNA分子的速度快、简便可行、成功率高、成本低，效率高、易操作，可将多个小片段DNA分子组装成一个大片段DNA分子，有利于进行工业化规模扩大，用途广泛。
【专利说明】多片段DNA的酵母快速组装方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及合成生物学领域，基因组合成技术，代谢工程领域，具体地是涉及多片 段DNA的酵母快速组装方法及该方法合成的大片段DNA及应用。
【背景技术】
[0002] 合成大片段DNA分子的技术意义重大，一方面可以用于合成基因组的结构单元， 另一方面可以用于组装对人类有重大生产应用价值的代谢通路。
[0003] 如今的生物学发展已经逐步进入全基因组合成时代，合成基因组学对于人们认识 生命，改造生命更好的为人类社会服务有着重大意义。基因组合成是合成底盘细胞的重要 方面，在设计方面：人工设计作为底盘生物必需的生长功能基因和表达功能基因及其碱基 编码方式、这些基因最优化合理的连接方式和基因间调控；在合成方面：发展DNA大片段和 染色体的高保真合成和组装技术，合成并组装基因组。2008年，J. Craig Venter小组又化学 合成了生殖道支原体（Mycoplasma genitalium)的基因组，长度约580Kb ;2010年，J. Craig Venter小组将人工设计、合成、组装好的丝状支原体（Mycoplasma mycoides)移植入受体细 胞中，一段时间后，该移植细胞完全由合成的基因组控制；2011年Jef Boeke小组成功合成 并导入了酿酒酵母9号染色体的右臂，合成基因组学开始进入真核细胞领域。
[0004] 天然化合物是来源于生物体内的次级代谢产物，很多具有重要的生理活性及医 疗保健作用，也是许多临床药物的源头。如二萜类化合物紫杉醇是著名的抗癌药；倍半萜 类化合物青蒿素为当今最有效的抗疟药；丹参酮则是主要的心血管类中药。天然化合物 需求巨大，传统生产方法这些传统方法工艺流程复杂、能耗高、污染大，而且对野生植物资 源造成严重破坏。如今使用合成生物学的方法构建组装完整的天然化合物代谢途径在酵 母菌或大肠杆菌等微生物中可以更为高效地合成这些天然化合物。加州大学伯克利分校 的Jay Keasling小组以大肠杆菌和酵母菌为宿主高效的生产青蒿素；MIT大学的Gregory Stephanopoulos小组在大肠杆菌中生产紫杉醇前体物紫衫二烯已经达到lg/L。全合成天 然化合物微生物代谢通路已成为世界热点领域。
[0005] 对于DNA全合成技术，首先是通过PCR反应合成的，其长度往往小于lkb。当前，要 将多个Ikb的小片段组装一个大片段DNA分子最常用的组装DNA技术是通过重叠延伸PCR 技术来将小片段DNA分子融合为大片段DNA分子，效率受到DNA聚合酶的扩增能力和保真 性以及序列的二级结构。虽然已经有能够扩增较长片段的高保真DNA聚合酶(例如Phusion DNA聚合酶)，但是当DNA大小超过6kb时反应已经变得很困难。传统的克隆技术主要是 通过用内切酶消化得到含有互补粘性末端的两种DNA，并用DNA连接酶将这两种DNA分子 拼接为一个DNA分子，这种方法每次只能组装两种DNA分子，如果要将多个DNA分子组装 在一起就要做好多轮亚克隆，时间周期很长，而且反复的酶切连接反应会增加合成的成本。 酵母细胞内部的同源重组机制已经得到广泛的研究，已被广泛用于构建酵母人工合成染色 体（YACs)。一些研究表明酵母细胞可以摄入多个DNA片段，可装配四或者五个重叠的DNA 片段连接到载体 DNA 上（Raymond，C.K.et.al. Biotechniques (1999) 26:134 - 138)。但是 现有的酵母重组技术都要逐个挑取酵母单菌落培养筛选，线性化酵母载体要经过PCR获得 (Gibson, D G. et. al. Science (2008) 5867:1215 - 1220)，整体时间会相应的延长，保真度会 下降，操作的复杂性和工作量都会增加。因此如何能够低成本，快速高通量筛选正确克隆成 为酵母组装大片段DNA分子方法的关键技术。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供多片段DNA的酵母快速组装方法。
[0007] 本发明的第二个目的是提供多片段DNA的酵母快速组装方法组装的大片段DNA。
[0008] 本发明的第三个目的是提供多片段DNA的酵母快速组装方法组装的大片段DNA的 用途。
[0009] 本发明的技术方案概述如下：
[0010] 一种多片段DNA的酵母快速组装方法，包括以下步骤：
[0011] (1)将多个含有同源臂的DNA分子与线性化的酵母穿梭载体共转化酵母；
[0012] (2)将整个筛选培养板上的全部转化后的酵母菌落洗脱下来，离心，弃上清，得到 转化后的酵母菌细胞；
[0013] (3)提取步骤（2)获得的酵母菌细胞的质粒DNA，转化大肠杆菌感受态细胞；
[0014] (4)筛选大肠杆菌克隆，得到大片段DNA。
[0015] 所述含有同源臂的DNA分子的同源臂至少是40个碱基的特异性同源臂。
[0016] 所述线性化的酵母穿梭载体优先的是使用内切酶对酵母穿梭载体进行单酶切后 获得。
[0017] 所述酵母穿梭载体优选为PRS416或pRS413。
[0018] 上述多片段DNA的酵母快速组装方法组装的大片段DNA。
[0019] 上述多片段DNA的酵母快速组装方法组装的大片段DNA的用途。
[0020] 所述用途为组装合成基因组结构单元。
[0021] 所述用途为生产β -胡萝卜素。
[0022] 所述用途为生产紫色杆菌素。
[0023] 本发明的优点：
[0024] 本发明的方法组装大片段DNA分子的速度快、简便可行、成功率高、成本低，效率 高、易操作，可将多个小片段DNA分子组装成一个大片段DNA分子，有利于进行工业化规模 扩大，用途广泛。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1是本发明的一种多片段DNA的酵母快速组装方法及应用合成流程示意图。
[0026] 图2是本发明实施例1酵母组装Κ4 - 4的示意图。
[0027] 图3是本发明实施例1酵母组装Κ4 -4PCR得到五个DNA片段琼脂糖凝胶电泳图。
[0028] 图4是本发明实施例1酵母组装Κ4 - 4转化大肠杆菌蓝白斑筛选。
[0029] 图5是本发明实施例1酵母组装Κ4 - 4菌落PCR琼脂糖凝胶电泳图。
[0030] 图6是本发明实施例1酵母组装Κ4 - 4质粒DNA酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。
[0031] 图7是本发明实施例1酵母组装Κ4 - 4合成基因组结构功能图。
[0032] 图8是本发明实施例1合成大片段替换酵母基因组后在SC -LEU筛选培养板生长 图。
[0033] 图9是本发明实施例1合成基因组PCR验证琼脂糖凝胶电泳图。
[0034] 图10是本发明实施例2合成紫色杆菌素代谢通路PCR得到6种小分子DNA琼脂 糖凝胶电泳图。
[0035] 图11是本发明实施例2合成紫色杆菌素代谢通路结构图以及菌落颜色对比图。
[0036] 图12是本发明实施例2合成紫色杆菌素代谢通路酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。
[0037] 图13是本发明实施例2合成紫色杆菌素代谢通路发酵产物检测图。
[0038] 图14是本发明实施例3合成β -胡萝卜素代谢通路PCR得到7种小分子DNA琼 脂糖凝胶电泳图。
[0039] 图15是本发明实施例3合成β -胡萝卜素代谢通路结构图以及菌落颜色对比图。
[0040] 图16是本发明实施例3合成β -胡萝卜素代谢通路酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。
[0041] 图17是本发明实施例3合成β -胡萝卜素代谢通路发酵产物检测图。
【具体实施方式】
[0042] 下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。
[0043] 本领域的技术人员应该理解，这些实施例只是用于说明，而不限于本发明的范围。 在不背离权利要求书的范围的条件下，本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各 种修改和改进，这些修改和改进也属于本发明的保护范围。另外除非特别指明，下面实施 例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获 得；
[0044] 实施例1 :一种多片段DNA的酵母快速组装方法，包括以下步骤：
[0045] (1)将多个含有同源臂的DNA分子与线性化的酵母穿梭载体共转化酵母：
[0046] ①以SEQ ID NO. 1所示的K410F为上游引物，SEQ ID NO. 2所示的K410R为下游引 物，以SEQ ID NO. 3所示的pEasy - K410为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR 获得DNA分子片段K410;以SEQ ID NO. 4所示的K411F为上游引物，SEQ ID NO. 5所示的 K41 IR为下游引物，以SEQ ID NO. 6所示的pEasy - K411为模板，使用Phusion高保真DNA 聚合酶进行PCR获得DNA分子片段K411;以SEQ ID NO. 7所示的K412F为上游引物，SEQ ID NO. 8所示的K412R为下游引物，以SEQ ID NO. 9所示的pEasy -K412为模板，使用Phusion 高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段K412 ;以SEQ ID NO. 10所示的K413F为上 游引物，SEQ ID NO. 11所示的K413R为下游引物，以SEQ ID NO. 12所示的pEasy - K413为 模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段K413 ;以SEQ ID NO. 13 所示的K414F为上游引物，SEQ ID NO. 14所示的K414R为下游引物，以SEQ ID NO. 15所示 的pEasy -K414为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段K414 ; 所述上下游引物均金唯智公司合成，质粒模板也由金唯智公司全合成。
[0047] K410的上游引物K410F含有与酵母穿梭载体pRS413上EcoRI位点上游40bp同源 的序列413F，K414的下游引物K414R含有与酵母穿梭载体pRS413上EcoRI位点下游40bp 同源的序列 413R ;413F 由 SEQ ID NO. 16 所示，413R 由 SEQ ID NO. 17 所示。
[0048] 使用 50ul 的PCR反应体系：ddH2028. 5ul, 5XPCR缓冲液 10μ 1，2· 5mM dNTPs5y 1， M13F 上游引物（10μΜ)2· 5μ 1，M13R 下游引物（10μΜ)2· 5μ l，Phusion DNA 聚合酶 0· 5μ 1， 模板 DNAlul。PCR 反应条件：98°C预变性 Imin ;98°C变性 15s ;51°C?66°C退火 15s ;72°C 延伸30s ;30个循环；72°C延伸5min，4°C保存。跑胶检验条带大小，见图3。
[0049] ②使用EcoRI对pRS413进行线性化。50ul的反应体系如下：pRS413质粒DNAlug， IOX cutsmart Buffer5ul, ddH20 补足到 49ul，NEB EcoRI 内切酶 lul。37°C反应 1 小时， 80°C热失活5分钟，4°C保存。
[0050] ③取步骤①获得5种DNA片段K410, K411，K412, K413和K414各5ul与步骤②获 得的片段IOul混合，DNA组装结构如图2所示，共同进行酿酒酵母BY4741转化：实验证明， 酿酒酵母不限于这一种。
[0051] 酿酒酵母转化步骤：
[0052] 挑单菌落，30°C过夜培养；
[0053] 接种 6. 250D600 的过夜培养液到 50ml YPD 中（0· 1250D600/ml)。置 30°C、200r/ min培养，至0D600达到0. 5 (大约需要4 - 5hrs);
[0054] 5000rpm离心2min，收集细胞；用IOml无菌水重悬并清洗细胞，同上离心，收集细 胞；用IOmlO. IM LiOAc重悬细胞，同上离心，收集细胞；将上清倒出，剩余的LiOAc重悬细 胞，并转移到1.5ml EP管内，置于冰上,得到感受态细胞。
[0055] 准备转化体系：
[0056]
【权利要求】
1. 一种多片段DNA的酵母快速组装方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 将多个含有同源臂的DNA分子与线性化的酵母穿梭载体共转化酵母； (2) 将整个筛选培养板上的全部转化后的酵母菌落洗脱下来，离心，弃上清，得到转化 后的酵母菌细胞； (3) 提取步骤（2)获得的酵母菌细胞的质粒DNA，转化大肠杆菌感受态细胞； (4) 筛选大肠杆菌克隆，得到大片段DNA。
2. 根据权利要求1所述的一种多片段DNA的酵母快速组装方法，其特征在于所述含有 同源臂的DNA分子的同源臂至少是40个碱基的特异性同源臂。
3. 根据权利要求1所述的一种多片段DNA的酵母快速组装方法，其特征在于所述线性 化的酵母穿梭载体是使用内切酶对酵母穿梭载体进行单酶切后获得。
4. 根据权利要求1或3所述的一种多片段DNA的酵母快速组装方法，其特征在于所述 酵母穿梭载体为PRS416或pRS413。
5. 权利要求1 - 4之一的一种多片段DNA的酵母快速组装方法组装的大片段DNA。
6. 权利要求5的大片段DNA的用途。
7. 根据权利要求5的用途，其特征是所述用途为组装合成基因组结构单元。
8. 根据权利要求5的用途，其特征是所述用途为生产0 -胡萝卜素。
9. 根据权利要求5的用途，其特征是所述用途为生产紫色杆菌素。
【文档编号】C12N15/10GK104419701SQ201310389392
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2013年8月29日
【发明者】元英进, 贾斌, 林秋卉, 张文倩, 张金来, 李炳志, 其他发明人请求不公开姓名 申请人:天津大学