甘蓝型油菜及其亲本物种甘蓝和白菜mapk1基因家族及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程【技术领域】，特别涉及甘蓝型油菜及其亲本物种甘蓝和白菜MAPK1基因家族及其应用；所述包括甘蓝MAPK1基因和白菜MAPK1基因，所述甘蓝型油菜MAPK1基因家族包括2个成员：BnMAPK1-1基因和BnMAPK1-2基因；芸薹属4个MAPK1基因之间具有较高的同源性；本发明还公开了上述基因家族在植物分子育种中的应用，通过构建正义超量表达植物载体，转化甘蓝型油菜品种中油821后，获得12株转基因植株。与非转基因的外植体对照相比，转基因植株生长发育加快，植株粗壮，同时抗性提高，是油菜品种改良的新资源。
【专利说明】甘蓝型油菜及其亲本物种甘蓝和白菜MAPK1基因家族及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，特别涉及甘蓝型油菜(Brassica napus)及其亲本物种甘蓝(Brassica oleracea)和白菜(Brassica rapa)MAPKl基因家族及其应用。
【背景技术】
[0002]芸薹属(Brassica)是芸薹科(Brassicacease)最重要的一个属,含有世界性的重要蔬菜、油料和观赏作物，如白菜(B.rapa)、甘蓝(B.0leracea)和甘蓝型油菜(B.napus),而且甘蓝型油菜是由白菜和甘蓝通过天然种间杂交并加倍而形成的异源四倍体。拟南芥(Arabidopsis thaliana)则是来自芸薹科的研究最深入的模式植物。染色体分子标记共线性研究发现，芸薹属植物之间以及芸薹属与拟南芥之间均存在基因组水平和基因水平的保守性。同为芸薹科的模式植物拟南芥功能基因组学的研究成果，为推动芸薹属植物重要性状的分子机理研究和比较基因组学研究提供了重要参考。
[0003]蛋白质磷酸化和去磷酸化是调控细胞响应各种外源信号的重要机制，MAPKs (促分裂原活化蛋白激酶)级联途径在内源、外源信号传导过程中发挥着重要的作用。植物中的MAPK通路是多种生长信号跨膜传递的共同通路，它可以将外源刺激转入细胞内并引发细胞应答，从而调控基因表达、细胞生长 发育、细胞分裂分化以及凋亡等过程，因此，植物MAPK通路越来越受到人们的关注。MAPKl基因目前只在模式植物拟南芥中有研究，而在甘蓝型油菜、甘蓝和白菜等芸薹属植物MAPKl基因的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性、诱导表达特性和在基因工程中的应用等都未见报道。本研究通过克隆出甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPKl基因，对其进行基本的生物信息学研究和表达特征研究，并在甘蓝型油菜黑籽品种中正义超量表达MAPKl基因家族的一个成员，研究结果有助于进一步了解植物MAPK7的功能，为油菜油菜品种改良提供重要参考。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜及其亲本物种甘蓝和白菜MAPKl基因家族。
[0005]为达到上述目的，本发明分别克隆了甘蓝型油菜、甘蓝、白菜MAPKl基因家族成员的全长cDNA和对应的基因组序列，并进行了系统的生物信息学分析和功能比较基因组学研究。结果显示:
[0006]所述甘蓝MAPKl (BoMAPKI)基因全长cDNA序列如SEQ ID N0.1所示；
[0007]所述白菜MAPKl (BrMAPKl)基因全长cDNA序列如SEQ ID N0.3所示；
[0008]所述甘蓝型油菜MAPKl (BnMAPKl)基因家族包括2个成员:ΒηΜΑΡΚ1_1基因和BnMAPKl-2基因；所述BnMAPKl-1全长cDNA序列如SEQ ID N0.5所示；所述BnMAPKl-2全长cDNA序列如SEQ ID N0.7所示。
[0009]所述BoMAPKI的基因组DNA序列如SEQ ID N0.2所示；[0010]所述BrMAPKl的基因组DNA序列如SEQ ID N0.4所示；
[0011]所述BnMAPKl-1的基因组DNA序列如SEQ ID N0.6所示，所述BnMAPKl-2的基因组DNA序列如SEQ ID N0.8所示。
[0012]芸薹属MAPKl基因家族4个成员的4条MAPKl基因之间具有较高的同源性，基因组DNA水平一致率为91.9-99.9%，编码区水平的一致率为96.7_100%，基因组DNA水平一致率为91.9-99.9%,编码区水平的一致率为96.7-100% ;芸薹属MAPKl基因家族4个MAPKl成员与与拟南芥AtMPKl基因间因组DNA水平一致率为57.9-59.0%，编码区水平的一致率为89.3-89.4%，一致率为94.3-94.9%，相似率为96.0-96.5%。核酸水平的序列比对、系统发生聚类、特征性变异碱基、特征性变异氨基酸等方面都表明，芸薹属4条MAPKl基因都是AtMPKl基因的垂直同源基因，具有相似的结构特征。
[0013]实时荧光定量PCR检测发现，三个物种中MAPKl基因在检测的器官中均有表达。在甘蓝型油菜中，MAPKl基因在根和茎中的表达量较高，蕾和花中的表达量则较低。在甘蓝中，MAPKl基因在叶片的表达量最高，而在其它器官中的表达量差别不大，均约为叶片中的1/2。在白菜中，MAPKl基因主要在根中表达，其它器官中的表达量很低，在蕾和花中只检测到微弱的表达。
[0014]实时荧光定量PCR还检测发现，在不同的外源诱导条件下，甘蓝型油菜MAPKl有不同的应答反应。在植物激素脱落酸(abscisic acid, ΑΒΑ),水杨酸(salicylic acid, SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理后，甘蓝型油菜MAPKl基因的表达量均有所上升，并在2h时达到最高。在逆境条件下，甘蓝型油菜MAPKl基因的表达也发生变化。在损伤(wounding)和高温(heat)条件下，甘蓝型油菜MAPKl基因的表达量发生上调，并在2h时达到最高。在H2O2处理后，甘蓝型油菜MAPKl基因的表达迅速上调，在0.5h时达到最高，而在Ih后的表达量则保持稳定。在真菌核菌盘(Sclerotinia sclerotiorum)的诱导下,甘蓝型油菜MAPKl基因上调相对较为缓慢，在3h时无明显的上调，而在6h时则达到最大，随后表达量下降，在48h时恢复至原来的水平。
[0015]本研究分析表明，甘蓝型油菜MAPKl能够被机械损伤，茉莉酸甲酯(MeJA)，水杨酸(SA)，脱落酸(ABA)，过氧化氢(H2O2),高温和核菌盘诱导表达量升高，除水杨酸外，其它诱导条件下，甘蓝型油菜MAPKl基因均只出现了少量的上调，而在水杨酸诱导性，甘蓝型油菜MAPKl基因出现了大幅度的提升。除过氧化氢和核菌盘外，在其它诱导条件下，甘蓝型油菜MAPKl的表达量几乎都在2h达到顶峰。
[0016]基于上述结果，利用本发明的BoMAPKl、BrMAPKl、BnMAPKl基因家族中的任一种或多种基因或基因截短片段，可以构建MAPKI基因重组表达载体和转化体，用于MAPKI基因的超量表达、反义抑制、RNA干扰等。
[0017]本发明的目的之二在于提供所述甘蓝、白菜、甘蓝型油菜MAPKl基因家族在植物品种改良和抗性育种中的应用。
[0018]为达到上述目的，本发明选取BnMAPKl基因家族I个正义超量表达片段BnMAPKl-1ox,(核苷酸序列与 SEQ ID N0.5 的 l_1620bp—致，并分别与 SEQ ID N0.1 的l-1620bp、SEQ ID N0.3 的 l_1599bp、SEQ ID N0.7 的 l_1604bp 高度相似)，将其插入PC2301M1B1载体的35S启动子和NOS终止子之间，构建了 BnMAPKl-1基因的正义超量表达载体pCM-BnMAPKl-lox培养pCM-BnMAPKl_lox工程菌株，并通过根癌农杆菌介导的下胚轴侵染法转入甘蓝型油菜典型黑籽品种中油821，得到了 12株外源基因超量表达的转基因植株。转基因植株在外观性状上总体上与非转基因植株差异不大，背景性状基本上一致，但与非转基因的外植体对照相比，转基因植株生长发育加快，同时抗性提高，是油菜品种改良的新资源。
[0019]本发明的有益效果在于:本发明提供了 MAPKl基因在甘蓝型油菜、甘蓝、白菜中的成员数、各成员的全长cDNA序列和基因组序列、进化关系、表达的器官组织特异性和诱导特性等，并采用转基因技术在甘蓝型油菜黑籽品种中正义超量表达MAPKl基因家族的一个成员，转基因植株生长发育加快，同时抗性得到提高。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中:
[0021]图1甘蓝型油菜、甘蓝、白菜MAPKl基因家族全长cDNA扩增的电泳图。其中(A)M:Trans2K plus DNA marker, I =BnMAPKl-1cDNA, 2 =BnMAPK1-2cDNA, (B) M:Trans2Kplus DNAmarker, I:BoMAPKlcDNA, 2:BrMAPKlcDNA。
[0022]图2甘蓝型油菜、甘蓝、白菜MAPKl基因家族基因组DNA扩增的电泳图。其中(A)M:Trans2K plus DNA marker, I:BnMAPKl-lgDNA, 2:BnMAPKl-2gDNA, (B)M:Trans2KplusDNA marker,I =BoMAPKlgDNA,2:BrMAPKIgDNA。
[0023]图3BnMAPKl、BoMAPKUrMAPKl家族间及与AtMAPKl间的蛋白多重比对。
[0024]图4BnMAPKl、BoMAPKl、BrMAPKl家族与拟南芥(At)等植物的同源蛋白的系统树，各植物物种拉丁学名后面的第I个括弧为蛋白质检索号(protein id)。
[0025]图5甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPKl基因家族总体组织特异性检测，其中Root:根，Stem:?, Leaf:叶,Bud:蕾,Flower:花,Seed:种子。
[0026]图6诱导处理后BnMAPKlmRNA水平变化，其中CK:对照，Wounding:损伤，Heat:高温,S.sclerotiorum:核菌盘,MeJA:茉莉酸甲酯,ABA:脱落酸,H2O2:过氧化氢,SA:水杨酸。
[0027]图7ΒηΜΑΡΚ1-1的超量表达片段的扩增的电泳图，其中M:Trans2K plus DNAmarker ； 1:ΒηΜΑΡΚ1-1οχ。
[0028]图8 酶切图，其中 A 为 pC2301MlBl 的 Xbal+StuI 双酶切图，M: λ-HindIII DNAmarker, 1:未酶切的pC2301MlBl质粒，2:对应的Xbal+StuI双酶产物；B为BnMAPKl-1基因重组T载体的Xbal+StuI完全双酶切图，其中M:Trans2K plus DNA marker, 1:未酶切的pGEM-T-BnMAPKl-lox 质粒，2:对应的 Xbal+StuI 双酶切产物。
[0029]图9ΒηΜΑΡΚ1家族正义超量表达载体农杆菌液的PCR检测电泳图，其中A、B、C分别为引物组合 F35S3N+R0VMAPK1-1、F0VMAPK1-1+RN0S5N、F35S3N+RN0S5N 的扩增产物。M:Trans2K plus DNA marker ； 1-3:农杆菌工程菌株菌液。
[0030]图10中油821转化pCM-BnMAPKl-lox后的Basta抗性愈伤再生出小芽。
[0031]图11中油821 RKpCM-BnMAPKl-1ox后再生小苗的生根。
[0032]图12中油821转化pCM-BnMAPKl-lox后再生植株抗Basta复检，#1~#12是12株转基因再生植株，CK是非转基因中油821阴性对照。
[0033]图13中油821转化pCM-BnMAPKl-lox后抗Basta再生植株的PCR检测，A、B、C分别为引物组合 F35S3N+R0VMAPK1-1、F0VMAPK1-1+RN0S5N、F35S3N+RN0S5N 的扩增产物。M:Trans2K plus DNA marker, 1-12:转基因再生植株，13:阳性对照(工程菌株)，14:阴性对照(中油821)。
[0034]图14CK (中油 821)、#2、#6 和 #9 接种核菌盘(Sclerotinia sclerotiorum) 48 小时。
[0035]图15中油821超量表达BnMAPKl-1的转基因苗#2、#6、#9和对照(中油821)【具体实施方式】
[0036]以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0037]优选实施例采用的植物材料:甘蓝型油菜为典型黑籽系中油821，白菜为白菜型油菜亚种(B.rapa ssp.0leifera)的黑籽系09L597，甘蓝为羽衣甘蓝变种(B.0leraceaacephala)的黑籽系09L598,均由重庆市油菜工程技术研究中心提供,常规大田试验条件种植。
[0038]优选实施例采用的试剂及试剂盒=TRIzol和GeneRacer试剂盒购于美国Invitrogen 公司。PrimeScript RT reagent Kit、DNA Ligation Kit、RNase Inhibitor 及λ-HindIII DNA Marker购自大连宝生物(TaKaRa)生物工程有限公司；pGEM_T easy载体连接试剂盒购自美国Promega公司；RNase_free DNase I和限制性内切酶Xba1、StuI等购自立陶宛MBI Fermentas公司；MS(Murashige&Skoog medium, including vitamins)培养基为荷兰 Duchefa 公司产品； EasyPurePlant Genomic DNA Kit、Trans2K plus DNA marker>Easy-Taq酶、dNTPs等试剂购自北京全式金(Transgen)生物技术有限公司；氨节青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、链霉素(Str)、头孢霉素(Cef)、琼脂糖、Tris, CTAB,Tris 饱和酌.(pH=8.0)、Tryptone、Yeast Extract、X_gal、IPTG> CTAB 等其它生化与分子生物学试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
[0039]优选实施例采用的主要仪器:ABI9700型PCR仪和Veriti?多重控温PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；以及分子生物学和植物基因工程的其它常规仪器、设备和设施。
[0040]一、白菜、甘蓝、甘蓝型油菜MAPKl基因家族的克隆
[0041]所用引物见表1。
[0042]表1PCR 引物
[0043]
【权利要求】
1.甘蓝型油菜及其亲本物种甘蓝和白菜MAPKl基因家族，其特征在于: 所述甘蓝MAPKl基因全长cDNA序列如SEQ ID N0.1所示； 所述白菜MAPKl基因全长cDNA序列如SEQ ID N0.3所示； 所述甘蓝型油菜MAPKl基因家族包括2个成员:ΒηΜΑΡΚ1-1基因和BnMAPKl-2基因；所述BnMAPKl-1全长cDNA序列如SEQ ID N0.5所示；所述BnMAPKl-2全长cDNA序列如SEQID N0.7 所示。
2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜及其亲本物种甘蓝和白菜MAPKl基因家族，其特征在于: 所述甘蓝MAPKl的基因组DNA序列如SEQ ID N0.2所示； 所述白采MAPKl的基因组DNA序列如SEQ ID N0.4所不； 所述BnMAPKl-1的基因组DNA序列如SEQ ID N0.6所示，所述BnMAPKl-2的基因组DNA序列如SEQ ID N0.8所示。
3.含有权利要求1或2所述甘蓝型油菜及其亲本物种甘蓝和白菜MAPKl基因家族中任一种或多种基因或基因截短片段的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体为含有正义超量表达片段的正义超量植物表达载体，所述正义超量表达片段的核苷酸序列与SEQ IDN0.5 的 l-1620bp 一致。.
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于:所述正义超量植物表达载体是将正义超量表达片段插入PC2301M1B1载体的35S启动子和NOS终止子之间而得到。
6.含有权利要求3或4或5所述重组表达载体的微生物转化体。
7.权利要求1或2所述甘蓝型油菜及其亲本物种甘蓝和白菜MAPKl基因家族在植物品种改良和抗性育种中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK103468713SQ201310389076
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月31日 优先权日:2013年8月31日
【发明者】梁颖, 柴友荣, 卢坤, 陆俊杏, 李加纳, 陆奇丰, 张凯, 曲存民 申请人:西南大学