一种提高牛虻抗血栓酶kfpase生物活性的复性方法
【专利摘要】一种提高牛虻抗血栓酶kfpase生物活性的复性方法，属于生物医药【技术领域】。本发明的基本过程为将变性蛋白通过凝胶过滤柱，在洗脱的过程中逐渐降低尿素的浓度，进而蛋白可以正确折叠而形成天然活性蛋白。本发明的方法不仅操作简便，可以获得高纯度的蛋白并保持很高的蛋白或收率，而且可以显著提高蛋白的生物活性。
【专利说明】一种提高牛虻抗血栓酶kfpase生物活性的复性方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药【技术领域】,涉及牛蛇抗血栓酶kfpase的复性方法。
【背景技术】
[0002]血栓栓塞性疾病严重影响人类的健康，是导致死亡率最高的病因之一。在过去的几十年中，已经开发了针对血液凝固、血小板激活和聚集、血栓溶解的不同步骤而起作用的基础和临床药物，但是很多抗血栓药物经常被包括低血压、出血等系统性的副作用所限制，因此，需要开发新型的更具潜力和特异性的抗血栓药物。
[0003]牛虻抗血栓酶kfpase为一种单链蛋白，其表观分子量为27kDa。实验表明牛虻抗血栓酶kfpase具有明显的抗静脉血栓的作用。该工作对有潜力开发成为新型单组份抗血栓药物的牛虻抗血栓酶kfpase进行了较为系统的理化性质研究，为该酶的进一步开发和研究奠定了基础。
[0004]原核表达系统作为一种成熟的蛋白表达系统，因其表达量高，操作简便和成本较低一直以来都受到工业化生产的青睐。因此借助大肠杆菌系统进行基因工程重组表达具有成本低，大规模发酵容易等优点，但重组蛋白在大肠杆菌系统中基本以包涵体形式表达，表达产物不具有生物活性，往往需要进行繁琐的蛋白质复性实验才能获得部分活性。蛋白质在折叠复性中存在一个难以调和的矛盾，那就是蛋白质的折叠和聚集是个竞争过程。当疏水基团的结合发生在在蛋白质内时即为折叠，发生在分子间时就为聚集。后者是个不可逆的过程，往往形成不溶性沉淀。蛋白质的折叠是单分子的一级反应，聚集是双分子或者多分子反应，通常为二级乃至更高级的反应，因此随着蛋白质浓度的提高聚集的倾向将大于折叠的倾向。基因工程的产业化首先要求能在高浓度下复性，蛋白浓度过低无疑会增加后处理的繁琐，提高成本；其次，要保证高的活性收率，即复性的产物与天然结构完全相同；再次，需要高的蛋白收率，尽量减少蛋白质折叠过程中的聚集沉淀。
[0005]蛋白质复性的经典方法一般采用稀释和透析法，前者将变性蛋白直接加入复性缓冲液，高蛋白浓度下往往形成大量沉淀，因而复性时要求很低的蛋白质浓度，而后者操作繁琐，不利于放大。超滤法复性时可以讲变性剂用复性缓冲液连续置换，使变性剂浓度缓慢降低，而蛋白浓度不会明显降低，而且便于自动化操作，但剪切力可能导致复性好的蛋白重新变性而降低活性收率。其他改进的经典复性方法还有脉冲复性、滴加复性和膜管流加复性，它们均不能从根本上解决聚集沉淀的问题。
[0006]近年来，固相复性和层析复性的方法被提出且逐渐受到重视，因为它有如下优越性:减少蛋白质互相聚集的机会，提高蛋白质复性浓度；便于去除变性剂；打破复性变性反应平衡，使复性反应持续进行；使复性和纯化同时进行；便于自动化、规模化生产。
[0007]凝胶过滤层析是一种在蛋白分离纯化领域常用的技术，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于克服稀释复性和透析复性的缺点，为了提高蛋白的活性同时又提高了蛋白的收率，而且变性蛋白在高浓度下复性，不易产生沉淀的目的，从而提供一种操作简单、利用凝胶过滤层析复性蛋白的方法。
[0009]本发明的方法利用凝胶过滤层析复性蛋白的，包括如下步骤实现的:
[0010](I)柱平衡:用流动相I平衡凝胶过滤柱；泵入5% -10%柱体积的流动相II ;其中流动相I为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(TriS-HCl) 20-50mmol / L，pH8.0-9.5，L-精氨酸200-500mmol / L，还原型谷胱甘肽l-3mmol / L，氧化型谷胱甘肽0.2-0.6mmol / L，流动相
II为尿素 6-8mol / L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl) 20-50mmoI / L，ρΗ8.0-9.5，L-精氨酸200_500mmol / L,还原型谷胱甘肽l_3mmol / L,氧化型谷胱甘肽0.2-0.6mmol /L ；
[0011](2)上样:泵入变性蛋白；
[0012](3)洗脱:继续用流动相I洗脱凝胶过滤柱，蛋白在通过凝胶过滤柱时，逐渐将尿素的浓度降低，进而蛋白有足够的时间折叠成天然的形态。
[0013]整个复性过程是在AKTA上运行的，所有的流动相使用之前都通过了 0.22 μ m的膜进行过滤，凝胶过滤所选的介质为Superdex75、Superose6或者Sephacryl S-200,步骤(I)中的柱体积为400ml。
[0014]本发明的步骤⑴中，泵入5% -10%柱体积的流动相II，其目的是为了变性样品上样后，不会因为环境突然改变而发生沉淀。在这个过程中，尿素的浓度会逐渐的降低，使蛋白有一个逐渐适应的过程，从而给蛋白足够的时间进行折叠，最后形成接近天然的形态。
[0015]凝胶过滤后收集的蛋白样品透析后，进行抗血小板聚集实验。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为牛蛇抗血栓酶kfpase的Superdex75层析的色谱图，箭头所指为目的蛋白峰
[0017]图2为牛蛇抗血栓酶kfpase的Superdex75层析的SDS-PAGE检测结果
【具体实施方式】
[0018]实施例1:牛蛇抗血栓酶kfpase在Superdex75柱上进行复性
[0019]牛蛇抗血栓酶kfpase基因工程菌发酵后，取30g菌泥，用裂解液(20mmol / LTris-HCl，ρΗ8.0，500mmol / L NaCl，5%甘油，lmmol / L EDTA)重悬，在固液比为 I:30 的条件下，混合成均一的悬液，倒入高压破碎仪(ATS)中进行破碎，继而通过离心分离得到湿的包涵体粗品。
[0020]将上述得到的粗包涵体用缓冲液A(20mmol / L Tris-HCl, pH8.0,500mmol / LNaCl)和缓冲液 B(20mmol / L Tris-HCl,pH8.0,500mmol / L NaCl，2mol / L Urea)依次洗涤，得到高纯度包涵体。
[0021]取5g高纯度包涵体，以固液比1:40的比例用溶解液(20mmol / LTris-HCl,pH8.0,5mmol / LDTT, 6mol / LUrea)溶解，室温温和搅拌1_2小时，离心得上清液200ml，并用Lowry法测定蛋白浓度。
[0022]将400ml 的 Superdex75 层析柱用流动相 I (20mmol / L Tris_HCl,pH8.0, 2mmol /L GSH,0.4mmol / L GSSG, 250mmol/L L-Arg)平衡，泵入 30ml 的流动相 II(6mol / LUrea, 20mmol / LTris-HCl,pH8.0,2mmol / L GSH,0.4mmol / L GSSG,250mmol / L L-Arg)。将溶解的变性牛蛇抗血栓酶kfpase在AKTA prime plus上泵入层析柱,上样结束后,继续用流动相I进行洗脱。
[0023]将洗脱获得的样品进行透析，透析液为(20mmol / L Tris-HCl，ρΗ8.0)。
[0024]进行抗血小板聚集实验，抑制率与透析复性的样品9%相比，提高了 5.6倍，为51%。
[0025]实施例2:牛蛇抗血栓酶kfpase在Superose6柱上进行复性
[0026]牛蛇抗血栓酶kfpase基因工程菌发酵后，取30g菌泥，用裂解液(20mmol / LTris-HCl，ρΗ8.0，500mmol / L NaCl，5%甘油，lmmol / L EDTA)重悬，在固液比为 1:30 的条件下，混合成均一的悬液，倒入高压破碎仪(ATS)中进行破碎，继而通过离心分离得到湿的包涵体粗品。
[0027]将上述得到的粗包涵体用缓冲液A(20mmol / L Tris-HCl, pH8.0,500mmol /LNaCl)和缓冲液 B(20mmol / L Tris-HCl, ρΗ8.0，500mmol / L NaCl，2mol / L Urea)依次洗涤，得到高纯度包涵体。
[0028]取5g高纯度包涵体，以固液比1:40的比例用溶解液(20mmol / L Tris-HCl,pH8.0,5mmol / LDTT,6mol / L Urea)溶解，室温温和搅拌1_2小时，离心得上清液200ml，并用Lowry法测定蛋白浓度。
[0029]将400ml的 Superose6层析柱用流动相 I (20mmol / L Tris_HCl,pH8.0, 2mmol / LGSH,0.4mmol / L GSSG, 250mmol / L L-Arg)平衡，泵入 30ml 的流动相 II (6mol / L Urea,20mmol / L Tris-HCl, pH8.0,2mmol / L GSH,0.4mmol / L GSSG,250mmol / L L-Arg)。将溶解的变性牛蛇抗血栓酶kfpase在AKTA prime plus上泵入层析柱,上样结束后,继续用流动相I进行洗脱。
[0030]将洗脱获得的样品进行透析，透析液为(20mmol / LTris-HCl，ρΗ8.0)。
[0031]进行抗血小板聚集实验，抑制率与透析复性的样品9%相比，提高了 5倍，为45%。
[0032]实施例3:牛蛇抗血栓酶kfpase在Sephacryl S-200柱上进行复性
[0033]牛虻抗血栓酶kfpase基因工程菌发酵后，取30g菌泥，用裂解液(20mmol / LTris-HCl，ρΗ8.0，500mmol / L NaCl，5%甘油，lmmol / L EDTA)重悬，在固液比为 I:30 的条件下，混合成均一的悬液，倒入高压破碎仪(ATS)中进行破碎，继而通过离心分离得到湿的包涵体粗品。
[0034]将上述得到的粗包涵体用缓冲液A(20mmol / L Tris-HCl, pH8.0,500mmol / LNaCl)和缓冲液 B(20mmol / L Tris-HCl,pH8.0,500mmol/L NaCl，2mol / L Urea)依次洗涤，得到高纯度包涵体。
[0035]取5g高纯度包涵体，以固液比1:40的比例用溶解液(20mmol / L Tris-HCl,pH8.0,5mmol / L DTT, 6mol / L Urea)溶解，室温温和搅拌1-2小时，离心得上清液200ml，并用Lowry法测定蛋白浓度。
[0036]将400ml 的 S印hacryl S-200 层析柱用流动相 I (20mmol / L Tris-HCl, pH8.0,2mmo1 / L GSH, 0.4mmo1 / L GSSG, 250mmol / L L-Arg)平衡，泵入 30ml 的流动相II(6mol / L Urea, 20mmol / L Tris-HCl, pH8.0,2mmol / L GSH,0.4mmol / L GSSG,250mmol / L L-Arg)。将溶解的变性牛蛇抗血栓酶kfpase在AKTA prime plus上泵入层析柱，上样结束后，继续用流动相I进行洗脱。
[0037]将洗脱获得的样品进行透析，透析液为(20mmol / L Tris-HCl，ρΗ8.0)。
[0038]进行抗血小板聚集实验，抑制率与透析复性的样品9%相比，提高了 5.2倍，为47%。
【权利要求】
1.一种提高牛虻抗血栓酶kfpase生物活性的复性方法，利用凝胶过滤层析进行，包括以下步骤: (1)柱平衡:用流动相I平衡凝胶过滤柱；泵入5%-10%柱体积的流动相II ;其中流动相I为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl) 20-50mmol / L，pH8.0-9.5，L-精氨酸200-500mmol / L，还原型谷胱甘肽l-3mmol / L，氧化型谷胱甘肽0.2-0.6mmol / L，流动相II 为尿素 6-8mol / L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl) 20-50mmoI / L，ρΗ8.0-9.5，L-精氨酸200_500mmol / L,还原型谷胱甘肽l_3mmol / L,氧化型谷胱甘肽0.2-0.6mmol /L ； (2)上样:泵入变性蛋白； (3)洗脱:继续用流动相I洗脱凝胶过滤柱，蛋白在通过凝胶过滤柱时，逐渐将尿素的浓度降低，进而蛋白有足够的时间折叠成天然的形态。
2.根据权利要求1所述的复性蛋白的方法，其特征在于凝胶过滤层析的介质为Superdex75、Superose6 或者 Sephacryl S-200。
3.根据权利要求1所述的复性蛋白的方法，其特征在于步骤(I)中的柱体积为400ml。
4.根据权利要求1所述的复性蛋白的方法，其特征在于所有步骤均是在AKTA上操作的。
【文档编号】C12N9/68GK104419694SQ201310388577
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2013年8月29日
【发明者】秦引林, 韩承业 申请人:江苏柯菲平医药股份有限公司