用于检测二斑叶螨的阿维菌素抗药性的引物对、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明涉及分子检测领域，具体涉及用于判断二斑叶螨的阿维菌素抗药性的引物对、试剂盒及检测方法。所述引物对包括：（1）抗性和敏感种群的检测用上游引物分别为：RF：5’-AAGCTGTTGACATTTGGACGA-3’和SF：5’-AAGCTGTTGACATTTGGACGG-3’；（2）以及与上述上游引物配对使用的共用下游引物。本发明通过对二斑叶螨体内GluCl基因突变的检测，从而判断二斑叶螨对于阿维菌素的抗性或者敏感性，具有快速、有效、灵敏度高、能够实现对大批样品的高通量检测等优点，对于监测二斑叶螨田间种群对阿维菌素的抗性基因频率及抗药性发展动态、及时调整二斑叶螨的防治策略，指导合理用药、延缓抗性发展的作用。
【专利说明】用于检测二斑叶螨的阿维菌素抗药性的引物对、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子检测领域，具体涉及用于检测二斑叶螨的阿维菌素抗药性的引物对、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]二斑叶螨Tetranychus urticae属于蜘蛛纲蝶螨亚纲真螨目叶螨科,俗称红蜘蛛，是世界性的重要农业害螨,为害寄主繁多,包括果树、蔬菜和棉花、小麦等重要农作物。叶螨以成螨和幼若螨聚集在植物叶片的背面进行刺吸为害，造成叶片上出现失绿斑点，严重时造成叶片干枯脱落，极大地影响作物的产量和品质。
[0003]由于叶螨体型微小、发生世代多、繁殖速度快、发育历期短的特点，该螨极易产生抗药性。阿维菌素作为抗生素类杀虫杀螨剂，通过刺激虫体产生Y-氨基丁酸，阻断运动神经信息的传递，使害虫 在几个小时内迅速麻痹、拒食、缓动或不动，因此，该药剂一度成为防治二斑叶螨的首选药剂。但是，实验表明阿维菌素继代选育二班叶螨20代，二斑叶螨会对阿维菌素产生较高抗性。而我国各地区的用药情况存在较大差异，导致二斑叶螨对阿维菌素的抗性也不同，为了更好地指导农民合理用药，就需要明确二斑叶螨对阿维菌素的抗药性。然而，传统的叶螨抗药性监测采用玻片浸溃法，试虫微小操作不易，且需要测试虫量很大(至少700头)，至少24小时后才能观察测试结果，通过与相对敏感品系的对比，才可知其对药剂的抗药性水平，因此耗费时间很长。
[0004]谷氨酸是脊椎动物和无脊椎动物神经系统内重要的神经递质，谷氨酸与突触后受体结合后，开启氯离子通道，称为谷氨酸门控的氯离子通道(Glutamate-gated chloridechannel，GluCl)。以往研究已经表明，谷氨酸门控氯离子通道是阿维菌素类杀虫剂的作用靶标之一，GluCl的第二跨膜区下游出现点突变(9299S)导致果蝇对伊维菌素产生了10倍抗药性(Kane et al.，2000)，线虫上也发现了该基因不同位点的点突变(Njue etal.，2004)。Kwon et al.(2010, Insect Molecular Biology, 19(4):583-591)报道二斑叶螨抗性种群中GluCl的点突变(G323D)导致其对阿维菌素产生抗药性的分子机制。
[0005]在此基础上，本发明针对该点突变，设计二斑叶螨抗性和敏感种群中包含该点突变位点的特异性片段，采用特异性等位基因PCR扩增技术(PCR amplification ofspecific alleles,PASA,也称 allele-specific PCR,AS-PCR)分别从抗性和敏感种群中扩增出特异性条带，根据条带的有无直接判别二斑叶螨个体(种群)对阿维菌素是否产生了抗药性。该方法简便、快速，可实现二斑叶螨种群对阿维菌素抗药性的高通量检测。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供用于检测二斑叶螨个体(种群)对阿维菌素是否产生了抗药性的引物对。
[0007]本发明的再一目的是提供用于检测二斑叶螨个体(种群)对阿维菌素是否产生了抗药性的试剂盒。
[0008]本发明的再一目的是提供检测二斑叶螨个体(种群)对阿维菌素是否产生了抗药性的方法。
[0009]本发明提供了用于检测二斑叶螨对阿维菌素是否产生了抗药性的引物对，其包括:
[0010](I)抗性和敏感种群的检测用上游引物分别为:RF:5’ -AAGCTGTTGACATTTGGAC g<GA-3f 和 SF:5，-AAGCTGTTGACATTTGGAC画6￡-3，；
[0011](2)以及与上述上游引物配对使用的共用下游引物，优选地，PCR扩增时和公用的下游引物(3，405F)分别配对进行扩增。RF和3’405F (TGA ATC CTT GGC GGT GTC AAA)组成抗性引物对，SF和3’405F (TGA ATC CTT GGC GGT GTC AAA)组成敏感引物对。
[0012]根据本发明还提供了用于检测二斑叶螨对阿维菌素是否产生了抗药性的试剂盒，所述试剂盒包括:
[0013](I)抗性和敏感种群的检测用上游引物分别为:RF:5’ -AAGCTGTTGACATTTGGAC@GA-3f 和 SF:5’ -AAGCTGTTGACATTTGGACgG￡_3’ ；
[0014](2)以及与上述上游引物配对使用的共用下游引物，优选地，PCR扩增时和公用的下游引物(3，405F)分别配对进行扩增。RF和3’405F (TGA ATC CTT GGC GGT GTC AAA)组成抗性引物对，SF和3’405F (TGA ATC CTT GGC GGT GTC AAA)组成敏感引物对。
[0015]根据本发明的检测二斑叶螨对阿维菌素是否产生了抗药性的方法，所述方法包括使用以下引物对进行PCR扩 增的步骤:
[0016](I)抗性弓丨物对，包括上游引物RF: 5 ’ -AAGCTGTTGACATTTGGAC GA-3 ’和共用下游引物，优选 3’405F (TGA ATC CTT GGC GGT GTC AAA);以及
[0017](2)敏感引物对，包括上游引物SF:5’ -AAGCTGTTGACATTTGGAC @G￡-3’和共用下游引物，优选 3’405F (TGA ATC CTT GGC GGT GTC AAA)。
[0018]对阿维菌素抗性和敏感种群的GluCl测序结果采用DNAMAN进行序列分析比较，对发生点突变的位点上游设置PASA引物，抗性和敏感种群的检测用上游引物分别为:RF:
5’ -AAGCTGTTGACATTTGGAC.GA-3’ 和 SF:5’ -AAGCTGTTGACATTTGGAC g G￡-3’
[0019]本发明通过分析405bp的GluCl特异性片段，对阿维菌素抗性和敏感种群的GluCl测序结果采用DNAMAN5.0版本进行序列分析比较，发现在该扩增片段中在251位出现一个点突变(由敏感种群中的G突变为抗性种群中的A)，也就是二斑叶螨GluCl全序列的开放阅读框(ORF)中的968位核苷酸发生了变化(由G突变为A)，该点突变导致其ORF的323位的氨基酸序列由甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)，即在所扩增的特异性片段中的第84位氨基酸由甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)，突变位点在下面两组氨基酸序列中用方框标识。
[0020]突变前的GluCl特异性片段的氨基酸序列如SEQIDN0.1所示
[0021]GEYSCLKVELVFKREFSYYLFLIYVPCCMLVIVSWVSFWIDPNSAAARVLLGVTSLLTMSRQISGINAS
LPPVSYTKAVDIffTgCCLIFVFGALIEFAIVNYVSRTDTIKADKHRRRRPQGIVGARRKFDTAKDS[0022]突变后的GluCl特异性片段的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示
[0023]GEYSCLKVELVFKREFSYYLFLIYVPCCMLVIVSWVSFWIDPNSAAARVLLGVTSLLTMSRQISGINAS
LPPVSYTKAVDIffT @CCLIFVFGALIEFAIVNYVSRTDTIKADKHRRRRPQGIVGARRKFDTAKDS
[0024]本发明提供的两对特异引物组合及其扩增方法能够快速有效地鉴定出二斑叶螨种群是否发生了谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)基因的G323D突变，具体过程为:以待测二斑叶螨基因组DNA为模板，分别采用敏感特异性引物对和抗性特异性引物对进行PCR扩增，如果采用敏感引物对扩增得到了 176bp的扩增片段，而同时采用抗性引物对未得到176bp的扩增产物，则待测二斑叶螨为GG基因型纯合敏感个体；如果采用抗性引物对得到了 176bp的扩增产物，而同时采用敏感引物未得到该扩增产物，则待测二斑叶螨为AA基因型纯合抗性个体；如果采用敏感引物对和抗性引物对都分别获得了 176bp的扩增产物，则待测二斑叶螨为GA基因杂合型(GA基因杂合型时，对阿维菌素的表型为抗性)。
[0025]通过对二斑叶螨体内GluCl基因突变的检测，从而判断二斑叶螨对于阿维菌素的抗性或者敏感性，具有快速、有效、灵敏度高、能够实现对大批样品的高通量检测等优点，对于监测二斑叶螨田间种群对 阿维菌素的抗性基因频率及抗药性发展动态、及时调整二斑叶螨的防治策略，指导合理用药、延缓抗性发展的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1显示特异性引物扩增敏感和抗性二斑叶螨种群的谷氨酸受体基因片段，Marker =Marker I ;4个S泳道代表敏感种群；4个R泳道代表抗性种群；CK代表清水为模板的阴性对照。
[0027]图2显示抗性和敏感种群中突变位点的检测结果，M =Marker I ;1_3泳道为二斑叶螨室内敏感种群，扩增引物对为SF+5’405R，4泳道为空白对照；5_7泳道为二斑叶螨抗性种群，扩增引物对为RF+5 ’ 405R，8为空白对照；9_11为二斑叶螨室内敏感种群，扩增引物对为RF+5’ 405R, 12-14泳道为二斑叶螨抗性种群，扩增引物对为SF+5’ 405R。
[0028]注:上述试验中，各种群分别检测30头个体，这里的电泳图片仅显示3头。
【具体实施方式】
[0029]材料与方法
[0030]1.试虫、药剂和试剂
[0031 ] 二斑叶螨室内敏感种群于2009年6月采集自山东济南，室内采用阿维菌素药剂进行生物测定后确定为敏感种群。自2009年至今，该种群在室内昆虫生长箱内采用海绵叶盘法，由“碧丰”品种的无虫菜豆苗叶片作为寄主进行继代饲养，期间未接触任何杀虫剂。饲养条件为26±1°C，光周期为L:D= 16h:8h。田间抗性种群分别采集自北京海淀、怀柔的茄子田，室内饲养一代后进行试验。
[0032]杀螨剂为1.8%阿维菌素乳油，由北京中农大生物技术股份有限公司生产。
[0033]所用引物由上海英竣生物工程公司合成，序列测序由北京擎科生物工程有限公司进行。PCR扩增中使用的聚合酶为2 X TaqlOMASTER Mix (0.1U TaqE/ μ I)购自北京奥赛博科技发展有限公司。叶螨的基因组DNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。
[0034]2、叶螨雌成螨的生物测定[0035]叶螨的室内毒力测定参照联合国粮农组织推荐的标准方法一玻片浸溃法(Slide-dip method) (FAO，1980)进行。将双面胶带剪成2~3cm长，贴在载玻片的一端，用镊子揭去双面胶带上的纸片，用零号毛笔挑选大小一致、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨，将其背部粘在双面胶带上，不要粘住螨足、螨须和口器，每片胶带粘3行，每行大约粘15~20头叶螨。在温度为26土1°C、光周期16h:8h (L:D)、相对湿度60%的昆虫生化培养箱中放置4h后，用Olympus双目解剖镜观察，严格剔除死亡或不太活泼以及体位不合适的叶螨个体。各药剂在预备试验的基础上稀释5~7个浓度，将带螨玻片的一端浸入药液中，轻轻摇动5s后取出，迅速用吸水纸吸干螨体及其周围多余的药液。铺一层湿润纱布在白色瓷缸内，浸过药液的玻片放置于大瓷盘内，在瓷缸上面再覆盖一层湿润纱布，再盖上玻璃板以达到保湿的效果，且防止纱布下滑落入玻片上。以带螨玻片浸溃清水作为对照，每个处理重复3~4次。24h后用双目解剖镜检查结果，分别记录存活和死亡的叶螨数量。用毛笔轻触螨体，以螨足不动者为死亡，对照处理死亡率在10%以下为有效试验。试验数据采用Probit软件(Feng et al., Pest Management Science, 2010，66 (3): 313-318.)进行处理，计算药剂的斜率、SE值、LC50值及其95%置信限等，计算各抗性种群的抗性倍数。
[0036]实施例1对阿维菌素抗性和敏感种群检测用特异性引物的获得
[0037]1、叶螨基因组DNA的提取
[0038]单头雌成螨的基因组DNA提取方法采用北京百泰克有限公司的DNA提取试剂盒(溶液型)，方法参照试剂盒说明书进行。单头叶螨基因组DNA的浓度由NanOdrOp2000C测得为 6.60ng/ μ I。
[0039]2、叶螨基因组的PCR扩增及测序
[0040]根据Kwon et al (2010)报道二斑叶螨谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)的点突变位点和序列，设计包含此点突变的GluCl片段的引物对:5’405F:GGG GAA TAC AGC TGT CTCAAA，3’405F:TGA ATC CTT GGC GGT GTC AAA，扩增室内和田间抗性二斑叶螨种群的基因组DNA。PCR扩增体系为:2 X TaqlOMASTER Mix为10 μ 1，DNA模板为I μ 1，上游和下游引物(各为ΙΟμΜ)分别加入1μ 1，最后用水补充至20μ I。设定的PCR扩增程序为:首先95°C预变性3min ;然后进行35个循环(95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸Imin)，最后在72°C条件下延伸lOmin。取PCR产物8 μ I在1.2%琼脂糖凝胶电泳上检测。获得的特异性PCR产物经产物经过Qiagen纯化试剂盒纯化后，送北京擎科生物技术有限公司采用上游和下游引物(5，405F和3’ 405F)进行双向序列测定。
[0041]3、抗性和敏感种群的点突变检测
[0042]对阿维菌素抗性和敏感种群的GluCl测序结果采用DNAMAN进行序列分析比较，对发生点突变的位点上游设置PASA引物，抗性和敏感种群的检测用上游引物分别为:
【权利要求】
1.用于检测二斑叶的螨阿维菌素抗药性的引物对，其特征在于，所述引物对包括:(1)抗性和敏感种群的检测用上游引物，分别为RF: 5 ’ -AAGCTGTTGACATTTGGAC gi GA-3 ’和 SF:5，-AAGCTGTTGACATTTGGAC 0 GGSf ； (2)以及与上述上游引物配对使用的共用下游引物。
2.根据权利要求1所述的用于检测二斑叶螨的阿维菌素抗药性的引物对，其特征在于，所述下游引物为引物3’405F:TGA ATC CTT GGC GGT GTC AAA。
3.用于检测二斑叶螨的阿维菌素抗药性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:(1)抗性和敏感种群的检测用上游引物分别为:RF:5’ -AAGCTGTTGACATTTGGAC GA~3f和 SF:5’ -AAGCTGTTGACATTTGGAC § GGSf ； (2)以及与上述上游引物配对使用的共用下游引物。
4.根据权利要求3所述的用于检测二斑叶螨的阿维菌素抗药性的试剂盒，其特征在于，所述下游引物为引物3’405F:TGA ATC CTT GGC GGT GTC AAA。
5.检测二斑叶螨的阿维菌素抗药性的方法，其特征在于，所述方法包括使用以下引物对进行PCR扩增的步骤: (1)抗性引物对，包括上游引物RF:5’ -AAGCTGTTGACATTTGGAC 0GA-3’和共用下游引物；以及(2)敏感引物对，包括上游引物SF:5’ -AAGCTGTTGACATTTGGAC 0G￡-3’和共用下游引物。
6.根据权利要求5所述的检测二斑叶螨的阿维菌素抗药性的方法，其特征在于，所述下游引物为引物 3’405F:TGA ATC CTT GGC GGT GTC AAA。
【文档编号】C12Q1/68GK103451290SQ201310389153
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月30日 优先权日:2013年8月30日
【发明者】王少丽, 唐小凤, 张友军, 吴青君, 谢文, 徐宝云 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所