一种青蒿myc2转录因子蛋白编码序列及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种生物工程【技术领域】的青蒿MYC2转录因子蛋白编码序列及其改良植物对提高青蒿中青蒿素含量及对病虫害抗性上的应用。本发明所涉及的分离的DNA分子包括：编码具有青蒿MYC2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ?ID?NO.3中从核苷酸第301-2175位的核苷酸序列有至少70%的同源性。本发明涉及包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，还涉及被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。本发明将所说的基因在植物中表达，获得的转基因青蒿植物中青蒿素的含量有了明显的提高，同时该转基因青蒿对灰霉菌的抗性有显著的增强。
【专利说明】—种青蒿MYC2转录因子蛋白编码序列及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】。具体地，本发明涉及一种在青蒿中表达的MYC2转录因子蛋白编码的核苷酸序列。本发明还涉及编码该蛋白的核苷酸序列的用途。
【背景技术】
[0002]青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半職内酯化合物,是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。
[0003]目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，不同种植环境和种植品种中其平均含量在青蒿叶片干重的0.01-1%，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高。虽然目前有人成功利用酵母发酵产生青蒿素前体物质青蒿酸，还需将青蒿酸人工化学半合成至青蒿素，该研究尚处于实验室研发初级阶段。也有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1%，在芽中最高也只有干重的0.16%，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。
[0004]经对现有技术文献检索发现，Bruno Dombrecht等在《The Plant Cell)),2007 年 19 卷 2225-2245 页发表了题为“MYC2Differentially Modulates DiverseJasmonate-Dependent Functions in Arabidopsis.” 的论文，报道了拟南芥中 MYC2 转录因子蛋白是拟南芥茉莉酸信号转导途径的核心转录因子。Hongbo Zhang等在《MolecularPlant》, 2012 年 5 卷 73-84 页发表了题为“Tobacco Transcription Factors NtMYC2a andNtMYC2b Form Nuclear Complexes with the NtJAZl Repressor and Regulate MultipleJasmonate-1nducible Steps in Nicotine Biosynthesis” 的论文,报道了 MYC2 转录因子在烟草中通过茉莉酸介导途径调控尼古丁的生物合成。在本发明被公布前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的青蒿MYC2转录因子蛋白编码序列及其应用。
【发明内容】
[0005]本发明的第一目的在于提供一种新的青蒿MYC2转录因子蛋白编码核苷酸序列。使其包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织，所获得的转基因植物将具有显著提高青蒿素含量及显著提高对灰霉菌的抗性。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:[0007]本发明提供的技术方案之一是:
[0008]提供一种DNA分子，其喊基序列中包含(a)或(b)的喊基序列:
[0009](a) SEQ ID N0.3中第301-2175位碱基所示的核苷酸序列，或者
[0010]与SEQ ID N0.3中第301-2175位碱基所示的核苷酸序列有至少70%同源性的核苷酸序列；
[0011](b)在40-55°C条件下能与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
[0012]该DNA分子能够编码具有SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列的多肽。
[0013]优选地，所述的DNA分子序列具有SEQ ID N0.3中核苷酸第301-2175位的核苷酸序列。
[0014]本发明提供的技术方案之二是:
[0015]一种分离的蛋白质，其为具有如SEQ ID N0.4所示氨基酸序列的多肽，或为具有如SEQ ID N0.4所示氨基酸序列的多肽的保守性变异多肽或其活性片段，或其活性衍生物。
[0016]其中，所述蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为:从自然界中天然存在的蛋白质中分离获得，从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。上述蛋白质命名为青蒿MYC2转录因子。
[0017]本发明提供的技术方案之三是:
[0018]一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含前述的核酸分子。
[0019]其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即:将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括:各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本发明所述载体优选地为质粒载体。载体中包含前述DNA分子的碱基序列。
[0020]本发明提供的技术方案之四是:
[0021]一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
[0022]其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为:将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的编码MYC2转录因子蛋白基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为:大肠杆菌DH5ci，农杆菌EHA105。将前述重组表达质粒转化至大肠杆菌DH5 α，农杆菌ΕΗΑ105中，即可得本发明优选的基因工程菌株。本发明转化体中包含前述的载体。
[0023]本发明提供的技术方案之五是:
[0024]—种转化细胞,所述转化细胞是通过前述载体转化得到的真核细胞或原核细胞，含有前述DNA分子。
[0025]本发明提供的技术方案之六是:
[0026]一种转基因植物，所述转基因植物是通过前述转化得到的真核细胞培养得到的。
[0027]本发明提供的技术方案之七是:
[0028]前述DNA分子在提高植物中青蒿素含量中的应用。优选地，所述植物为青蒿。
[0029]本发明提供的技术方案之八是:
[0030]前述DNA分子在提高植物对灰霉菌抗性中的应用。优选地，所述植物为青蒿。
[0031]本发明提供的技术方案之九是:[0032]—种提高青蒿中青蒿素含量的方法，技术方案包括:
[0033](I)将包含前述DNA分子可操作地连接于植物表达调控序列上，形成植物表达载体；
[0034]( 2)将步骤(1)中的植物表达载体转化入农杆菌，将含有步骤(1)中所述的表达载体的农杆菌侵染转化青蒿植物细胞；
[0035](3)通过抗生素筛选，获得含有前述DNA分子的转化细胞并最终再生转基因青蒿植株及其包括的植物种子及植物组织后代。
[0036]具体步骤如下:
[0037](I)将编码具有青蒿MYC2转录因子蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连接于植物表达调控序列上，形成含有青蒿MYC2转录因子蛋白基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID N0.3中从核苷酸第301-2175位的核苷酸序列有至少70%的同源性；
[0038](2)将步骤(1)中的植物表达载体转化入农杆菌，将含有步骤(1)中所述的表达载体的农杆菌通过叶盘法侵染转化同真核宿主细胞共培养，在22-28°C条件下，暗培养1-2天;
[0039](3)通过抗生素筛选，获得含有青蒿MYC2转录因子蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因青蒿植株及其包括的植物种子及植物组织后代，含有青蒿MYC2转录因子蛋白基因的转基因青蒿植物及其后代中青蒿素含量有显著提高。
[0040]较佳地，该方法中使用的核酸分子具有SEQ ID N0.3中第301-2175位的核苷酸序列。
[0041]本发明提供的技术方`案之十是:
[0042]一种提高青蒿对灰霉菌抗性的方法，技术方案包括:
[0043]( I)将包含前述DNA分子可操作地连接于植物表达调控序列上，形成植物表达载体；
[0044]( 2 )将步骤(1)中的植物表达载体转化入农杆菌，将含有步骤(1)中所述的表达载体的农杆菌侵染转化青蒿植物细胞；
[0045](3)通过抗生素筛选，获得含有前述DNA分子的转化细胞并最终再生转基因青蒿植株及其包括的植物种子及植物组织后代。
[0046]具体步骤如下:
[0047](I)将编码具有青蒿MYC2转录因子蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连接于植物表达调控序列上，形成含有青蒿MYC2转录因子蛋白基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID N0.3中从核苷酸第301-2175位的核苷酸序列有至少70%的同源性；
[0048](2)将步骤(1)中的植物表达载体转化入农杆菌，将含有步骤(1)中所述的表达载体的农杆菌通过叶盘法侵染转化同真核宿主细胞共培养，在22-28°C条件下，暗培养1-2天;
[0049](3)通过抗生素筛选，获得含有青蒿MYC2转录因子蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因青蒿植株及其包括的植物种子及植物组织后代。
[0050](4)将步骤(3)所述的转基因青蒿植物对其叶片表面喷洒甲基茉莉酸溶液后再接种灰霉囷抱子；
[0051](5)将步骤(4)述的处理的转基因青蒿植物在黑暗的，高湿度的环境中培养4天后观察转基因青蒿对灰霉菌的抗性显著提高。
[0052]较佳地，该方法中使用的核苷酸序列具有SEQ ID N0.3中第301-2175位的核苷酸序列。
[0053]在本发明中，“分离的”、“纯化的” DNA是指，该DNA或片段已经从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
[0054]在本发明中，术语“青蒿MYC2转录因子蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有青蒿MYC2转录因子蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.3中第301-2175位的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID N0.3的编码框第301-2175位的核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID N0.3中第301-2175位的核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下与SEQ ID N0.3中从核苷酸第301-2175位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID N0.3第301-2175位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳的至少95%的核苷酸序列。
[0055]该术语还包括能编码具有与天然青蒿MYC2转录因子蛋白相同功能的蛋白的SEQID N0.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳的1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加一个或数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳的为5个以内)核苷酸。
[0056]在本发明中，术语“青蒿MYC2转录因子蛋白或多肽”指具有青蒿MYC2转录因子蛋白活性的SEQ ID N0.4序列的多肽。该术语还包括具有与天然青蒿MYC2转录因子蛋白功能相同的SEQ ID N0.4序列的变`异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳的1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为10个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括青蒿MYC2转录因子蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0057]在本发明中，青蒿MYC2转录因子蛋白或多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与编码青蒿MYC2转录因子蛋白的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗青蒿MYC2转录因子蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0058]在本发明中，“青蒿MYC2转录因子蛋白(或多肽)保守性变异多肽”指与SEQ IDN0.4的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多8个，最佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行替换而产生。
[0059]表1
[0060]
【权利要求】
1.一种DNA分子，其碱基序列中包含(a)或(b)的碱基序列: (a)SEQ ID N0.3中第301-2175位碱基所示的核苷酸序列，或者 与SEQ ID N0.3中第301-2175位碱基所示的核苷酸序列有至少70%同源性的核苷酸序列； (b)在40-55°C条件下能与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
2.一种载体，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA分子的碱基序列。
3.一种转化体，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA分子的碱基序列。
4.一种转化细胞，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA分子的碱基序列。
5.一种转基因植物，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA分子的碱基序列。
6.如权利要求1所述的DNA分子，在提高植物中青蒿素含量中的应用。
7.如权利要求1所述的DNA分子，在提高植物对灰霉菌抗性中的应用。
8.一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下步骤: (1)将权利要求1所述的DNA分子可操作地连接于植物表达调控序列上，形成植物表达载体； (2)将步骤(1)中的植物表达载体转化入农杆菌，将含有步骤(1)中所述的表达载体的农杆菌侵染转化青蒿植物细胞； (3)通过抗生素筛选，获得含有前述DNA分子的转化细胞并最终再生转基因青蒿植株及其包括的植物种子及植物组织后代。
9.一种提高青蒿对灰霉菌抗性的方法，包括如下步骤: (1)将权利要求1所述的DNA分子可操作地连接于植物表达调控序列上，形成植物表达载体； (2)将步骤(1)中的植物表达载体转化入农杆菌，将含有步骤(1)中所述的表达载体的农杆菌侵染转化青蒿植物细胞； (3)通过抗生素筛选，获得含有前述DNA分子的转化细胞并最终再生转基因青蒿植株及其包括的植物种子及植物组织后代。
【文档编号】C12R1/01GK103602686SQ201310413155
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】唐克轩, 沈乾, 陆续, 付雪晴, 颜廷祥, 孙小芬, 王国丰 申请人:上海交通大学