β-地中海贫血IVS-Ⅱ654（C→T)检测试剂盒及ARMS-QPCR检测方法
【专利摘要】本发明提供一种β-地中海贫血IVS-Ⅱ654(C→T)检测试剂盒，其包括PCR反应液（1）、PCR反应液（2）和混合酶液，所述PCR反应液（1）包括β-地中海贫血IVS-Ⅱ654（C→T)上游引物（1）、探针以及下游引物；所述PCR反应液（2）包括β-地中海贫血IVS-Ⅱ654(C→T)上游引物（2）、所述探针以及下游引物；所述上游引物（1）为：5’-TTGCATATTCATAATCTCCCTAC-3’；所述上游引物（2）为：5’-ACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGCT-3’；所述探针为：5’-(FAM)TTTCTGCATATAAATTGTAACTGAT(DABCYL)-3’；所述下游引物为：5’-AGGGCCTAGCTTGGACTCAG-3’。本发明β-地中海贫血IVS-Ⅱ654(C→T)检测试剂盒检测标本，仅需3小时即可完成检测，同时检测β-地中海贫血IVS-Ⅱ654(C→T)特异性较强，有效克服了β-地中海贫血PCR-反向点杂交法、基因检测技术中存在的周期长、操作繁琐，需要送到专门检测单位的缺点。
【专利说明】β -地中海贫血IVS-1I 654 (C - T)检测试剂盒及ARMS-QPCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学和遗传学领域，更具体地，涉及一种β-地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)检测试剂盒及β -地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)点突变ARMS-QPCR检测方法。
【背景技术】
[0002]β地中海贫血(β-mediterranean anemia)是指β链的合成受部分或完全抑制的一组血红蛋白病。患儿出生时无症状，多于婴儿期发病，生后3~6个月内发病者占50%，偶有新生儿期发病者。发病年龄愈早，病情愈重。严重的慢性进行性贫血，需依靠输血维持生命，3~4周输血I次，随年龄增长日益明显。
[0003]因本病的病因多为点突变，故常用PCR加ASO才能明确突变点，我国各民族的β地贫基因突变情况有一定差异，南方汉族的突变基因以⑶41-42(-TCTT)、⑶L7(A — Τ)、IVS-11-654 (C — T)和TATA-box28(A — G)为主，占85%~90%。双重杂合子的突变组合可达近100种，β-地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)是众多β -地中海贫血突变位点中的一种。
[0004]扩增阻滞突变系统(amplificationrefractory mutation system),又名等位基因特异PCR(allele specific PCR，ASPCR)是验证性检测DNA序列变化的经典方法之一，典型的ARMS过程包含两个PCR扩增过程，引物有两对，它们的的区别在于3’端不同，一条引物能与“正常”的靶DNA互补，另一条与“非正常”的靶DNA互补，因此两个扩增反应只能扩增“特定”的DNA模板，因此要求3’末端核苷酸必须等位特异。
[0005]目前对该β_地中海贫血检测方法一般是采用PCR-反向点杂交法、基因检测技术等明确b珠蛋白基因的异常位点，检测时间长，而且操作繁琐，基因检测技术需要送到专门检验单位去检查，费时费力。
[0006]
【发明内容】
[0007] 本发明解决了现有技术中的不足，提供一种灵敏度高、误差小、安全快速检测的β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒及β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)点突变的ARMS-QPCR检测方法。
[0008]本发明的技术方案为:一种β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒，其包括PCR反应液(I )、PCR反应液(2)和混合酶液，所述PCR反应液(I)包括β -地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)上游引物(I)、探针以及下游引物；所述PCR反应液(2)包括β-地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)上游引物(2)、所述探针以及下游引物；
所述上游引物(I)为:5，- TTGCATATTCATAATCTCCCTAC -3，；
所述上游引物(2)为:5’ - ACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGCT -3’ ；所述探针为:5’ -(FAM) TTTCTGCATATAAATTGTAACTGAT (DABCYL)-3’；
所述下游引物为:5’ - AGGGCCTAGCTTGGACTCAG -3’。
[0009]在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，在对所述上游引物(I )、上游引物
(2)、探针以及下游引物进行引物设计时，所述上游引物(I)和上游引物(2)的3’末端与待检位点碱基匹配与错配，共用下游引物和探针；所述上游引物(I)和上游(2)的3’末端倒数第2位碱基错配，共用下游引物和探针。
[0010]在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述碱基错配方式为A — T或G — C互换。
[0011]在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，其还包括β-地中海贫血IVS-1I 654(C-T)的阴性对照液和阳性对照品，所述阴性对照液为不含有β-地中海贫血IVS-1I 654(C — Τ)基因的Tris-EDTA缓冲液，其浓度为0.0lM~0.015Μ, pH为8.00~8.02 ;所述阳性对照品为β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)突变型DNA合成阳性模板和β -地中海贫血IVS-1I 654野生型DNA合成阳性模。。
[0012]在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述上游引物(I)的浓度为50 μΜ，其体积为0.1~0.2 μ I /管；所述上游引物(2)的浓度为50 μ Μ，其体积为0.1~0.2 μ I/管；所述下游引物的浓度为50 μΜ，其体积为0.1~0.2μ1 /管；所述探针的浓度为50μ Μ,其体积为0.1~0.2 μ I /管。
[0013]在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述PCR反应液(I)和PCR反应液
(2)均包括灭菌超纯水、IOXBuffer缓冲液、氯化镁和dNTPs，所述灭菌超纯水的体积为4.8~11.4μ I /管,所述IOX Buffer缓冲液中不含镁离子,其体积为2~4 μ I /管；所述氯化镁的浓度为25mM，其体积为2~4 μ I /管；所述dNTPs的浓度为2.5mM，其体积为2~4 μ I /管。
[0014]在本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,所述混合酶液包括DNA聚合酶、灭菌超纯水和显色液，所述DNA聚合酶为Taq酶，其浓度为5U/ul，体积为00.15~0.3μ I /管；所述灭菌超纯水的体积为1.84~1.68 μ I /管；所述显色液为溴酹兰,其体积为0.01~
0.02 μ I / 管。
[0015]在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，一种使用本发明所述的地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒的β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)点突变的ARMS-QPCR检测方法，包括如下步骤:
(1)提取β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)的DNA样品；
(2)将步骤(I)中获得的DNA样品进行荧光定量PCR检测，荧光定量PCR检测步骤中使用该β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒。
[0016]在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，步骤(2)中所述的荧光定量PCR检测的条件为:50 ~55?:2 ~5min ；94 ~95?:2 ~3min ； 94 ~95?:5 ~IOS ；55 ~6(TC:40~80S ；35~40循环。
[0017]本发明的解决了现有技术的缺陷，具有以下有益效果:
1.本发明β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒检测标本,仅需3小时即可完成检测，同时采用荧光定量PCR方法检测β-地中海贫血IVS-1I 654 (C -T)特异性较强，有效克服了 β_地中海贫血PCR-反向点杂交法、基因检测技术中存在的周期长、操作繁琐，需要送到专门检测单位的缺点。
[0018]2.本发明β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测方只需获取β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)的DNA样品，并采用上述β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒检测即可，方法简单，误差小，准确度高。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]下面结合附图和实施例对发明进一步说明。
[0020]图1为本发明实施例使用Ct值的示意性图。
[0021]图2为本发明实施例β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)点突变的ARMS-QPCR检测方法的流程图。
[0022]图3为使用本发明实施例1的β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒进行检测的突变型阳性结果。
[0023]图4为使用本发明实施例1的β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒进行检测的野生型阳性结果。
[0024]图5为使用本发明实施例1的β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒进行检测的阴性结果。
[0025]图6是本发明实施例1 β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测方法中突变型阳性对照PCR扩增图。
[0026]图7是本发明实施例1 β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测方法中野生型阳性对照PCR扩增图。
[0027]图8是本发明实施例1 β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — T)检测方法中杂合PCR扩增图。
【具体实施方式】
[0028]为了使本【技术领域】的人员更好地理解本发明，并使本发明的上述优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0029]实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。其基本原理为:在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，见图1。PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。
[0030]基于该理论，本发明的实施例提供了一种β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒，包括PCR反应液(I )、PCR反应液(2)和混合酶液，PCR反应液(I)包括包括β -地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)上游引物(I)、下游引物和探针；PCR反应液(2)包括包括β-地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)上游引物(2)、下游引物和探针。
[0031]其中，上游引物(I)序列如SEQID N0.1所示:5’-TTGCATATTCATAATCTCCCTAC -3’； 上游引物(2)如 SEQ ID N0.2 所示:5’ -ACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGCT -3’ ；
下游引物序列如 SEQ ID N0.3 所示:5’ -AGGGCCTAGCTTGGACTCAG-3’ ；
探针序列如 SEQ ID N0.4 所示:5’ -(FAM) TTTCTGCATATAAATTGTAACTGAT (DABCYL)-3’。[0032]上述β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒还包括β-地中海贫血IVS-1I 654CC — T)DNA提取液、β -地中海贫血IVS-1I 654CC — Τ)的阴性对照液、β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)突变型阳性对照品以及β -地中海贫血IVS-1I 654野生型阳性对照品。该β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)DNA提取液可方便β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)的DNA提取；该阴性和阳性对照可用于检测时的自我检验，防止检出误差的出现。如图6-8所示，其中，图6、图7显示试剂盒中阳性对照的PCR扩增图谱，图8显示试剂盒中地中海贫血IVS-1I 654突变型和野生型混合阳性对照品的PCR扩增图
-1'TfeP曰。
[0033]本发明实施例中，具体的,上述PCR反应液(I)、PCR反应液(2 )还包括灭菌超纯水、缓冲液、氯化镁、dNTPs。其中，混合酶液包括DNA聚合酶、灭菌超纯水及显色液。
[0034]上述PCR反应液(I )、PCR反应液(2)中的灭菌超纯水、缓冲液、氯化镁、dNTPs、上游引物(I)、上游引物(2)、下游引物、探针的体积含量如下:缓冲液2~4μ I/管，氯化镁2~4μl/管，dNTPs2~4μl/管，上游引物(l)0.I~0.2 μ I/管，上游引物(20.1~0.2 μ I/管，下游引物0.1~0.2 μ I /管,探针0.1~0.2 μ I/管,灭菌超纯水11.4~4.8 μ I/管。
[0035]上述混合酶液各组分体积为:DNA聚合酶0.15~0.3 μ I/管，显色液0.01~
0.02 μ I /管,灭菌超纯水1.84~1.68 μ I/管。
[0036]其中，PCR反应液(I)中的该缓冲液优选为IOXBuffer (宝生物工程(大连)有限公司)，其不含有镁离子，体积更优选为2.5 μ I/管；氯化镁的浓度优选为25mM，体积更优选为3.5μ I/管；dNTPs的体积更 优选为2.0μ I/管(浓度2.5mM);上游引物(I)的浓度优选为50 μ M，体积更优选为0.1 μ I/管；下游引物的浓度优选为50 μ Μ，体积更优选为0.1 μ I/管；探针的浓度为优选50 μ Μ，体积更优选为0.1 μ I/管。
[0037]PCR反应液(2)中的该缓冲液优选为IOXBuffer (宝生物工程(大连)有限公司)，其不含有镁离子，体积更优选为2.5 μ I/管；氯化镁的浓度优选为25mM，体积更优选为3.5 μ I/管；dNTPs的体积更优选为2.0 μ I/管(浓度2.5mM);上游引物(2)的浓度优选为50 μ M，体积更优选为0.1 μ I/管；下游引物的浓度优选为50 μ Μ，体积更优选为0.1 μ I/管；探针的浓度为优选50 μ Μ，体积更优选为0.1 μ I/管。
[0038]混合酶液中的DNA聚合酶为普通的Taq酶(宝生物工程(大连)有限公司)，其浓度优选为5U/ul，体积更优选为0.2 μ I/管；显色液优选为溴酚兰，其体积更优选为0.02 μ I/管。该DNA聚合酶能有效使得PCR的反应简捷、降低成本。
[0039]利用本发明提供的β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒对β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测方法，该检测方法的流程如图2所示，包括如下步骤:
步骤S01，样品采集处理:提供β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)的检测样品；步骤S02，实时荧光PCR:进行实时荧光定量PCR检测，该荧光定量PCR检测步骤中使用上述的β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒。
[0040]采集样本时,该样本中可能含有β-地中海贫血IVS-1I 654 (C —Τ)，也可能不含有，需要本发明实施例的检测方法进行检测确定。因此，步骤SOl中，β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)的DNA样品中可能含有β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)的DNA，也可能不含有。
[0041]将采集后的标本进行样品处理:具体地，步骤SOl中，取样品，使用经典的酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA。
[0042]具体地，步骤S02中，取步骤SOl中所得到的DNA样品，分别加入含有PCR反应液(I)和PCR反应液(2)的反应管中进行荧光定量PCR分析，本步骤中所使用的荧光定量PCR设备没有特殊限制，行业内常用的荧光定量PCR即可，如:ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJ Opticon 2)、Stratagene MX 系列、Roche LightCycler> Cepheid SmartCycIer>Corbett Rotor-Gene、杭州博日系列等。
[0043]步骤S02中PCR反应的条件为:50~55°C:2~5min ;94~95°C:2~3min ; 94~950C:5 ~IOS ；5 ~6(TC:40 ~80S ;(35 ~40 循环)。
[0044]在本发明实施例中的β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测方法中，每次检测还均设置试剂盒中的阳性对照和阴性对照的步骤。这样，自我检验，防止检出误差的出现。
[0045]实施例1
步骤一:β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒的制备
(1)按以下序列合成引物探针:
上游引物(I)为:5’ -TTGCATATTCATAATCTCCCTAC-3’ ；
上游引物(2 )为:5 ’ -ACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGCT-3，；
探针为:5’ -(FAM) TTTCTGCATATAAATTGTAACTGAT (DABCYL)-3’ ；
下游引物为:5’ -AGGGCCTAGCTTGGACTCAG-3’。
[0046]其中，上游引物(I)和上游引物(2)的3’末端与待检位点碱基匹配与错配，共用下游引物和探针；上游引物(I)和上游(2)的3’末端倒数第2位碱基错配，共用下游引物和探针。碱基错配方式为A — T或G — C互换。
[0047](2)配制含引物探针的PCR反应液(I):
按配方配制PCR反应液(I)各组分的体积如下:
IOXBuffer (不含有镁离子)2.5 μ I/管，氯化镁(25mM) 3.5 μ I/管，dNTPs 2.0 μ I/管，上游引物(I) (50 μ Μ)0.1 μ I/ 管,下游引物(50 μ Μ)0.1 μ I/ 管,探针(50 μ Μ)0.06 μ I/管，灭菌超纯水9.44 μ I/管。
[0048](3)配制含引物探针的PCR反应液(2):
按配方配制PCR反应液(2)，各组分的体积如下:
IOXBuffer (不含有镁离子)2.5 μ I/管，氯化镁(25mM) 3.5 μ I/管，dNTPs 2.0 μ I/管，上游引物(2) (50 μ Μ)0.1 μ I/ 管,下游引物(50 μ Μ)0.1 μ I/ 管,探针(50 μ Μ)0.06 μ I/管，灭菌超纯水9.44 μ I/管。
[0049](4)配制含Taq酶的混合酶液:
按配方配制混合酶液，各组分的体积如下:
Taq酶0.2 μ I/管，溴酚兰0.02 μ I/管，灭菌超纯水1.78 μ I/管。
[0050](5)突变型阳性对照DNA:合成β -地中海贫血IVS-1I 654CC — Τ)基因组DNA，置于阳性对照管内，规格I管，40 μ I/管；
(6)野生型阳性对照DNA:合成β_地中海贫血基因组DNA，置于阳性对照管内，规格I管，40μ I/管；
(7)阴性对照液:不含有β-地中海贫血IVS-1I 654(C — Τ)基因的Tris-EDTA缓冲液(0.0lM ρΗ8.0),规格 I 管,40 μ I/ 管。[0051]步骤二:采用步骤一种的β_地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)检测试剂盒对β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测方法包括如下步骤:
(1)检测组:以β-地中海贫血的合成DNA模板作为检测样本，该样本数为12个，其中一些样本中含有β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)突变型，一些样本为β -地中海贫血野生型。
[0052]取5 μ I上述的DNA样品，在检测反应器中分别加入到18 μ I含引物探针的PCR反应液(I)和PCR反应液(2)中；
(2)阴性对照组:取5μ I Tris-EDTA缓冲液(0.0lM ρΗ8.0)，加入至18 μ I含引物探针的PCR反应液(I)和PCR反应液(2)中，与步骤(I)相同；
(3)突变型阳性对照组:取5μ I突变型阳性对照DNA，加入至18 μ I含引物探针的PCR反应液(I)和PCR反应液(2)中，与步骤(I)相同；
(4)野生型阳性对照组:取5μ I野生型阳性对照DNA，加入至18 μ I含引物探针的PCR反应液(I)和PCR反应液(2)中，与步骤(I)相同；
(5)杂合阳性对照组:取5μI混合的突变型和野生型杂合阳性对照DNA，加入至18 μ I含引物探针的PCR反应液(I)和PCR反应液(2)中，与步骤(I)相同；
(6)将0.5ml混合酶液分别加入1-5各组PCR反应管中；
(7)将步骤1-6所得的各组混合物同时放入荧光定量PCR仪中进行反应，荧光定量PCR反应条件为:50-550C:2-5min ；94-95°C:2_3min ；94-95°C:5_10S ；55-60°C:40-80S ； (40 循环)。
[0053]根据扩增图谱判定结果，其结果如图3-6所示，其中:图3为检测组中β-地中海贫血IVS-1I 654CC-T)突变型检测结果:扩增曲线图Ct值< 35，并有明显指数增长；图4为检测组中β-地中海贫血IVS-1I 654CC-T)野生型检测结果:扩增曲线图Ct值< 35，并有明显指数增长；图5为阴性对照组PCR扩增图，扩增曲线图Ct值为40或无Ct值；图6为突变型阳性对照组检测结果PCR扩增图，结果显示当使用IVS-1I 654 (C-T)突变型合成DNA作为模板，仅使用PCR反应液(I)扩增曲线图Ct值< 35而使用PCR反应液(2)扩增曲线图Ct为40或无Ct值；图7为野生型阳性对照组检测结果PCR扩增图，结果显示当使用IVS-1I 654野生型合成DNA作为模板，仅使用PCR反应液(2)扩增曲线图Ct值 35而使用PCR反应液(I)扩增曲线图Ct为40或无Ct值；图8是杂合阳性对照组检测结果PCR扩增图，结果显示当使用IVS-1I 654 (C — Τ)突变型合成DNA以及IVS-1I 654野生型混合液作为模板，扩增曲线图Ct值均< 35。
[0054]对比例 本对比例β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测方法包括如下步骤:
1、采集含有β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)的样本，该对比例的样本和实施例一的样本一致，得到β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)的DNA样品；
2、按照前面【背景技术】所讲的PCR-反向点杂交法进行检测。
[0055]采集含有β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)的样本，使用特异性标记的引物进行PCR扩增，扩增产物与固定在膜上的寡核苷酸探针进行杂交，结果进一步进行显色反应。 [0056]本发明实施例中的使用本发明提供的试剂盒进行地中海贫血IVS-1I 654(C — Τ)检测只需要约3h，且本发明的检测试剂盒的检测结果与PCR-反向点杂交法检测结果一致，而PCR-反向点杂交法检测β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)则需要48h以上，而且花费成本较高，操作繁琐，因此，从以上结果可以看出，本发明实施例的β_地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒与PCR-反向点杂交法相比，在检测β -地中海贫血IVS-1I 654(C —Τ)方面具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于β-地中海贫血IVS-1I 654(C-T)的检测。 [0057]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。
【权利要求】
1.一种β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — T)检测试剂盒，其包括PCR反应液(I )、PCR反应液(2)和混合酶液，其特征在于，所述PCR反应液(I)包括β-地中海贫血IVS-1I 654(C-T)上游引物(I)、探针以及下游引物；所述PCR反应液(2)包括β-地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)上游引物(2)、所述探针以及下游引物； 所述上游引物(I)为:5，- TTGCATATTCATAATCTCCCTAC -3，； 所述上游引物(2)为:5’ - ACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGCT -3’ ； 所述探针为:5’ -(FAM) TTTCTGCATATAAATTGTAACTGAT (DABCYL)-3’； 所述下游引物为:5’ - AGGGCCTAGCTTGGACTCAG -3’。
2.根据权利要求1所述的β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒，其特征在于，在对所述上游引物(I)、上游引物(2)、探针以及下游引物进行引物设计时，所述上游引物(I)和上游引物(2)的3’末端与待检位点碱基匹配与错配，共用下游引物和探针；所述上游引物(I)和上游(2)的3’末端倒数第2位碱基错配，共用下游引物和探针。
3.根据权利要求2所述的β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒，其特征在于，所述碱基错配方式为A — T或G — C互换。
4.根据权利要求1所述的β-地中海贫血IVS-1I 654(C-T)检测试剂盒，其特征在于，其还包括β-地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)的阴性对照液和阳性对照品，所述阴性对照液为不含有β -地中海 贫血IVS-1I 654 (C — Τ)基因的Tris-EDTA缓冲液，其浓度为0.0lM~0.015Μ，pH为8.00~8.02 ;所述阳性对照品为β -地中海贫血IVS-1I 654(C-T)突变型DNA合成阳性模板和β-地中海贫血IVS-1I 654野生型DNA合成阳性模。
5.根据权利要求1所述的β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物(I)的浓度为50μΜ，其体积为0.1~0.2μ I /管；所述上游引物(2)的浓度为50 μ Μ,其体积为0.1~0.2μ I /管；所述下游引物的浓度为50 μ Μ,其体积为0.1~0.2μ I /管；所述探针的浓度为50μ Μ,其体积为0.1~0.2μ I /管。
6.根据权利要求1所述的β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液(I)和PCR反应液(2)均包括灭菌超纯水、10XBuffer缓冲液、氯化镁和dNTPs，所述灭菌超纯水的体积为4.8~11.4μ I /管，所述IOXBuffer缓冲液中不含镁离子，其体积为2~4 μ I /管；所述氯化镁的浓度为25mM,其体积为2~4 μ I /管；所述dNTPs的浓度为2.5 mM，其体积为2~4 μ I /管。
7.根据权利要求1所述的β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒，其特征在于，所述混合酶液包括DNA聚合酶、灭菌超纯水和显色液，所述DNA聚合酶为Taq酶，其浓度为5U/ul，体积为00.15~0.3 μ I /管；所述灭菌超纯水的体积为1.84~1.68 μ I /管；所述显色液为溴酚兰，其体积为0.01~0.02μ I /管。
8.一种使用权利要求1-7所述的β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒的ARMS-QPCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)提取β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)的DNA样品； (2)将步骤(I)中获得的DNA样品进行荧光定量PCR检测，荧光定量PCR检测步骤中使用该β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒。
9.根据权利要求8所述的ARMS-QPCR检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的荧光定量PCR检测的条件为:。50 ~55°C:2 ~5min ；94 ~95°C:2 ~3min ； 94 ~95°C:5 ~IOS ；55 ~60°C:40 ~80S ； 35~40循环。
【文档编号】C12Q1/68GK103468817SQ201310434940
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】龚剑 申请人:苏州发士达生物科技有限公司