蛋白a1g_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种蛋白A1G_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用。本发明公开的A1G_07050蛋白，其序列如SEQ?ID?No.1中自N端起第164位至第381位氨基酸所示。蛋白A1G_07050可通过基因工程制备，用蛋白A1G_07050作为疫苗与立氏立克次体全菌蛋白疫苗相比，具有制备方法简单、成本低、产量高、更安全等优点，本发明对于落基山斑点热的防疫和治疗具有重大价值。
【专利说明】蛋白A1G_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蛋白A1G_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用。
【背景技术】
[0002]立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)是一种严格胞内寄生的革兰氏阴性菌，是落基山斑点热(Rocky Mountain Spotted Fever, RMSF)的病原体。该菌主要分布在北美洲，其为斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia, SFGR)中毒力最强的一个种，被列为生物战剂和潜在的生物恐怖剂。
[0003]落基山斑点热是一种严重威胁人类健康的人兽共患自然疫源性疾病。RMSF最早发现在美国西北部的爱达荷州和蒙大拿州，1899年Maxey报告了第一例RMSF临床病例。在1906到1909年之间，Ricketts首先对该病进行了病原学研究，他证实了安氏革蜱为该病的传播媒介。
[0004]RMSF的早期临床表现主要有发热，头痛和肌痛。后期病情严重者可出现血压下降，未接受治疗者可产生肺炎，组织坏死和循环衰竭，并发心和脑后遗症。在暴发型病例中可因心跳突然停止而死亡。虽然抗生素治疗对落基山斑点热有效，但由于立氏立克次体能以气溶胶的形式传播，一旦流行难以控制。并且RMSF早期症状缺乏特异性，很难与其他疾病相区别，难以做到早发现早治疗。因此采用有效的疫苗作为预防接种是防止RMSF发生和流行的最有效手段。
[0005]二十世纪中期到末期，RMSF疫苗的研制主要集中在灭活疫苗上。1970年美国陆军传染病医学研究所用鸡胚成纤维细胞培养立氏立克次体并通过蔗糖密度梯度离心获得纯化的病原体，将纯化立克次体甲 醛灭活后制成疫苗，在1983年进行的人体保护性试验中证明该疫苗可以保护25%的接种者，可减轻患者的发热反应，并能使四环素的治疗效果更快更好。但是该灭活疫苗仅提供有限的保护作用，远没有达到有效疫苗保护标准。另外制备立氏立克次体灭活疫苗通常需要鸡胚或者细胞大量培养立克次体，但是提取纯化立克次体的防护要求高，工艺复杂，成本昂贵，因此难以大量制备和推广使用。
[0006]随着对RMSF疫苗研究的不断深入以及蛋白质组学的飞速发展，人们将目光转向了亚单位。研究发现立氏立克次体外膜蛋白A(OmpA)、外膜蛋白B(OmpB)以及普氏立克次体外膜蛋白B(OmpB)免疫产生的抗体可以中和立克次体对小鼠的致死毒性，给予OmpA及OmpB的单克隆抗体可以保护豚鼠有效抵抗致死剂量的立氏立克次体的感染并交叉保护小鼠抵抗致死剂量的康氏立克次体(R.conorii)的感染。这些外膜蛋白尽管有一定的保护作用，但是其免疫保护效果有限，目前难以代替灭活RMSF疫苗。因此，鉴定立氏立克次体的保护性抗原，研发更加安全、有效、持久的亚单位疫苗对预防RMSF具有重大的意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种蛋白A1G_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用。[0008]本发明提供的A1G_07050蛋白，为如下(I)- (3)中任一所示的蛋白:
[0009](I)SEQ ID N0.1中自N端起第164位至第381位氨基酸所示的蛋白；
[0010](2) SEQ ID N0.1 所示的蛋白；
[0011](3)将(I)或(2)所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0012]上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
[0013]上述基因中，所述编码基因为如下中至少一种: [0014]I) SEQ ID N0.3中自5’末端起第490位至第1143位核苷酸所示的DNA分子；
[0015]2) SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子；
[0016]3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0017]4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
[0018]含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0019]上述蛋白在制备预防和/或治疗立氏立克次体引起的疾病的广品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0020]上述应用中，所述疾病为落基山斑点热。
[0021]上述任一所述的应用中,所述产品为疫苗。
[0022]上述蛋白在制备降低被立氏立克次体感染的动物的脏器组织内立氏立克次体数量的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0023]上述应用中，所述脏器为脾脏、肝脏和/或肺脏。
[0024]本发明的蛋白A1G_07050可以作为一种抗原蛋白，刺激机体产生免疫应答对抗立氏立克次体毒株的攻击，可以作为具有落基山斑点热疫苗功能的保护性抗原。蛋白A1G_07050可通过基因工程制备，用蛋白A1G_07050作为疫苗与立氏立克次体全菌蛋白疫苗相比，具有制备方法简单、成本低、产量高、更安全等优点，本发明对于落基山斑点热的防疫和治疗具有重大价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为DNA电泳检测。
[0026]图2为蛋白电泳检测和免疫印迹实验(Western blot)。
[0027]图3为实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾组织内立氏立克次体拷贝数。
[0028]图4为实时荧光定量PCR检测免疫小鼠肝组织内立氏立克次体拷贝数。
[0029]图5为实时荧光定量PCR检测免疫小鼠肺组织内立氏立克次体拷贝数。
【具体实施方式】
[0030]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032]下述实施例中所用的试剂如无特殊说明，均购自国药集团化学试剂公司。
[0033]下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。[0034]以下实施例中利用仪器NAN0DR0P1000分光光度计(购自Thermo Scientific公司)进行蛋白浓度的测定；利用仪器7300Real Time PCR System(购自Applied Biosystems公司)进行立氏立克次体拷贝数的测定。
[0035]载体pET_32a(+)购自Novagen公司，产品目录号为69015。
[0036]大肠杆菌BL21购自Novagen公司，产品目录号为69450。
[0037]C3H/HeN小鼠(3-4周龄，雄性)购自北京维通利华公司。
[0038]弗氏完全佐剂(CFA)购自Sigma公司，产品目录号为F-5881。
[0039]弗氏不完全佐剂(IFA)购自Sigma公司，产品目录号为F-5506。
[0040]镍-NTA琼脂糖凝胶(N1-NTA)试剂盒购自Qiagen公司，产品目录号为30230。
[0041]DNA提取试剂盒购自Qiagen公司，产品目录号为69506。
[0042]辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自中科瑞泰公司，产品目录号为ZB-2305。
[0043]限制性内切酶均购自大连TaKaRa公司。
[0044]实施例中所用的立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)均为立氏立克次体 Sheila Smith 株(Rickettsia rickettsii, Sheila Smith strain),该菌株在文献“Ellison Dff, Clark TR, Sturdevant DE, Virtaneva K, Porcella SF, Hackstadt T.Genomiccomparison of virulent Rickettsia rickettsii Sheila Smith and avirulentRickettsia rickettsii 1wa.1nfect Immun.2008Feb;76(2):542-50.Epub2007Novl9.”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
[0045]主要试剂的配制:
[0046]PCR 反应用 2XMix 的配制(Iml):
试剂名称_Wn_
Taq DNA 聚合酶(5υ/μ1)ΙΟμΙ
[0047]
IOXBuffer (Mg，200μ1
dNTP Mixture160M-1
[0048]加去离子水定容至lml。
[0049]可溶性蛋白裂解缓冲液ρΗ8.0 (1000ml):
组成质量
50 mM NaH2PO47.80g NaH2PO4.2^0 (MW 156.0lg/raol)
[0050]300 mM NaCl17.54g NaCl (MW 58.44g/mol)
10 mM 咪唑0.68g 咪唑(MW 68.08g/mol)
[0051]称取上述质量的各试剂，用去离子水溶解并定容到1000ml，NaOH调节pH至8.0。
[0052]包涵体表达形式目的蛋白纯化所需缓冲液的配制如下:
[0053]一、包涵体蛋白裂解缓冲液pH8.0 (1000ml):
【权利要求】
1.A1G_07050蛋白，为如下(I)-(3)中任一所示的蛋白: (1)SEQID N0.1中自N端起第164位至第381位氨基酸所示的蛋白； (2)SEQ ID N0.1所示的蛋白； (3)将(I)或(2)所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因为如下中至少一种: 1)SEQ ID N0.3中自5’末端起第490位至第1143位核苷酸所示的DNA分子； 2)SEQ ID N0.3所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子； 4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述的蛋白在制备预防和/或治疗立氏立克次体弓丨起的疾病的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述疾病为落基山斑点热。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于:所述产品为疫苗。
8.权利要求1所述的蛋白 在制备降低被立氏立克次体感染的动物的脏器组织内立氏立克次体数量的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述脏器为脾脏、肝脏和/或肺脏。
【文档编号】C12N1/19GK103483430SQ201310444429
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】龚文平, 熊小路, 温博海, 齐永, 段长松, 焦俊, 杨小梅 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所