酪蛋白磷酸肽锌螯合物的制作方法

酪蛋白磷酸肽锌螯合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种酪蛋白磷酸肽锌螯合物。所述酪蛋白磷酸肽锌螯合物为固态的白色粉末，无味，微溶于水，易溶于弱酸性水中，不溶于醇等有机溶剂；酪蛋白磷酸肽锌螯合物中酪蛋白磷酸肽与锌的螯合率达到90%以上。制备所述酪蛋白磷酸肽锌螯合物的方法是通过酶解酪蛋白获得的酪蛋白磷酸肽与无机锌进行螯合反应，制得酪蛋白磷酸肽锌螯合物。本发明首次建立了酪蛋白磷酸肽与锌螯合制备的工艺技术，获得一种新型的生物活性肽锌营养强化剂。本发明获得的酪蛋白磷酸肽锌螯合物可以作为一种新型的补锌营养强化剂在食品中应用。
【专利说明】酪蛋白磷酸肽锌螯合物【技术领域】[0001]本发明属于功能性营养强化剂的制备工艺【技术领域】，具体涉及一种制备酪蛋白磷 酸肽锌螯合物的工艺方法。【背景技术】[0002]锌作为人体必需的微量元素之一，是具有重要生理功能的营养元素，在机体新陈 代谢中具有重要作用，与生长发育、生殖、消化、免疫、视觉、衰老等生理功能都有极密切的 关系。儿童营养状况调查结果表明，我国约有26%?27%的儿童缺锌，有些地区成年人及 老年人也有缺锌症状。J L童缺锌会影响其智力发展及生长发育，成人及老年人缺锌则影响 正常代谢，从而导致免疫力降低，引发多种疾病。因此，通过营养强化剂或者膳食补锌具有 重要意义。我国经全国食品添加剂标准化技术委员会审定、卫生部公布列入使用卫生标准 的锌营养强化剂有:氯化锌、硫酸锌、氧化锌、葡萄糖酶锌、乳酸锌、乙酸锌(醋酸锌)、柠 檬酸锌(枸橼酸锌)和甘氨酸锌。其中，无机锌3种，有机锌5种。主要应用于乳制品、婴 幼儿食品、饮液及乳饮料、谷类及其制品、食盐等食品中。目前补锌制剂的研发已经历了四 代:最早使用的补锌剂为无机锌，如硫酸锌、氯化锌、氧化锌等，这类锌剂对肠胃有刺激性， 生物学效价低，因此使用逐步减少。第二代为有机锌，如葡萄糖酸锌、醋酸锌、乳酸锌、柠檬 酸锌(枸橼酸锌)等。因这类锌强化剂在口味、利用率和被人体的吸收性等方面有较大的改 善，而被广泛应用。第三代氨基酸螯合锌，它具有良好的生物化学稳定性，易为动物体所吸 收，其生物学效价明显优于有机锌。第四代为生物活性锌，这一类补锌剂多籍助肽的生物活 性功能，可进一步提高锌的吸收率和生物学效价，是新型补锌剂的研究开发重点。如高素蕴 等(2003)研究了大豆分离蛋白水解物中分子量小于10 kDa的混合肽制备螯合锌的方法。 邱冬玲等(2008)研究了以丝素蛋白水解物中的多肽为原料与锌离子合成制备多肽锌螯合 物的方法。刘成梅等(2008)研究了以罗非鱼皮胶原多肽(TSP-1)为配位体，采用水合体系 法与硫酸锌螯合，制备可用于补锌剂的多肽螯合锌技术。[0003]酪蛋白磷酸肽(CaseinPhosphopep-tides, CPPs)是以牛乳酪蛋白为原料，经单 一酶或复合酶系水解，再经分离纯化而得到的一类含有磷酸丝氨酸簇的天然生理活性短 肽。研究表明=CPPs是一种良好的金属结合肽，在动物小肠环境中能与钙、铁、锌二价矿物 质离子结合，防止产生磷酸盐沉淀，增强肠内可溶性矿物质的浓度，从而促进吸收利用。如 Matsui等(1994)在低钙日粮中添加0.5% CPPs，大鼠碱性磷酸酶活性高于对照组，说明 CPPs能够提高锌的利用率。Hansen等(1997)和Ashida等(1996)实验表明CPPs具有促 进动物对Ca、Zn、Fe吸收的功能。目前，国内外仅有酪蛋白磷酸肽制备方面的文献报道，如 Reynolds Eric等(2001)报道了一种生产酪蛋白磷酸肽的方法，在蛋白酶水解酪蛋白后的 溶液中加入氯化钙，使酪蛋白磷酸肽聚集，再通过过滤器分离出酪蛋白磷酸肽。曹庸(2010) 等报道了用胰蛋白酶酶解干酪素，再采用超滤膜分离，得到酪蛋白磷酸肽溶液的一种酪蛋 白磷酸肽的制备工艺。而酪蛋白磷酸肽与锌螯合制备酪蛋白磷酸肽锌的技术尚未见专利和 文献报道。
【发明内容】
[0004]本发明旨在提供一种酪蛋白磷酸肽锌螯合物，一种酪蛋白磷酸肽锌螯合物为固态 的白色粉末，无味，微溶于水，易溶于弱酸性水中，不溶于醇等有机溶剂；酪蛋白磷酸肽锌螯 合物中酪蛋白磷酸肽与锌的螯合率达到90%以上。[0005]制备酪蛋白磷酸肽锌螯合物的方法是通过酶解酪蛋白获得的酪蛋白磷酸肽与无 机锌进行螯合反应，制得酪蛋白磷酸肽锌螯合物。[0006]制备酪蛋白磷酸肽锌螯合物的具体操作步骤如下:(1)取17.5g酪蛋白，溶于温度60°C?70°C的50ml浓度0.25mol/L的氢氧化钠溶液 中，完全溶解，用去离子水定容至250g，配成浓度7%的酪蛋白溶液；(2)在酪蛋白溶液中加入碱性蛋白酶0.07g，用氢氧化钠溶液调pH值至10.0?10.5， 在温度55°C?60°C条件下保温酶解3.0h，置于温度100°C沸水浴处理8min?IOmin灭酶 活，得到酶解液；(3)用盐酸调节酶解液的pH值至4.6,在转速3500r/min条件下离心15min,取上清液， 即为酪蛋白酶解液；(4)在酪蛋白酶解液中加入浓度10%的氯化钙溶液,使酪蛋白酶解液中氯化钙的含量 为1.0%，静置1.0h，加入与酪蛋白酶解液等体积量的浓度95%的乙醇，在转速8000r/min 条件下离心15min，收集沉淀物，即得到酪蛋白磷酸肽；(5)在酪蛋白磷酸肽中加入等质量的去离子水溶解，按3:1?5:1的酪蛋白磷酸肽与锌 离子的质量比添加无机锌，调节PH值至6.5?7.5，在温度55°C?65°C的水浴条件下螯合 反应80min?120min，在转速8000r/min条件下离心15min，取沉淀物，用无水乙醇洗涤沉 淀物，将洗涤后的沉淀物置于温度60°C热风下干燥，获得酪蛋白磷酸肽锌螯合物，所述酪蛋 白磷酸肽锌螯合物为固态的白色粉末，无味，微溶于水，易溶于弱酸性水中，不溶于醇等有 机溶剂；酪蛋白磷酸肽锌螯合物中酪蛋白磷酸肽与锌的螯合率达到90%以上。[0007]步骤(2)中的碱性蛋白酶的比活力单位大于等于200 U/mg ο[0008]步骤(5)中的无机锌为硫酸锌或氯化锌或氧化锌。[0009]本发明首次建立了酪蛋白磷酸肽与锌螯合制备的工艺技术，获得一种新型的生物 活性肽锌营养强化剂，即酪蛋白磷酸肽锌螯合物；本发明的酪蛋白磷酸肽锌螯合物中酪蛋 白磷酸肽与锌的螯合率可达92%，获得的酪蛋白磷酸肽锌螯合物在常温下呈固态的白色粉 末，无味，微溶于水，易溶于弱酸性水中，不溶于醇等有机溶剂，稳定性好。[0010]本发明获得的酪蛋白磷酸肽锌螯合物可以作为一种新型的补锌营养强化剂在 食品中应用。参照我国《食品营养强化剂使用卫生标准》(GB14880-2012)中规定，可用 于调制乳(5mg/kg?10 mg/kg),调制乳粉(30mg/kg?175mg/kg),豆粉、豆衆粉(29mg/ kg?55.5mg/kg),大米、小麦粉、杂粮粉及其制品、面包(10mg/kg?40mg/kg),即食谷物 (37.5mg/kg ?112.5mg/kg),西式糕点、饼干(45mg/kg ?80mg/kg)、饮料(3mg/kg ?20mg/ kg)等多种食品及动物饲料中。【具体实施方式】[0011]下面结合实施例，对本发明做进一步地说明。[0012]以下实施例所用原料来源如下:酪蛋白的生产单位为Sigma公司 碱性蛋白酶的生产单位为Ruibio公司氢氧化钠的生产单位为上海振企化学试剂有限公司 氯化钙的生产单位为西陇化工股份有限公司氯化锌、硫酸锌和氧化锌的生产单位为江苏科伦多食品配料有限公司。[0013]实施例1:酪蛋白磷酸肽锌螯合物的制备方法主要包括以下步骤步骤一:取17.5g酪蛋白，溶于60°C?70°C的50ml浓度0.25mol/L的氢氧化钠溶液 中，完全溶解后，用去离子水定容至250g，配成浓度为7%的酪蛋白溶液；步骤二:在酪蛋白溶液中加入比活力单位大于等于200 U/mg的碱性蛋白酶0.07g，放 置于55°C?60°C水浴锅中，用氢氧化钠溶液调pH值至10.0?10.5，在55°C?60°C条件下 保温酶解3.0h,反应结束后用100°C沸水浴处理8min?IOmin灭酶活,得到酶解液；步骤三:用盐酸将酶解液的pH值调至4.6，在转速3500r/min条件下离心15min，取上 清液，即为酪蛋白酶解液；步骤四:在酪蛋白酶解液中加入10%的氯化钙溶液，使酪蛋白酶解液中氯化钙含量为1.0%，静置1.0h,加入酪蛋白酶解液等体积量的95%乙醇，在转速8000r/min条件下离心 15min，收集沉淀，即得到酪蛋白磷酸肽；步骤五:将酪蛋白磷酸肽加等质量的去离子水溶解，按3:1?5:1的酪蛋白磷酸肽与锌 离子质量比添加无机锌(氯化锌、硫酸锌、氧化锌)，调节溶液pH值至6.5?7.5，在55°C? 65°C水浴温度下螯合反应80min?120min,再置8000r/min条件下离心15min,取沉淀， 用无水乙醇洗涤沉淀物，将洗涤后沉淀物置于60°C热风下干燥，获得酪蛋白磷酸肽锌螯合 物；酪蛋白磷酸肽锌螯合物为固态的白色粉末，无味，微溶于水，易溶于弱酸性水中，不溶 于醇等有机溶剂；酪蛋白磷酸肽锌螯合物中酪蛋白磷酸肽与锌的螯合率达到90%以上。[0014]实施例2:步骤五:pH值调至6.5，酪蛋白磷酸肽与锌离子质量比3:1，水浴螯合温度55°C ；其它操作步骤同实施例1。[0015]实施例3:步骤五:pH值调至6.5，酪蛋白磷酸肽与锌离子质量比4:1，水浴螯合温度65°C ；其它操作步骤同实施例1。[0016]实施例4:步骤五:pH值调至6.5，酪蛋白磷酸肽与锌离子质量比5:1，水浴螯合温度60°C ；其它操作步骤同实施例1。[0017]实施例5:步骤五:pH值调至7.0，酪蛋白磷酸肽与锌离子质量比4:1，水浴螯合温度55°C ；其它操作步骤同实施例1。[0018]实施例6:步骤五:pH值调至7.0, CPPs与锌离子质量比5:1，水浴螯合温度65°C ；其它操作步骤同实施例1。[0019]实施例7:步骤五:pH值调至7.5，CPPs与锌离子质量比3:1，水浴螯合温度65°C ； 其它操作步骤同实施例1。[0020]实施例8:步骤五:pH值调至7.5，CPPs与锌离子质量比4:1，水浴螯合温度60°C ； 其它操作步骤同实施例1。[0021]实施例9:步骤五:pH值调至7.5，CPPs与锌离子质量比5:1，水浴螯合温度55°C ； 其它操作步骤同实施例1。
【权利要求】
1.酪蛋白磷酸肽锌螯合物，其特征在于:所述酪蛋白磷酸肽锌螯合物为固态的白色粉 末，无味，微溶于水，易溶于弱酸性水中，不溶于醇等有机溶剂；酪蛋白磷酸肽锌螯合物中酪 蛋白磷酸肽与锌的螯合率达到90%以上。
2.制备权利要求1所述的酪蛋白磷酸肽锌螯合物的方法，其特征在于:通过酶解酪蛋 白获得的酪蛋白磷酸肽与无机锌进行螯合反应，制得酪蛋白磷酸肽锌螯合物。
3.如权利要求2所述的制备酪蛋白磷酸肽锌螯合物的方法，其特征在于:具体操作步 骤如下:(1)取17.5g酪蛋白，溶于温度60°C?70°C的50ml浓度0.25mol/L的氢氧化钠溶液 中，完全溶解，用去离子水定容至250g，配成浓度7%的酪蛋白溶液；(2)在酪蛋白溶液中加入碱性蛋白酶0.07g，用氢氧化钠溶液调pH值至10.0?10.5， 在温度55°C?60°C条件下保温酶解3.0h，置于温度100°C沸水浴处理8min?IOmin灭酶 活，得到酶解液；(3)用盐酸调节酶解液的pH值至4.6,在转速3500r/min条件下离心15min,取上清液， 即为酪蛋白酶解液；(4)在酪蛋白酶解液中加入浓度10%的氯化钙溶液,使酪蛋白酶解液中氯化钙的含量 为1.0%，静置1.0h,加入与酪蛋白酶解液等体积量的浓度95%的乙醇，在转速8000r/min 条件下离心15min，收集沉淀物，即得到酪蛋白磷酸肽；(5)在酪蛋白磷酸肽中加入等质量的去离子水溶解，按3:1?5:1的酪蛋白磷酸肽与锌 离子的质量比添加无机锌，调节pH值至6.5?7.5，在温度55°C?65°C的水浴条件下螯合 反应80min?120min，在转速8000r/min条件下离心15min，取沉淀物，用无水乙醇洗涤沉 淀物，将洗涤后的沉淀物置于温度60°C热风下干燥，获得酪蛋白磷酸肽锌螯合物，所述酪蛋 白磷酸肽锌螯合物为固态的白色粉末，无味，微溶于水，易溶于弱酸性水中，不溶于醇等有 机溶剂；酪蛋白磷酸肽锌螯合物中酪蛋白磷酸肽与锌的螯合率达到90%以上。
4.如权利要求3所述的制备酪蛋白磷酸肽锌螯合物的方法，其特征在于:步骤(2)中的 碱性蛋白酶的比活力单位大于等于200 U/mg。
5.如权利要求3所述的制备酪蛋白磷酸肽锌螯合物的方法，其特征在于:步骤(5)中的 无机锌为硫酸锌或氯化锌或氧化锌。
【文档编号】A23C9/152GK103494214SQ201310452264
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】王志耕, 张胥卿, 梅林 , 薛秀恒 申请人:安徽农业大学