一种酪蛋白磷酸肽及其制备方法与流程

本发明属于生物活性肽，具体涉及一种酪蛋白磷酸肽及其制备方法。

背景技术：

1、牛奶和乳制品是影响人类健康的蛋白质和肽的重要来源。酪蛋白磷酸肽(cpps)是以牛奶中酪蛋白为原料，经过单一或复合蛋白酶的水解，再对水解产物分离纯化后得到的含有磷酸丝氨酸簇的天然生理活性肽。随着酪蛋白磷酸肽的功能研究的深入，人们对其的兴趣越来越大，目前已有研究表明，酪蛋白磷酸肽能促进机体肠黏膜对钙、铁、锌、硒等微量元素的吸收利用，尤其是对钙、铁的吸收和利用，被誉为“矿物质载体”。此外，酪蛋白磷酸肽还认为具有提升机体免疫力、在体内具有抗氧化和抗炎的作用，在欧美已经用于广泛用于食品和保健品中。酪蛋白磷酸肽的活性中心富含磷酸丝氨酸和谷氨酸，其结构可表示为－serp－serp－serp－glu－glu-。

2、cn103571905a提出了一种高纯度酪蛋白磷酸肽制备方法，先采用胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶任意四中组成的复合蛋白酶第一次酶解，用胃蛋白酶进行二次酶解，然后通过阳离子交换树脂和阴离子交换树脂纯化，纳滤等方式制备得到的乳源性酪蛋白磷酸肽的分子量主要在1000-5000之间，得率大于17％。

3、cn105085651a提出了一种酪蛋白磷酸肽(cpp)单体及其制备方法，其以牛乳中酪蛋白为原料，经过胰蛋白酶酶解、灭酶、精滤、醇沉、离心、过葡聚糖凝胶柱、中压柱层析、反相硅胶纯化、干燥等工艺制备持钙活性高、具有特定序列的酪蛋白磷酸肽cpp1、cpp2、cpp3，其分子量分别为1224.12、1082.14、1578.70，cpp1的序列为sigpspspseepsaevateev，属于αs2酪蛋白68-84的片段，cpp2的序列为igpsepstedqamedik，属于αs1酪蛋白59-73的片段；cpp3序列为eleelnvpgeivepspspseesit，属于β酪蛋白17-39的片段。该方法得到的酪蛋白磷酸肽分子量小，利于吸收，但是，该方法的得到的酪蛋白磷酸肽中各种肽单体的含量及产品的得率无法保证，持钙能力也没有具体的测试。

4、cn110483622a公开了以酪蛋白为原料，部分原料用胰蛋白酶酶解，部分原料以复合酶(胰蛋白酶和中性蛋白酶)酶解，灭酶、离心、与无水氯化钙混合，调节等电点/醇(乙醇沉淀)沉除杂、干燥等工艺制备具有持钙活性强的酪蛋白磷酸肽，酪蛋白磷酸肽的含量在85％以上，其收率可达到25％；但是其收率也没有明确的试验证据支持。

5、因此，开发一种酪蛋白磷酸肽的制备方法，具有高得率的同时所得酪蛋白磷酸肽还具有高持铁和高持钙能力，是本领域的研究重点。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酪蛋白磷酸肽及其制备方法。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种酪蛋白磷酸肽的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

4、(1)将酪蛋白溶解后，加入菠萝蛋白酶进行酶解，得到酪蛋白磷酸肽粗提物，其中溶解时酪蛋白与溶剂的质量比为1:(8-10)，溶解时调节ph值为9-11，酶解时的菠萝蛋白酶的添加量为0.3-0.35％，酶解的温度为50-60℃，时间为4-5h，酶解时的ph值为7-7.5；

5、(2)采用将所述酪蛋白磷酸肽粗提物进行分离，收集分子量＜10kda的组分，得到所述酪蛋白磷酸肽。

6、优选地，步骤(1)中所述溶解采用的溶剂为蒸馏水，所述溶解时酪蛋白与溶剂的质量比为可以选择1:8.5、1:9、1:9.5等。

7、优选地，所述溶解时ph调节可以选择9.5、10、10.5等。

8、优选地，步骤(1)中所述酶解时的菠萝蛋白酶的添加量为0.3-0.35％，例如可以为0.31％、0.32％、0.33％、0.34％等。

9、优选地，所述酶解的温度可以选择52℃、54℃、56℃、58℃等，酶解时间可以选择4.2h、4.4h、4.6h、4.8h等。

10、优选地，所述酶解时的ph值可以选择7.1、7.2、7.3、7.4等。

11、在本发明的一个实施例中，所述步骤(1)中所述酶解之后还包括灭活、调节ph值至4-5、离心、冷冻干燥的步骤。

12、优选地，步骤(2)中所述分离采用超滤膜进行。

13、作为优选方案，所述制备方法包括如下步骤：

14、(1)向酪蛋白中按照质量比1:10加入超纯水，用2mol/l naoh调溶液ph至10.0，50℃加热搅拌至完全溶解，然后调整溶液ph值至7.32，加入酶底质量比0.31％的菠萝蛋白酶，进行55℃恒温水浴酶解4.06h，酶解结束后95℃，加热10min灭酶，冷却至室温，用1mol/lhcl调ph值至4.6，静置20min，4000r/min离心10min，收集上清液，冷冻干燥，获得酪蛋白磷酸肽粗提物；

15、(2)将酪蛋白磷酸肽粗提物进行10kda超滤膜分离，收集分子量<10kda的组分，冷冻干燥，得到所述酪蛋白磷酸肽。

16、优选地，所述制备方法还包括对酪蛋白磷酸肽进一步纯化分离的步骤：

17、将所述酪蛋白磷酸肽进行第一次hplc纯化分离，筛选出fe2+螯合活性最高的组分；

18、将所述fe2+螯合活性最高组分进行第二次hplc纯化分离，收集高活性组分。

19、优选的，所述第一次hplc纯化分离的条件如下：检测波长214nm和280nm，进样体积：4ml，流速：10ml/min，色谱柱：c18柱(15mm×460mm，20μm)，流动相：流动相a为水+0.1％tfa，流动相b为甲醇+0.1％ tfa，洗脱梯度：0-10min，10％-20％流动相b；10-30min，20％-35％流动相b；30-80min，35％-60％流动相b；80-100min，60％-70％流动相b；100-120min，70％-95％流动相b。

20、优选地，所述fe2+螯合活性最高的组分的出峰时间为44.758-52.050min。

21、优选的，所述第二次hplc纯化的条件如下：检测波长：214nm和280nm，进样体积：0.6ml，流速：5ml/min，色谱柱：prep 150制备液相系统，反相柱sunfire pep c18 obdtm(19mm×250mm,5μm,waters)，流动相：流动相a为水+0.1％ tfa，流动相b为甲醇+0.1％tfa，洗脱梯度：0-35min，10％-40％流动相b；35-55min，40％-45％流动相b；55-65min，45％-50％流动相b；65-80min，50％-95％流动相b。

22、优选地，所述高活性组分的出峰时间为45.023-47.074min，收集到的高活性组分含有自β-酪蛋白的3个单体肽段，分别为lslsqskvlpvpq、eiveslssseesitrink、lqdkihpfaqtqs。

23、优选地，所述第二次hplc纯化分离得到的高活性组分的出峰时间还可以为48.421-49.792min，收集到的高活性组分含有4个单体肽段，分别为来自β-酪蛋白的vmfppqsvlslsqs、plpllqswmhqphq，来自αs1-酪蛋白的akntmehvssseesiisq，αs2-酪蛋白的ykvpqleivpnsaee。

24、第二方面，本发明提供了一种酪蛋白磷酸肽，所述酪蛋白磷酸肽采用如第一方面所述的制备方法制备得到。

25、优选的，所述酪蛋白磷酸肽的fe2+螯合率为89-90.91％，例如可以为89.2％、89.4％、89.6％、89.8％、90％、90.2％、90.4％、90.6％、90.8％等。

26、第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的酪蛋白磷酸肽在制备食品、保健食品、药品中的应用。

27、本发明的酪蛋白磷酸肽可以用于螯合fe2+，提高为人体、动物体对于铁吸收能力和安全性。

28、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

29、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

30、(1)本发明通过采用菠萝蛋白酶进行工艺优化酶解，所得酪蛋白磷酸肽的不仅得率高并且与fe2+螯合能力强；

31、(2)本发明选用分子量＜10kda的组分进行纯化，原因在于酪蛋白磷酸肽分子量小利于吸收；

32、(3)进一步地采用hplc进行两次纯化，通过优化色谱柱和纯化条件，可以筛选并分离出fe2+螯合活性最高的吸收峰，在保证酪蛋白磷酸肽得率的同时保证了对fe2+螯合活性；

33、(4)本发明的酶解和纯化工艺简单，可操作性强，为酪蛋白磷酸肽的大规模生产应用奠定了基础。