一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法
【专利摘要】一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法，涉及一种具有高效抑藻活性的脂类化合物。所述高效抑藻活性化合物的菌株为弧菌（Vibrio?sp.）BS02，保藏编号为CCTCCNO：M2010217。所述源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸的分子式为C16H30O2，分子量大小为254。将菌株BS02发酵培养，得含有强抑藻活性化合物的发酵液，离心后，收集上清液，再分离纯化，即得具有强抑藻活性的化合物源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸。所述源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸能够高效、专一地杀灭藻细胞，具有开发成抑藻剂的潜能，在生物降解藻类、治理赤潮方面具有广泛的应用。
【专利说明】一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有高效抑藻活性的脂类化合物，尤其是涉及一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来，伴随着水产养殖业的大力发展，以及逐年增多的填海造地，不规范的近海海域开发利用，使得水产养殖区水体生态系统遭到破坏，水体生态系统紊乱，氮磷污染消纳能力下降，自净功能逐步丧失，导致我国近海营养盐负荷较重的海区富营养化程度居高不下，赤潮时有发生。素有“水体癌症”之称的有害藻华不仅导致沿海地区出现了严重的生态、资源、环境问题，同时也使沿海城镇的经济蒙受巨额损失。仅2012年以来，福建沿海就发生了八起赤潮，其中5月份平潭流水、苏澳码头附近海域和龙风头海滨浴场海域所引发的赤潮导致逾5000万只鲍鱼死亡，直接经济损失达2亿元人民币。故此，有害赤潮作为水产养殖业的致命杀手，已经引起政府和地区的密切关注，如何研制新型、高效的赤潮调控方法并制定有关赤潮防治对策已成为各级政府和科研工作者的当务之急！
[0003]塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)是一种能产生麻痹性贝毒素(PSP)的海洋甲藻，是当前有害赤潮主要原因藻种之一，其所产生的PSP毒素不仅对生态环境产生不利的影响，同时也对人类的健康及海洋经济的发展造成了巨大的威胁。鉴于塔玛亚历山大藻的各种危害，对其防治显得越来越重要。当前藻类控制技术可归结为:物理方法、化学方法及生物防治，其中溶藻微生物防治技术因具有成本低、安全性好的潜能，引起了越来越多研究人员的关注。溶藻细菌(Algicidal bacteria)是一类以直接或间接方式抑制藻类生长，或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌的统称，具有较好的生态安全性，尤其适合在赤潮发生初期使用，在短期内即可 达到控制藻类生物量，阻止藻类大量增殖的效果，势必成为赤潮生物防治的一个重要手段。目前，国内外已有不少对溶藻细菌的报道。
[0004]至今为止，大多数筛选到的杀藻细菌是通过分泌特异的具有杀藻活性的物质来起杀藻作用的。已经报道的杀藻活性物质包括:蛋白质(含胞外酶)、多肽、氨基酸、抗生素、含氮化合物等其他尚未定性的杀藻化合物(Paul C.,Pohnert G.1nteractionsof the Algicidal Bacterium Kordia algicida with Diatoms:Regulated ProteaseExcretion for Specific Algal Lysis[J].PLoS One，2011，6(6):e21032 ;Chen W.M., SheuF.S.，Sheu S.Y.Novel L—amino acid oxidase with algicidal activity against toxiccyanobacterium Microcystis aeruginosa synthesized by a bacterium Aquimarinasp [J].Enzyme Microb Technol，2011，49 (4): 372-379 ;0h J.1.，Kim M.J.，Lee J.Y.，Ko
1.J.，Kim W.，Kim S.W.1solation and characterization of algicidal bacteriafrom Cochlodinium polykrikoides culture[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2011，16 (6): 1124-1133 ；Lee S.0.，Kato J.，Takiguchi N.，Kuroda A.，IkedaT., Mitsutani A., Ohtake H.1nvolvement of an extracellular protease in algicidalactivity of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp.strain A28[J].ApplEnviron Microbiol, 2000, 66(10):4334-4339)。
【发明内容】
[0005]本发明的第一目的是提供一种生产所述高效抑藻活性化合物的菌株及其筛选方法。
[0006]本发明的第二目的是提供一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法。
[0007]本发明的第三目的是提供一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸在制备抑藻剂中的应用。
[0008]所述高效抑藻活性化合物的菌株 为弧菌(Vibrio sp.)BS02，该菌已于2010年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2010217，保藏中心地址为:中国武汉武汉大学，邮编430072。
[0009]所述弧菌(Vibrio sp.) BS02的筛选方法包括以下步骤:
[0010]I)取福建漳江口红树林国家自然保护区土壤样品，无菌水经过一系列10倍稀释后，每个稀释液取0.1mL涂布在高氏一号培养基平板上,在25°C下培养5d ；
[0011]2)挑取不同菌落大小、形态单菌落划线于2216E固体平板，置于28~37°C温度下培养3~5d，验证是否纯培养，重复该步骤直到得到纯培养；
[0012]3)将纯化后的菌株接种于4mL海水配制的高氏一号液体培养基中，置于28°C摇床，150rpm震荡培养3d，取培养液于10，000~12，OOOg的条件下离心lOmin，除去菌体沉
淀，保存上清；
[0013]4 )取ImL上清接种于20mL指数生长的无菌塔玛亚历山大藻培养液中，于20 ± I °C，12h光照，12h黑暗,50 V- mo I photons nT2s4光照强度条件下培养2d,高氏一号培养基为对照加入藻液中，分别设置3个平行；观察塔玛亚历山大藻细胞是否沉降，沉降代表菌体7d培养物上清中含有抑藻活性物质，从而筛选出弧菌(Vibrio sp.)BS02。
[0014]所述源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸的分子式为C16H3tlO2,分子量大小为254，
结构式如下:
[0015]
【权利要求】
1.高效抑藻活性化合物的菌株为弧菌(Vibriosp.)BS02，该菌已于2010年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2010217，保藏中心地址为:中国武汉武汉大学，邮编430072。
2.如权利要求1所述弧菌(Vibriosp.)BS02的筛选方法，其特征在于包括以下步骤: 1)取福建漳江口红树林国家自然保护区土壤样品，无菌水经过一系列10倍稀释后，每个稀释液取0.1mL涂布在高氏一号培养基平板上,在25°C下培养5d ； 2)挑取不同菌落大小、形态单菌落划线于2216E固体平板，置于28~37°C温度下培养3~5d，验证是否纯培养，重复该步骤直到得到纯培养； 3)将纯化后的菌株接种于4mL海水配制的高氏一号液体培养基中，置于28°C摇床，150rpm震荡培养3d，取培养液于10，000~12，OOOg的条件下离心lOmin，除去菌体沉淀，保存上清； 4)取ImL上清接种于20mL指数生长的无菌塔玛亚历山大藻培养液中，于20±1°C，12h光照，12h黑暗,50 V- mo I photons nT2s4光照强度条件下培养2d,高氏一号培养基为对照加入藻液中，分别设置3个平行；观察塔玛亚历山大藻细胞是否沉降，沉降代表菌体7d培养物上清中含有抑藻活性物质，从而筛选出弧菌(Vibrio sp.)BS02。
3.源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸，其特征在于其分子式为C16H3tlO2,分子量大小为254，结构式如下:
4.如权利要求3所述源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)将弧菌(Vibriosp.)BS02菌株接种于新鲜海水配制的固体2216E平板上画线分离，于28°C恒温培养箱中培养24h ;挑取所述平板上的单菌落接种于海水配制的高氏一号液体培养基中，于28~37°C，180~250rpm培养2~3d后即得发酵液； 2)将步骤I)中的发酵液于10，000~12，OOOg离心IOmin;采用乙酸乙酯等体积萃取5次，将乙酸乙酯萃取相合并，旋转蒸干，加甲醇溶解离心，去盐、去蛋白； 3)乙酸乙酯萃取物溶于ImL乙酸乙酯中，上样于硅胶柱，所述硅胶柱为170mmX30mm，200~300目，洗脱剂:二氯甲烷和乙酸乙酯的不同比例混合，洗脱程序:体积比1: 0，30min ；1: I, 30min ；1: 0, 30min ;洗脱流速:lmL/min ;用收集管收集洗脱液2mL/管； 4)每隔10~15min收集样品，收集管内洗脱液利用薄层层析分析，扩增剂为乙酸乙酯，采用紫外显色，碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，合并相似组分； 5)合并洗脱液于旋转蒸发仪30°C下真空蒸干，溶解于DMSO验证抑藻活性； 6)活性组分再通过硅胶柱，所述硅胶柱为170mmX30mm，200~300目；层析，洗脱剂:正己烧和乙酸乙酯的不同比例混合，洗脱程序:体积比100: I, 30min ；60: I, 30min ；40: I, 30min ；20: I, 30min ;洗脱流速:lmL/min ;用收集管收集洗脱液2mL/管；重复步骤4)和5)检测活性组份； 7)上述所得活性组份利用S^hadexLH - 20葡聚糖凝胶柱进一步分离，洗脱流动相采用99%甲醇，每6min收集一组分；收集管内洗脱液利用薄层层析分析，采用紫外显色，碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，合并相似组分，于旋转蒸发仪30°C下真空蒸干，溶解于DMSO验证抑藻活性，得源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸。
5.如权利要求3所述源于`海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸在制备抑藻剂中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK103484409SQ201310451825
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】郑天凌, 李 东, 安新丽, 张化俊, 李祎, 郑伟, 陈章然 申请人:厦门大学