毛乳头细胞的培养方法

文档序号:519971阅读:4754来源:国知局
毛乳头细胞的培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种毛乳头(DP)细胞的培养方法,该培养方法能够长期培养DP细胞,并成功应用于DP细胞建系。
【专利说明】毛乳头细胞的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】,具体而言,涉及一种毛乳头细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002]毛发在皮肤特定部位具有相应的密度及形态,它对人体具有防御、保护功能外,还具有增加信息交流和美观的作用。毛发由毛囊生成,毛囊具有周期性再生的特性,即经历生长期、退化期、静止期的循环。其中,由静止期向生长期的转换,即生长期启动为最关键的环节。当毛囊的周期性再生功能发生障碍时,就会出现脱发、斑秃等毛囊相关疾病。随着社会发展,人们对具有保护与美观作用的毛发越来越重视,对毛囊周期性再生的研究将显得越来越重要。
[0003]由于毛囊具有周期性生长的特性,为组织再生研究提供了一个非常好的模型。毛囊的周期性生长由毛囊干细胞介导发生,和其他干细胞一样,毛囊干细胞的静息与活化受到干细胞微环境的调控。毛囊干细胞位于毛囊隆突区,人们对影响毛囊干细胞自我更新和分化的微环境因素了解的还不多。
[0004]特别引人注意的是,在毛囊干细胞的周期性活动过程中,毛乳头(dermalpapilla,DP)居于非常特殊的地位。DP是真皮中的一群特化的间充质来源的细胞。大量研究表明:出生后的每一个毛囊周期中DP和毛囊干细胞均会发生定期的,规律性的接触,而这种接触在静止期末或生长期启动时最为紧密,说明DP细胞可能为毛囊干细胞提供微环境支持,并在毛囊周期性再生的起始阶段发挥作用。基因敲除研究发现,DP缺失,不能形成完整的毛囊2 ;随后又发现,DP是一个分泌因子的中心,可以生成大量的信号分子;最近的研究表明,这些信号分子所激活的信号通路是毛囊周期性生长的重要调控因素,它们在毛囊生长的不同时期发挥着不同的调节作用。
[0005]已有报道,将DP细胞制成微囊能够诱导大鼠耳毛囊再生,并有将人DP细胞条件培养液用于斑秃治疗的临床试验报道。这些应用都需要大量的DP细胞,因此,DP细胞的大量培养是毛囊周期相关疾病治疗需要解决的关键技术之一。不少学者尝试进行DP细胞原代培养,发现随着DP细胞培养代数的增加,其生物学活性快速改变;当传代至第6代时,细胞丧失诱导毛囊生长的特性。
[0006]可见,DP细胞在毛囊周期中具有极其重要的作用。因此,获取大量的DP细胞就成为治疗毛囊周期障碍相关疾病的重要条件。

【发明内容】

[0007]本发明的目的是提供一种毛乳头(DP)细胞的培养方法,该培养体系能够长期培养DP细胞,并成功应用于DP细胞建系。
[0008]本发明一方面涉及一种毛乳头细胞的培养方法,其特征在于包括如下步骤:
[0009]配制溶液:L 0.25% Dispase(中性蛋白酶,也称为分散酶)溶液的配制:准确称取0.25g Dispase酶粉末,加入100ml0.01M PBS溶液,完全溶解后抽滤分装,4°C或_20°C保存;
[0010]2.2mg / ml 胶原酶的配制:用 TESCA 缓冲液(50mM TES, 0.36mM CaCl2, ρΗ7.4)在37°C配制,配好后-20°C分装保存;
[0011]3.DP培养基的配制:a-MEM基础培养基,加入10%胎牛血清,100X丙酮酸钠,100Χ非必需氨基酸,1000Χ青链霉素,IOng / ml bFGF ;
[0012]培养过程:
[0013]1.取新生8~9d健康C57小鼠I只,颈椎脱臼处死,酒精棉球消毒触须部位;眼科剪垂直皮肤剪下大鼠两边触须皮肤,放入装有D-Hank’s液的培养皿中;用镊子夹着皮肤清洗,吸去多余D-Hank’s液;
[0014]2.解剖显微镜下用27号针头将毛囊连同结缔组织鞘一起分出来,并转移到另一个装有D-Hank’s培养基的培养皿中;
[0015]3.分离完毕后,在超净台中用吸管将D-Hank’s液吸干,加入质量分数为0.25%的Dispase,20min(10_30min);
[0016]4.消化完成后,将毛囊转移到大的培养皿中,加入D-Hank’s液将Dispase稀释(少量多次),手术显微镜下将毛囊从真皮鞘中分离出来
[0017]5.在手术显微镜下分离毛乳头,收集移入离心管;
[0018]6.向离心管中加入0.2%`胶原酶,37°C消化5-6小时;
[0019]7.消化5-6小时后,离心管中加入DMEM培养基终止消化,吹打,离心lOOOrpm,3min ;
[0020]8.弃上清,细胞用DP培养基重悬,于6孔板中培养,培养4d后观察,常规方法传代;
[0021]9.细胞传至第15代及以上时,收集细胞。
【专利附图】

【附图说明】
[0022]图1:免疫荧光鉴定传代15代的原代培养的DP细胞的荧光显微镜照片。
【具体实施方式】
[0023]一、DP细胞培养体系的建立
[0024](一)1型胶原的包被
[0025]1.配制0.01mol / L的HCl, PBS,高压灭菌后备用;
[0026]2.稀释胶原:用0.01mol / L的HCl将I型胶原稀释成50 μ g / ml
[0027]3.包被:六孔板每孔加入2ml (终浓度10 μ g / cm2);
[0028]4.室温放置Ih
[0029]5.吸掉上清
[0030]6.PBS清洗包被板3次
[0031]7.包被板置于4°C备用(可保存I周)
[0032](二)常用试剂的配制
[0033]1.0.25% Dispase(中性蛋白酶,也称为分散酶)溶液的配制:准确称取0.25gDispase酶粉末,加入100ml0.01M PBS溶液,完全溶解后抽滤分装,4°C或_20°C保存。[0034]2.2mg / ml 胶原酶的配制:用 TESCA 缓冲液(50mM TES,0.36mM CaCl2, ρΗ7.4)在37°C配制,配好后-20°C分装保存
[0035]3.DP培养基的配制:a-MEM基础培养基,加入10%胎牛血清,100Χ丙酮酸钠,100Χ非必需氨基酸,1000Χ青链霉素,IOng / ml bFGF。
[0036](三)实验步骤
[0037]1.取新生8~9d健康C57小鼠I只,颈椎脱臼处死,酒精棉球消毒触须部位。眼科剪垂直皮肤剪下大鼠两边触须皮肤,放入装有D-Hank’s液的培养皿中。用镊子夹着皮肤稍做清洗,吸去多余D-Hank’s液;
[0038]2.解剖显微镜下(X3.2)用27号针头将毛囊连同结缔组织鞘一起分出来,并转移到另一个装有D-Hank’s培养基的培养皿中;
[0039]3.分离完毕后,在超净台中用吸管将D-Hank’s液吸干,加入质量分数为0.25%的Dispase,20min(10_30min);
[0040]4.消化完成后,将毛囊转移到大的培养皿中,加入D-Hank’s液将Dispase稀释(少量多次),手术显微镜下将毛囊从真皮鞘中分离出来
[0041]5.在手术显微镜下分离毛乳头,收集移入离心管;
[0042]6.向离心管中加入0.2%胶原酶,37°C消化5-6小时;
[0043]7.消化5-6小时后,离心管中加入DMEM培养基终止消化,吹打,离心lOOOrpm,3min ;
`[0044]8.弃上清,细胞用DP培养基重悬,于6孔板中培养,培养4d后观察,常规方法传代;
[0045]9.细胞传至第15代及以上时,收集细胞。
[0046]10.传代至第15代时,用建立的培养体系培养的DP细胞仍表达DP细胞特异性标记物FGF7和a-SMA进行鉴定,鉴定结果显示(如图1所示)所建立的DP细胞培养体系,培养DP细胞15代后,细胞仍保持原代细胞特性,实验进一步证实其仍具有诱导毛囊生长的特性。因此,利用该方法可以获取足量的DP细胞,用于科学研究和临床治疗。所建立的DP细胞株,具有与原代DP细胞相同的基因表达模式。因此,除用于科学研究和临床治疗外,还可用于大规模的中试研究。
[0047]以上所述是本发明的优选实施例,应当指出,对于本【技术领域】的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种毛乳头细胞的培养方法,其特征在于包括如下步骤: 配制溶液: 0.25% Dispase (中性蛋白酶,也称为分散酶)溶液的配制:准确称取0.25g Dispase酶粉末,加入100ml0.01M PBS溶液,完全溶解后抽滤分装,4°C或_20°C保存; 2mg / ml 胶原酶的配制:用 TESCA 缓冲液(50mM TES, 0.36mM CaCl2, pH7.4)在 37。。配制,配好后_20°C分装保存; DP培养基的配制:a-MEM基础培养基,加入10%胎牛血清,100Χ丙酮酸钠,100Χ非必需氨基酸,1000Χ青链霉素,IOng / ml bFGF ; 培养过程: 1)取新生8~9d健康C57小鼠I只,颈椎脱臼处死,酒精棉球消毒触须部位;眼科剪垂直皮肤剪下大鼠两边触须皮肤,放入装有D-Hank’ s液的培养皿中;用镊子夹着皮肤清洗,吸去多余D-Hank’s液; 2)解剖显微镜下(X3.2)用27号针头将毛囊连同结缔组织鞘一起分出来,并转移到另一个装有D-Hank’s培养基的培养皿中; 3)分离完毕后,在超净台中用吸管将D-Hank’s液吸干,加入质量分数为0.25 %的Dispase,室温消化 10_30min,优选 20min ; 4)消化完成后,将毛囊转移到大的培养皿中,加入D-Hank’s液将Dispase稀释,手术显微镜下将毛囊从真皮鞘中分离出来; 5)在手术显微镜下分离毛乳头,收集移入离心管; 6)向离心管中加入0.2%胶原酶,37°C消化5-6小时; 7)消化5-6小时后,离心管中加入DMEM培养基终止消化,吹打,离心lOOOrpm,3min; 8)弃上清,细胞用DP培养基重悬,于6孔板中培养,培养4d后观察,常规方法传代; 9)细胞传至第15代及以上时,收集细胞。
2.权利要求1所述的培养方法所构建的毛乳头细胞系。
【文档编号】C12N5/071GK103497930SQ201310451331
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】李玉红 申请人:李玉红
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