一种发芽糙米抗氧化肽的提取方法
【专利摘要】一种发芽糙米抗氧化肽的提取方法，包括以下步骤：（1）糙米浑浊液制备；（2）中性蛋白酶水解；（3）灭酶；（4）离心分离；（5）真空浓缩；（6）冷冻干燥。本发明之发芽糙米抗氧化肽的提取方法，产率高，成本低，产品性能稳定，且在生产规模从实验室扩大至中试和工业化的过程中，其相关技术参数不需再次优化，为大规模工业生产提供了有利条件。
【专利说明】一种发芽糙米抗氧化肽的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种发芽糙米抗氧化肽的提取方法，尤其涉及一种采用高速剪切和酶辅助偶联技术提取发芽糙米抗氧化肽的方法。
【背景技术】
[0002]随着近年来生物活性肽研究的进展，人们发现，从天然动植物蛋白质提取分离的多肽，具有抗氧化特性强、活性稳定、无毒副作用及来源方便等优点，被广泛应用于医药和食品领域。
[0003]稻米作为我国的主食，其含有的营养成分和生物活性物质种类和数量直接影响全民的身体素质。大米蛋白质具有高生物效价、低过敏性等重要特点，而大米蛋白经酶作用制备的多肽已经被证明具有较强的抗氧化活性(张君慧.大米蛋白抗氧化肽的制备、分离纯化和结构鉴定[D].无锡:江南大学，2009)。
[0004]发芽糙米是将糙米经发芽至一定的芽长，所得到的一种由幼芽和带糠层的胚乳组成的糙米制品，与普通大米相比，其营养素更丰富，所含大米蛋白抗氧化肽也更丰富(何新益等.糙米发芽前后抗氧化活性比较研究[J].中国粮油学报，2009，24 (11):6-8.)。
[0005]目前，大米抗氧化肽的制备方法，主要有酶法制备(张君慧等.大米蛋白酶解制备抗氧化肽的研究[J]，食品与发酵工业，2008，34 (5):71-75)与超声波预处理结合酶法制备(贾俊强等.超声预处理大米蛋白制备抗氧化肽[J]，农业工程学报，2008，24(8):288-293)两种。这些方法，制备时间长，效率低，DPPH清除能力损失率高。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是，提供一种制备效率高，产品纯度高及抗氧化活性高，制造成本低，适于工业化生产的从发芽糙米提取抗氧化肽的方法。
[0007]本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种发芽糙米抗氧化肽的提取方法，包括以下步骤:
(1)糙米浑浊液制备:取新制备的发芽糙米，在常温下，加入PH值8.(TpHll (优选PH9.5)的碱液，发芽糙米的质量与浸泡碱液体积之比为Ig: 4~7 mL (优选Ig: 5 mL),浸泡2~5h (优选4 h)，然后采用高速组织捣碎机在剪切速度500(Tl0000rpm (优选8000r/min)条件下剪切5~15 min (优选8min),获得糙米浑池液；
(2)中性蛋白酶水解:采用0.8~1.2mol/L (优选1.0moI/L)的酸液将步骤(I)所得糙米浑浊液的pH调至7.0，添加糙米浑浊液质量的4.5^10 %(优选5.0%)的中性蛋白酶，搅拌，在温度30~40 V (优选35°C)的条件下酶解反应80~120 min (优选lOOmin)，每隔4~8min (优选5min)采用0.05-0.15 mol/L (优选0.lmol/L)的NaOH溶液将酶解液的pH控制在6.5~7.5 (优选7.0)之间;所述中性蛋白酶的酶活优选IX 106U/g ；
(3)灭酶:步骤(2)所述酶解反应结束后，将酶解液温度升至7(T98°C，高温灭酶5~20min,然后冷却至常温，采用0.05-0.15 mol/L NaOH溶液将酶解液pH值调至8.(Tl0.0 ；(4)离心分离:将步骤(3)获得的酶解液在200(T4000rpm离心1(T20 min，获上清液；
(5)真空浓缩:将步骤(4)获得的上清液经半透膜脱盐，在0.01-0.06MPa，40-60°C进行真空浓缩，浓缩至原液体积的5~15% ；
(6)冷冻干燥:将步骤(5)所得的浓缩液冷冻干燥至粉末状，预冻速率为f5°C/min，干燥室真空度为50~500 Pa，在-30~-10°C时预冻10~30 min干燥至水分含量为5~10%，即为发芽糙米多肽产品成品。
[0008]进一步，所述步骤(I)中的碱液为碳酸盐缓冲溶液。
[0009]进一步，所述碳酸盐为碳酸钠或者碳酸氢钠。
[0010]进一步，步骤(2)中，所述酸液为柠檬酸溶液或者盐酸溶液。
[0011]以上所述步骤(3)灭酶、(4)离心分离、(5)真空浓缩、(6)冷冻干燥均有现有技术可资借鉴，本说明书所述工艺条件只是优选条件。
[0012]发芽糙米多肽抗氧化活性评价方法:
①总还原能力的测定:发芽糙米多肽总还原能力参考MerZametov和GadzhieVa的方法(Merzametov MM, Gadzhieva L1.Certain amino acids as antioxidants in butterfat.1zv, Ucheb.zavcd pischew.Technol, 1976，115:21-27),即取一定浓度发芽糖米多肽溶液lmL，加入0.2 M的磷酸盐缓冲液(pH6.6) 2.5mL和1%的铁氰化钾溶液2.5mL,充分混合后，在50 1:下，保温20 min后加入10%的三氯乙酸，经充分混合，3000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加入蒸馏水2.5 mL和0.1% FeC13 0.5mL，然后在700 nm处测定吸光值。
[0013]②轻自由基的清除能力测定:通过Fenton反应测发芽糙米肽清除.0H的能力。取ImL 5mmol/L邻二氮菲乙醇溶液于试管中依次加入2mL pH7.40的0.2mol/L磷酸缓冲溶液和ImL样品溶剂充分混匀后，加入ImL 5mmol/L硫酸亚铁溶液，混匀后加入ImL双氧水，于37°C水浴60min后，在波长536nm处测其吸光度得到A.未损伤管以ImL蒸馏水代替损伤管中ImL 0.1%的双氧水，样品管以ImL样品溶液代替损伤管中的I mL样品溶剂，其他同损伤管，测得未损伤管的吸光度及样品管的吸光度(A #)，按以下公式计算.0 H清除率。
[0014].0 H 清除率(％)=100X 样损)/ 未损)
③总抗氧化能力检测:发芽糙米多肽总抗氧化能力检测采用总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)，即取一定浓度发芽糙米多肽溶液40 μ L，添加4ml的ABTS测定液，充分震荡30s，然后在用30摄氏度水浴60min，最后在734nm波长处测定其吸光度值。ABTS清除率的计算公式:清除率=(l-Aff/0.700) X 100。
[0015]本发明采用高速剪切和酶辅助偶联相结合的技术提取发芽糙米抗氧化肽，与现有技术中的酶处理方法相比，具有以下优势:第一，发芽糙米经高速剪切作用细胞破壁，使得更多的大米蛋白进入到溶液中，提高了蛋白酶与底物(蛋白质)的接触机会；第二，发芽糙米的蛋白质在高速剪切作用下，会部分变性，能够被蛋白酶酶解的酰胺键曝露，促进了多肽的生成。
[0016]本方法采用高速剪切和酶辅助偶联技术从发芽糙米中提取抗氧化肽，与从普通的精米和糙米中提取抗氧化肽，不仅抗氧化肽得率高(高达10%以上)，所得抗氧化肽的抗氧化活性也更高。[0017]本发明之发芽糙米抗氧化肽的提取方法，产率高，成本低，产品性能稳定，且支持工业化应用，在生产规模从实验室扩大至中试和工业化的过程中，其相关技术参数不需再次优化。为大规模工业生产提供了有利条件。
【具体实施方式】
[0018]以下通过实施例对本发明作进一步详细说明。
[0019]实施例:
(1)取新制备的发芽糙米100g，于室温下，在500mL 0.5 mol/L碳酸钠缓冲溶液(pH9.5)中，浸泡4 h，然后采用DS-高速组织捣碎机在剪切速度8000 r/min条件下剪切8min,获发芽糙米浑池液；
(2)采用1.0 mol/L盐酸溶液将糙米浑浊液的pH值调至7.0，添加糙米浑浊液质量的5.0 %的中性蛋白酶(酶活lX106U/g)，磁力搅拌，在温度35°C的条件下酶解反应lOOmin，每隔5min采用0.lmol/L的NaOH标准溶液将酶解液的pH控制在6.9~7.1之间；
(3)待酶解反应结束后，将酶解液温度升至85°C，高温灭酶10min，冷却至常温，用0.1mol/L的NaOH标准溶液将酶解液pH调至9.5 ；
(4)将获得的酶解液在4500r/min离心15 min，获上清液；
(5)经半透膜脱盐，真空浓缩将获得的上清液经半透膜脱盐，真空度为0.03 MPa，温度45°C条件下进行真空浓缩，浓缩至原液体积的10% ；
(6)将步骤(5)所得的浓缩液冷冻干燥至粉末状，预冻速率为2°C/min，干燥室真空度为100 Pa，在-25°C时预冻20 min干燥至水分含量为8 %，得发芽糙米多肽2.371g。
[0020]发芽糙米多肽抗氧化活性评价
1、发芽糙米中不同浓度多肽的总还原力
发芽糙米多肽总还原能力参考MerZametov和GadzhieVa的方法,不同浓度的发芽糙米多肽具有不同的总还原力，700 nm处测定吸光值测定，结果如下下表1所示:
表1 700 mn处测定吸光値涵定數裾
【权利要求】
1.一种发芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)糙米浑浊液制备:取新制备的发芽糙米，在常温下，加入PH值为8.(TpHll的碱液，所述发芽糙米的质量与碱液体积之比为Ig: 4~7mL，浸泡2~4h，然后采用高速组织捣碎机在剪切速度500(Tl0000 rpm条件下剪切5~15 min，获得糙米浑浊液； (2)中性蛋白酶水解:采用0.8~1.2mol/L的酸液将步骤(I)所得糙米浑浊液的pH值调至7.0，添加相当于糙米浑浊液质量4.5^10 %的中性蛋白酶，搅拌，在温度3(T40°C的条件下酶解反应80~120 min,每隔4~8min采用0.05-0.15 mo I/L的NaOH溶液将酶解液的pH控制在6.5~7.5之间；所述中性蛋白酶的酶活为lX106U/g; (3 )灭酶:步骤(2 )所述酶解反应结束后，将所得酶解液的温度升至70-98 V，灭酶5~20min，然后冷却至常温，采用0.05-0.15 mo I/L NaOH溶液将酶解液pH值调至8.(Tl0.0 ； (4)离心分离:将步骤(3)获得的酶解液在200(T4000rpm离心1(T20 min，获上清液； (5)真空浓缩:将步骤(4)获得的上清液经半透膜脱盐，在0.01-0.06MPa，40-60°C进行真空浓缩，浓缩至原液体积的5~15% ； (6)冷冻干燥:将步骤(5)所得的浓缩液冷冻干燥至粉末状，预冻速率为f5°C/min，干燥室真空度为50~500 Pa，在-3(T-10°C时预冻10~30 min，干燥至水分含量为5~10%，即成。
2.根据权利要求1所述的发芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步骤(I)中，所述碱液为碳酸盐缓冲溶液。
3.根据权利要求2所述的发芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，所述碳酸盐缓冲溶液为碳酸钠缓冲溶液或者碳酸氢钠缓冲液。
4. 根据权利要求1~3之一所述的发芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酸液为柠檬酸溶液或者盐酸溶液。
5.根据权利要求1~3之一所述的发芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步骤Cl)中，所述pH值为9.5。
6.根据权利要求1~3之一所述的发芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发芽糙米的质量与浸泡碱液体积之比为Ig: 5mL。
7.根据权利要求1~3之一所述的发芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步骤Cl)中，所述浸泡的时间为4h，剪切速度为8000r/min，剪切的时间为8min。
8.根据权利要求1~3之一所述的发芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酸液的浓度为l.0mol/L。
9.根据权利要求1~3之一所述的发芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述中性蛋白酶的加入量相当于糙米浑浊液质量的5.0%。
10.根据权利要求9所述的发芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，酶解反应温度为35°C，酶解反应时间为100 min，每隔5min采用0.lmol/L的NaOH溶液，将酶解液的pH控制在7.0。
【文档编号】C12P21/06GK103468777SQ201310451624
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】杨涛, 孙术国, 林亲录, 汪龙, 李艳, 梁安怡 申请人:中南林业科技大学