一种获得fshr多种剪接形式全长编码区序列的方法
【专利摘要】本发明提供的一种获得FSHR多种剪接形式全长编码区序列的方法，提取绵羊颗粒细胞的总RNA，反转录成cDNA；依据绵羊FSHR基因cDNA序列的起始密码子上游和终止密码子下游，设计两对引物：上游引物F1：CAAAAGGGCTCAGTGTGGAG;F2：CGTCTGCAGAAGCAGAAGCA；下游引物R1：CTTATGGATGTGCCAGGGAG;R2：AGTGCTCTGTCAGCTCTTGC；用获得的cDNA为模板，进行PCR扩增FSHR基因,采用天根胶回收试剂盒回收PCR产物；PCR产物加A尾及T载体克隆测序验证；获得的FSHR多种剪接形式完整编码区的序列特征为oFSHR695,oFSHR694,oFSHR648,oFSHR633,oFSHR595。
【专利说明】—种获得FSHR多种剪接形式全长编码区序列的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其是获取绵羊促卵泡激素受体(FSHR)基因多种剪接形式完整编码区全序列的方法。
【背景技术】
[0002]研究发现促卵泡激素受体(follicle-stimulatinghormone receptor, FSHR)是主要存在于脊椎动物卵巢颗粒细胞和精巢Sertoli细胞膜上的一种G蛋白偶联受体，在介导FSH调控个体的青春期性成熟、刺激生殖细胞成熟的生理过程中发挥着重要的作用，除此之外，FSHR 还在破骨细胞(Cell.2006Apr21; 125 (2):247-260.)，单核细胞(BiochemBiophys Res Commun.2010Mar26;394(I):12-17.),卵母细胞(J Clin EndocrinolMetab.2002May; 87 (5):2266-2276.)，肿瘤血管壁(N Engl J Med.20100ct21; 363 (17):1621-1630.)等处也有表达，但在这些位置表达的生物学功能还不清楚。
[0003]哺乳动物FSHR共由10个外显子组成，其中前9个外显子编码胞外域，第10个外显子编码7次跨膜结构及胞内域。在哺乳动物中还发现FSHR存在多种剪辑形式。一类是7次跨膜结构域不变，而胞外域外显子多种剪接。在小鼠中可变剪接模式主要体现在缺失第 2 和第 5 外显子上(Biol Reprod.1999Jun; 60 (6):1515-1527, Mol Cell Endocrinol.1994May; 101 (1-2):197-201.)。而在牛卵巢中的可变剪接模式中主要体现在缺失第 4，5，9 外显子(Mol Cell Endocrinol.1996Junl8; 120 (I): 25-30.) ? 在人卵巢中的剪接形式主要是缺失第2，6，9外显子及第8外显子的重复插入(J Clin EndocrinolMetab.2010Feb;95(2):529-36, Biochem Biophys Res Commun.1992Novl6;188 (3):1077-1083.)，在人单核细胞和破骨细胞中FSHR缺失第九外显子(Biochem Biophys ResCommun.2010Mar26; 394 (I): 12-17.)。在绵羊中发现有缺失第8内含子的可变剪接模式(JMol Endocrinol.1995Dec; 15 (3):273-281.)。另一类是在大鼠和绵羊中发现无7次跨膜结构域的可变剪接形式。例如在大鼠中的两种可变剪接形式=FSH-Rl在第9，10外显子之间加入一小段额外的外显子，导致第9外显子后终止。FSH-R2在第4外显子前缺失3个碱基，在之后又连一个额外的外显子并提前终止。FSH-R1，FSH-R2均无7次跨膜结构(J Endocrinol.1998Jul; 158 (I): 127-136.)。在绵羊精巢内发现的FSHR两种可变剪接模式，均缺乏7次跨膜结构:一是编码134个氨基酸(1-4外显子全长)的受体，二是编码259个氨基酸，前8个外显子及单次跨膜结构(BiochemBiophys Res Commun.1993Febl5; 190 (3): 888-894.)。
[0004]FSHR的多种剪接形式可能影响其生物学功能。在牛卵巢黄体形成后，全长的剪接形式的FSHR不再表达，而另外几种剪接形式仍然存在(Mol Cell Endocrinol.1996Junl8; 120 (I):25-30.)。在女性卵巢中发现的四种可变剪接FSHR，三种属于外显子个别缺失， 一种属于外显子插入，并且cAMP活性显著降低(J Clin EndocrinolMetab.2010Feb; 95 (2):529-536.)。在绵羊卵巢中FSHR剪接模式(第8内含子缺失)，其mRNA在成年羊窦前卵泡期仅有一至两层颗粒细胞的腔前卵泡上有表达，直到卵泡闭锁早期；而在胎儿卵巢(妊娠100，120，135天)中，FSHR却在卵泡两层至多层的颗粒细胞上有表达，表明颗粒细胞分化期FSHR开始表达,而非原始卵泡向初级卵泡转化期表达(J Mol Endocrin
ol.1995Dec; 15(3):273-281.)。
[0005]哺乳类性腺中不同剪接体的FSHR具体生物学功能至今还不是很清楚，可能与其物种间多样的繁殖方式有关。比如人类每月排卵一次，属单胎型；而同是哺乳类的小鼠则每8-12天即可排多个卵，属多胎型。FSHR在物种间的差异性剪接可能参与了这种多样化的繁殖模式。[0006]在高等真核生物中，前体mRNA通过不同的剪接方式产生不同的剪接异构体是普遍现象。可变剪接产生的多样性，赋予这些系统精确处理复杂信息相适应的的潜力，对个体分化发育和一些关键的细胞生理过程如凋亡、细胞兴奋等的精确调控有重要意义。对这些不同剪切形式的克隆是对其功能的研究具有重要的意义(Cell.2011Jan7; 144(1):16-26.)。
[0007]RT-PCR克隆:是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)以及分子克隆相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的基因片段，将合成的目的基因片段克隆到载体细胞基因中，然后用质粒PCR产物测序。此技术利用PCR技术能在体外进行有效的基因扩增，而不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其他依靠限制性内切酶消化的方法难于得到的PCR产物；克隆载体PCR测序能克服PCR产物测序引物近端的十几个碱基无法测序获得的缺点。与RACE (cDNA末端快速扩增)技术相比较而言，目的基因片段的长度明确，成本低，工作量小。
[0008]现有技术中采用RACE (cNDA末端快速扩增)技术:是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端的方法。1、目的PCR产物的基因片段长度不明确。2、试验成本高。3、工作量大，实验技术要求高。分段PCR克隆法:将目的基因分成几段来分别克隆，然后做亚克隆测序拼接。成本高，工作量大，一个基因分成几段就需要做几次克隆。
[0009]本发明的关键点是PCR引物的设计，在起始密码子的上游设计上游引物，在终止密码子的下游设计下游引物，一次性PCR扩增即可获得绵羊FSHR多种剪接形式的完整编码区cDNA，为FSHR的生物学功能研究奠定基础。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于:提供的简单、快捷的获取绵羊FSHR基因多种剪切形式完整编码区序列的方法，为研究绵羊中FSHR多种剪接形式的生物学功能奠定了基础。
[0011]本发明的目的是这样实现的:一种获得FSHR多种剪接形式全长编码区序列的方法，
[0012]步骤I提取绵羊颗粒细胞的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ；
[0013]即用IOmL注射器针头抽取绵羊卵泡液，转入1.5mL的离心管中，在12000rpm条件下，离心收集颗粒细胞，弃上清，沉淀加入ImL的Trizol液，然后用ImL注射器反复吹打8-10次，至细胞充分裂解透明，室温放置5-10min ;然后加入0.2mL的氯仿，盖紧离心管，涡旋20sec,在4°C、12000rpm条件下、离心15min ;取上清置于另一新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀8-10次,室温静置IOmin ;在4°C、12000rpm、离心IOmin,弃上清液，加入ImL的75%乙醇混匀；继续在4°C、7500rpm、离心5min，弃上清，然后用移液枪吸干管壁上多余的乙醇，室温晾置3-5min乙醇挥发干；沉淀加入50 μ L的无RNase水溶解，溶解后取2 ii L RNA琼脂糖凝胶电泳，将质量好的RNA立即反转录成cDNA ；
[0014]步骤2引物的设计及PCR反应；
[0015]依据绵羊FSHR基因cDNA序列(Genbank ID:NM_001009289)的起始密码子上游和终止密码子下游，分别设计两对引物:
[0016]上游引物Fl:CAAAAGGGCTCAGTGTGGAG ；F2:CGTCTGCAGAAGCAGAAGCA ；
[0017]下游引物Rl:CTTATGGATGTGCCAGGGAG ；R2:AGTGCTCTGTCAGCTCTTGC ；
[0018]用步骤I获得的cDNA为模板，以引物对F1/R1进行PCR扩增FSHR基因，PCR扩增体系为 50 ii L:5 X Prime STAR BufferlOu L, dNTP Mixture (各 2.5mM) 4 y L, Fl (10 y M) I yL, Rl (10 u M) I u L, cDNA 模板 I y L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5U/ u L) 0.5 u L,灭菌蒸馏水 32.5iiL。反应条件:98°C 5min;98°C 10s, 58°C 15s, 68°C 90s, 30 个循环，68°C延伸IOmin ;4°C终止反应；
[0019]步骤3PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收；
[0020]PCR产物经1.0%琼脂糖100V电泳分离后，在紫外光下用消毒刀片切下与预期片段大小一致的DNA条带， 用天根胶回收试剂盒回收PCR产物，取2 ii L回收产物于1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测回收效率和纯度；
[0021]步骤4PCR产物加A尾及T载体克隆测序验证；
[0022]PCR 产物加 A 尾:TaqE (2.5U/ ii L) I ii L ;胶回收产物 5 ii L ；ddH202 U L ；10XTaqEBufferl ii L ; dNTP Mixture (或 dATP) I y L ;72°C、30min 水浴。目的片段与载体连接，连接产物的转化，蓝白斑筛选，内部引物(F2/R2)菌液验证，送阳性克隆测序，测序结果在NCBI上用blast在线比对分析。
[0023]本发明的技术特点及效果:设计的特异引物可一次性获得绵羊FSHR多种剪接形式的cDNA，经内部引物验证保证挑取的单克隆阳性，经测序验证其剪接形式。设计利用高保真DNA聚合酶的低错配率及普通DNA酶的加A尾特点、蓝白斑筛选以及槽式PCR内部引物的高特异性筛选等一系列的组合，一次性获得绵羊FSHR多种剪接形式全长编码区的序列。该技术相比较分段克隆和RACE技术而言，目的PCR片段的长短大致明确，只需克隆一次，具有成本低，效率闻的优势，为进一步研究绵羊的该基因功能提供了基础材料，彰显技术进步。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]本发明结合附图作进一步说明。
[0025]附图1绵羊FSHR基因的全长编码区的扩增电泳图；
[0026]如图所示:F1/R1扩增产物约2000bp的特异性条带，而单引物和水对照组均无扩+?
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[0027]附图2绵羊FSHR弓丨物菌液验证PCR产物电泳图；
[0028]如图所示:F1/R1引物PCR产物所获得的单克隆可由内部特异引物F2/R2扩增出符合预期大小的条带(约1900bp),单引物F2, R2,水对照均无阳性条带。
[0029]附图3绵羊FSHR基因多种剪接形式模式图；
[0030]如图所示:上面10个数字表示对应的外显子序列，左侧文字下标表示该剪接模式所对应的氨基酸数量；下面三种所缺少的色块，表示缺失相应的外显子序列。【具体实施方式】
[0031]以下结合实施例对发明作进一步说明。
[0032]实施例
[0033]步骤I提取绵羊颗粒细胞中的总RNA (核糖核酸)，然后将总RNA反转录成cDNA ；
[0034]1.组织的采集
[0035]屠宰场采集绵羊卵巢，在灭菌生理盐水中保温30°C，2h内运至实验室，在实验室用IOmL灭菌注射器抽取颗粒细胞及卵泡液，抽取的卵泡液和颗粒细胞转移至1.5mL离心管内进行离心，4°C,4000rpm,5min,弃上清，留沉淀，沉淀用于RNA的提取。
[0036]2.RNA的制备及cDNA的合成
[0037]在1.5mL的EP管沉淀上，加入1.0mL的Trizol液，用ImL灭菌注射器反复抽打10-20次，至细胞完全裂解溶液透亮，室温放置5min。
[0038]用IOmL注射器针头抽取绵羊卵泡液，拣出卵母细胞，1.5mL的EP管中离心收集颗粒细胞，加入ImL的Trizol液，然后用ImL注射器反复吹打约10次，至细胞充分裂解透明，室温放置5-10min ;加入0.2mL的氯仿，盖紧离心管，涡旋20s，然后4°C、12000rpm、离心15min,;取上清置于1.5m L离心管中，加入等体积的异丙醇，温和颠倒混匀10次，室温静置IOmin ;4°C、12000rpm、离心 IOmin ;弃上清液，加入 ImL 的 75 % 乙醇混匀，4°C, 7500rpm、离心5min ;小心弃去上清，然后用移液枪吸干管壁上多余的乙醇，加入50μ L的DEPC水；溶解后，取2uL琼脂糖凝胶检测RNA的质量，将效果好的RNA立即反转录成cDNA。
[0039]步骤2引物的设计及PCR反应；
[0040]依据已公布的绵羊的FSHR基因的序列(Genbank ID:ΝΜ_001009289),设ii 对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计。
[0041]设计的引物为:
[0042]上游引物F1: CAAAAGGGCTCAGTGTGGAG;
[0043]F2:CGTCTGCAGAAGCAGAAGCA，
[0044]下游引物Rl:CTTATGGATGTGCCAGGGAG;
[0045]R2:AGTGCTCTGTCAGCTCTTGC ；
[0046]用cDNA为模板进行PCR操作扩增FSHR基因。高保真酶扩增，PCR反应体系为50 μ L:5 XPrime STAR BufferlOy L, dNTP Mixture (各 2.5mM) 4 μ L, Fl (10 μ Μ) I μ L, Rl (10μ Μ) I μ L, cDNA 模板 I μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5U/ μ L) 0.5 μ L,灭菌蒸馏水32.5 μ L0 反应条件:98°C 5min;98°C 10s，58°C 15s, 68°C 90s, 30 个循环，68°C延伸 IOmin ;4 °C终止反应。
[0047]步骤3PCR产物的回收和加A尾；
[0048]PCR产物用天根胶回收试剂盒纯化回收，操作步骤如下:
[0049]a.PCR产物经1.0%琼脂糖100V电泳分离后，在紫外光下用消毒刀片切下与预期片段大小一致的DNA条带，装入1.5mL的EP管中并称取重量。
[0050]b.向胶块中加入等倍体积溶液PC (若凝胶重为0.lg，其体积可视为100 μ L)，放置于50°C水浴锅中放置lOmin，以确保胶块重复溶解，中间取出离心管温和的上下翻转离心管3次。[0051]c.胶溶解后放至室温,转入吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心lmin。
[0052]d.弃离出液，将柱子重新放入收集管中，向吸附柱CB2中加入600 ii L漂洗液PW，静置3min，然后离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
[0053]e.向吸附柱CB2中加入600 y L漂洗液PW，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液。
[0054]f.将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置5min,彻底晾干。
[0055]g.将离心柱CB2放入一个新1.5mL离心管中，向CB2离心柱内的吸附膜中间位置悬空滴加30 ii L洗脱缓冲液(EB)，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液，保存与-20°C，备用。
[0056]h.取2 ii L回收产物于1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测回收效率和纯度。
[0057]PCR 产物加 A 尾:TaqE (2.5U/ U L) I U L ;胶回收产物 5u L ；ddH202u L ； 10 X TaqEBufferl u L ；dNTP Mixturel u L ;72°C，水浴 30min。
[0058]步骤4克隆:
[0059](I)目的片段与载体连接
[0060]将回收、检测后的目的片段与pMDK19-T Vector连接，参照TaKaRa的
Vector试剂盒使用说明书，连接体系为:
[0061]
【权利要求】
1.一种获得FSHR多种剪接形式全长编码区序列的方法，其特征在于: 步骤I提取绵羊颗粒细胞的总RNA,反转录成cDNA ； 即用10 mL注射器针头抽取绵羊卵泡液，转入1.5mL的离心管中，在12000rpm条件下，离心收集颗粒细胞，弃上清，沉淀加入I mL的Trizol液，然后用I mL注射器反复吹打8-10次，至细胞充分裂解透明，室温放置5-10 min,然后加入0.2 mL的氯仿，盖紧离心管，涡旋20 sec,在4°C、12000 rpm条件下、离心15 min,取上清置于另一1.5 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀8-10次,室温静置10 min,在4°C、12000rpm、离心10 min,弃上清液，加入I mL的75%乙醇混匀，继续在4°C、7500 rpm、离心5 min，弃上清，然后用移液枪吸干管壁上多余的乙醇，室温晾置3-5min至乙醇挥发，沉淀加入50 y L的无RNase水溶解，溶解后取2 UL RNA琼脂糖凝胶电泳，将质量好的RNA立即反转录成cDNA ； 步骤2引物的设计及PCR反应； 依据绵羊FSHR基因cDNA序列的起始密码子上游和终止密码子下游，设计两对引物:上游引物 Fl:CAAAAGGGCTCAGTGTGGAG; F2:CGTCTGCAGAAGCAGAAGCA ；
下游引物 Rl:CTTATGGATGTGCCAGGGAG; R2:AGTGCTCTGTCAGCTCTTGC ； 用步骤I获得的cDNA为模板，以弓丨物对F1/R1进行PCR扩增FSHR基因，PCR扩增体系为 50 ii L:5 XPrime STAR Buffer 10 u L, 2.5mM dNTP Mix2.5mM ture4 u L, IOuMFl I u L, IOuM Rl I u L, cDNA 模板 I y L，2.5U/y L PrimeSTAR HS DNA Polymerase0.5 u L,灭菌蒸馏水 32.L ;反应条件:98°C 5min、98°C 10s、58°C 15s、68°C 90s,30个循环，68°C延伸10min，4°C终止反应； 步骤3 PCR产物的纯化回收； PCR产物经1.0%琼脂糖100V电泳分离后，在紫外光下用消毒刀片切下与预期片段大小一致的DNA条带，用天根胶回收试剂盒回收PCR产物，取2 ii L回收产物于1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测回收效率和纯度； 步骤4 PCR产物加A尾及T载体克隆测序验证； PCR 产物加 A 尾:2.5U/iiL TaqE I U L、胶回收产物 5 ii L、ddH20 2 U L,IOXTaqE Buffer I y L、dNTP Mixture或dATP I u L,72°C 30min水浴，目的片段与载体连接，产物转化，蓝白斑筛选，F2/R2菌液验证，送阳性克隆测序，测序结果在NCBI上用blast在线比对分析。
2.依据权利要求1所述的方法，其特征在于:获得的FSHR多种剪接形式完整编码区的序列特征为 QFSHR695, OFSHR694, OFSHR648, OFSHR633, OFSHR5950
【文档编号】C12N15/10GK103740697SQ201310452672
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】吴阳升, 黄俊成, 蒋香菊, 林嘉鹏, 汪立芹, 刘明军, 陆立里 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心