焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分的引物和方法
【专利摘要】本发明公开了一种焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分的引物和方法，正向引物序列为SEQ?ID?NO1；反向引物序列为SEQ?ID?NO2；测序引物序列为SEQ?ID?NO3；方法包括下列步骤：首先依据大豆GlymBd30K基因设计特异性PCR引物和焦磷酸测序引物；再提取待测样品的DNA，然后分别以GlymBd30K基因的特异性引物进行PCR扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为188bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有过敏原成分。本发明所建立的大豆过敏原基因GlymBd30K焦磷酸测序方法能够快速对目的基因进行测序，具有较高的特异性；该方法具有快速、稳定性好、灵敏、特异性高的特点。
【专利说明】焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分的引物和方法
[0001]【技术领域】:
本发明属于食源性过敏原的检测【技术领域】，涉及一种采用焦磷酸测序iPyrosequencing)技术检测大豆蛋白过敏原的方法。
[0002]【背景技术】:
世界粮农组织(FAO) 1995年报告，90%以上的食物过敏是由牛奶、鸡蛋、鱼、贝壳海产品、花生、大豆、坚果类和小麦引起。大豆蛋白属于8类主要致过敏食物之一，大豆是人类主要的蛋白来源之一。大豆蛋白在食品加工业的广泛应用，给大豆敏感人群带来了一定的食物安全问题。
[0003]GlymBd 30K也称为P34，是半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族的一个边缘成员。Ogawa等的与IgE结合试验中表明，超过65%以上对大豆敏感的病人仅对GlymBd 30K蛋白过敏，即使是种子的一小部分(小于总种子蛋白的1% )，因此GlymBd 30K蛋白被视为大豆蛋白中一个重要的免疫显性过敏原。早在1998年Takano T就在NCBI数据库中提交了大豆Gly mBd 30K的DNA序列(AB013289)，而2006年SchmidtM A在NCBI的核酸数据库中提交了大豆GlymBd 30K的mRNA序列(DQ324851)。目前国内关于大豆过敏原成分的研究报道很少，本发明首次建立大豆GlymBd 30K基因的焦磷酸测序快速检测方法，将为我国进出口大豆及其制品的过敏原快速检测提供很好的技术支撑。
[0004]
【发明内容】
:
本发明所要解决的技术问题是提供一种大豆GlymBd 30K基因的焦磷酸测序技术检测确证方法，以克服现有检测技术的不足。
[0005]为解决上述技术问题，本发明的主要原理是利用焦磷酸测序技术，通过测序引物和聚合酶链式反应扩增单链脱氧核糖核酸模板杂交，与脱氧核糖核酸聚合酶、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物(APS)、荧光素孵育，逐一加入四种三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs):三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP，如与模板配对，此三磷酸碱基脱氧核苷酸与引物的末端形成共价键，释放焦磷酸基团(PPi);腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶在底物(APS)存在的情况下催化焦磷酸形成腺嘌呤核苷三磷酸，腺嘌呤核苷三磷酸驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，氧化荧光素发出与腺嘌呤核苷三磷酸量成正比的可见光信号；光信号由电荷耦合器件(CCD)收集并由软件转化为峰；每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比，腺嘌呤核苷三磷酸和未掺入的三磷酸碱基脱氧核苷酸由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系，利用光信号转化得到的峰图，对样品中的目标基因进行准确的检测。
[0006]一种焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分的方法，包括下列步骤:
首先依据大豆GlymBd 30K基因设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸(DNA)，然后分别以GlymBd 30K基因的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为188bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有过敏原。
[0007]设计的焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分的引物:
正向引物序列为 SEQ ID NO 1:5’ - GCGGATGGTGTAGATTACTGGA -3’ ；
反向引物序列为SEQ ID NO 2:5’ - ACCTTTAACGCGAGCAGACA _3，;5，进行生物素标记。
[0008]测序引物序列为SEQ ID NO 3:5’ - CAAAGAAACACGGGTAA -3’。 [0009]大豆过敏原GlymBd 30K 基因的目标序列为 SEQ ID NO 4:TTTATTAGGAGTGTGTGGGATGAATTATTTGCTCACTACCC ;扩增片段长度为 188bp ；
具体包括下列步骤:
(一)DNA模板的制备
样品处理:取大豆等试验材料，用灭菌洁净研钵或合适的粉碎装置将样品充分研磨混勾备用；
DNA模板的提取:取200 mg样品于50 mL离心管中，加入5 mL CTAB提取缓冲液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混匀；65 °C振荡过夜后，13 000 g离心20 min，转移上清液700 μ L至新的离心管中；加入700 μ L三氯甲烧后用力振荡，13 000 g离心5 min,将上清转移到新的2 mL印pendorf离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温静置60 min, 13 000 g离心5 min,弃去上清；加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮,再加入350 UL三氯甲烷，涡旋振荡进行混匀，13 000 g离心10 min。转移上清到新的2 mL印pendorf离心管中后加入0.8倍体积的异丙醇，室温放置60 min, 13 000 g离心10min，弃去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存备用；
(二)PCR扩增
PCR反应体系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素标记上游引物和下游引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加无菌去离子水至50 μ L ;扩增反应参数:94°C预变性5 min，94°C变性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50个循环，72 °C延伸5 min, 4 °C保温；取反应产物5 μ L上样，2%琼脂糖凝胶电泳观察结果，其余扩增产物用于焦磷酸测序；
(三)焦磷酸测序
将PCR产物转移至96孔PCR板中，在产物中分别加入Sepharose beads 3 μ L和Binding Buffer 47 μ L,常温混匀 10 min ；
打开真空泵，将磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超纯水中清洗30s后移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分别在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中变性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,关闭真空泵,将磁珠释放入96孔测序板中，该板中预先加入测序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;
将96孔测序板置80 °C温箱2 min,冷却至室温后进行焦磷酸测序反应，设定程序，碱基的加入为ATCG 6-10个重复，根据程序给定剂量(该剂量根据样本数的多少而定，由仪器程序自动给出)，在试剂舱中加入酶混合物、底物混合物以及四种dNTP，将试剂舱和96孔测序板放入机箱中进行反应。
[0010]本发明所建立的大豆过敏原基因Glym Bd 30K焦磷酸测序方法能够快速对目的基因进行测序，尚未出现假阳性和假阴性结果。具有较高的特异性；该方法具有快速、稳定性好、灵敏、特异高的特点。焦磷酸测序技术作为一种短片段测序方法，操作简单方便，可程序化，能够很好地保证测序结果的稳定性和准确性，另外该方法检测速度快，40 min内即可准确、实时的测定出96个样品目的片段的基因序列，可满足快速检测的需求，具有不可替代的作用。
[0011]【专利附图】
【附图说明】:
图1为本发明实施例1 PCR扩增引物特异性实验结果电泳图，图中，1:绿豆；2:赤豆；3 工豆；4:蚕豆；5:50 bp ladder marker ；6:大豆；7:芸豆；8:扁豆；9:花生；10:豌豆。
[0012]图2为本发明实施例1特异性实验中焦磷酸测序结果图。
[0013]图3为本发明实施例2实验结果电泳图，图中，M:100 bp ladder marker ；1为大丑中黄57样品。
[0014]图4为本发明实施例2实验结果焦磷酸测序结果图。
[0015]图5为本发明实施例3实验结果电泳图，图中,M:50 bp ladder marker ;I为样品维维牌维他型豆奶粉。
[0016]图6为本发明实施例3实验结果焦磷酸测序结果图。
[0017]【具体实施方式】:
下面通过具体实施例并结合附图进一步阐述本发明。
[0018]实施例1:PCR扩增引物特异性实验
(I)样品材料:从青岛市抚顺路批发市场购买绿豆、赤豆、豇豆、蚕豆、大豆、芸豆、扁豆、花生、豌豆。
[0019](2) DNA模板的制备
样品处理:取IOOg大豆等试验材料，用灭菌洁净研钵或合适的粉碎装置将样品充分研磨混匀备用；
DNA模板的提取:取200 mg样品于50 mL离心管中，加入5 mL CTAB提取缓冲液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混匀；65 °C振荡过夜后，13 000 g离心20 min，转移上清液700 μ L至新的离心管中；加入700 μ L三氯甲烧后用力振荡，13 000 g离心5 min,将上清转移到新的2 mL印pendorf离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温静置60 min, 13 000 g离心5 min,弃去上清；加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮,再加入350 UL三氯甲烷，涡旋振荡进行混匀，13 000 g离心10 min。转移上清到新的2 mL印pendorf离心管中后加入0.8倍体积的异丙醇，室温放置60 min, 13 000 g离心10min，弃去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存备用；
(3) PCR扩增
PCR反应体系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素标记上游引物和下游引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加无菌去离子水至50 μ L ;扩增反应参数:94°C预变性5 min，94°C变性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50个循环，72 °C延伸5 min, 4 °C保温；取反应产物5 μ L上样，2%琼脂糖凝胶电泳观察结果，其余扩增产物用于焦磷酸测序；
扩增结果见图1，结果表明只有大豆能够有效扩增出目的片断，其余豆类样品无特异性片断出现。
[0020](4)焦磷酸测序
将大豆的PCR产物转移至96孔PCR板中，在产物中分别加入Seharose beads 3 μ L和 Binding Buffer 47 μ L,常温混匀 10 min ；
打开真空泵，将磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超纯水中清洗30s后移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分别在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中变性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,关闭真空泵,将磁珠释放入96孔测序板中，该板中预先加入测序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;
将96孔测序板置80 °C温箱2 min,冷却至室温后进行焦磷酸测序反应，设定程序，碱基的加入为ATCG 6-10个重复，根据程序给定剂量(该剂量根据样本数的多少而定，由仪器程序自动给出)，在试剂舱中加入酶混合物、底物混合物以及四种dNTP，将试剂舱和96孔测序板放入机箱中进行反应。
[0021]焦磷酸测序结果见图2。 [0022]测序结果为TTTATTAGGAGTGTGTGGGATGAATTATTTGCTCACTACCC，与预期一致能够有效测出目标序列，并鉴定出含有大豆过敏原成分。
[0023]实施例2:检测某一大豆样品中是否含有大豆过敏原成分
(I)样品材料:从青岛团岛农贸市场购买大? (品种为中黄57) 500g。
[0024](2) DNA模板的制备
样品处理:取100 g大豆，用灭菌洁净研钵或合适的粉碎装置将样品充分研磨混匀备
用；
DNA模板的提取:取200 mg样品于50 mL离心管中，加入5 mL CTAB提取缓冲液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混匀；65 °C振荡过夜后，13 000 g离心20 min，转移上清液700 μ L至新的离心管中；加入700 μ L三氯甲烧后用力振荡，13 000 g离心5 min,将上清转移到新的2 mL印pendorf离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温静置60 min, 13 000 g离心5 min,弃去上清；加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮,再加入350 UL三氯甲烷，涡旋振荡进行混匀，13 000 g离心10 min。转移上清到新的2 mL印pendorf离心管中后加入0.8倍体积的异丙醇，室温放置60 min, 13 000 g离心10min，弃去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存备用；
(3)PCR扩增
PCR反应体系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素标记上游引物和下游引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加无菌去离子水至50 μ L ;扩增反应参数:94°C预变性5 min，94°C变性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50个循环，72 °C延伸5 min, 4 °C保温；取反应产物5 μ L上样，2%琼脂糖凝胶电泳观察结果，其余扩增产物用于焦磷酸测序。
[0025]扩增结果见图3，结果表明大豆中黄57能够有效扩增出特异性片断。
[0026](4)焦磷酸测序
将大豆中黄57的PCR产物转移至96孔PCR板中，在产物中分别加入S^harose beads3 μ L 和 Binding Buffer 47 μ L,常温混匀 10 min ；
打开真空泵，将磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超纯水中清洗30s后移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分别在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中变性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,关闭真空泵,将磁珠释放入96孔测序板中，该板中预先加入测序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;将96孔测序板置80 °C温箱2 min,冷却至室温后进行焦磷酸测序反应，设定程序，碱基的加入为ATCG 6-10个重复，根据程序给定剂量(该剂量根据样本数的多少而定，由仪器程序自动给出)，在试剂舱中加入酶混合物、底物混合物以及四种dNTP，将试剂舱和96孔测序板放入机箱中进行反应。
[0027]焦磷酸测序结果见图4。[0028]测序结果为TTTATTAGGAGTGTGTGGGATGAATTATTTGCTCACTACCC，能鉴定出此样品含有大豆过敏原成分。
[0029]实施例3:超市购买样品检验是否含有大豆过敏原成分
(O样品材料:从青岛双星利客来超市购买维维牌维他型豆奶粉I袋(生产代码201306025275H)。
[0030](2) DNA模板的制备
DNA模板的提取:取200 mg样品于50 mL离心管中，加入5 mL CTAB提取缓冲液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混匀；65 °C振荡过夜后，13 000 g离心20 min，转移上清液700 μ L至新的离心管中；加入700 μ L三氯甲烧后用力振荡，13 000 g离心5 min,将上清转移到新的2 mL印pendorf离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温静置60 min, 13 000 g离心5 min,弃去上清；加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮,再加入350 UL三氯甲烷，涡旋振荡进行混匀，13 000 g离心10 min。转移上清到新的2 mL印pendorf离心管中后加入0.8倍体积的异丙醇，室温放置60 min, 13 000 g离心10min，弃去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存备用；
(3)PCR扩增
PCR反应体系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素标记上游引物和下游引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加无菌去离子水至50 μ L ;扩增反应参数:94 °C预变性5 min, 94°C变性20 S，58 °C退火30 s，72°C延伸20 S，50个循环，72 °C延伸5 min, 4 °C保温；取反应产物5 UL上样，2%琼脂糖凝胶电泳观察结果，其余扩增产物用于焦磷酸测序。
[0031]扩增结果见图5，结果表明维他型豆奶粉中能够有效扩增出特异性片断。
[0032](4)焦磷酸测序
将维维牌维他型豆奶粉的PCR产物转移至96孔PCR板中，在产物中分别加入Sepharose beads 3 μ L 和 Binding Buffer 47 μ L,常温混匀 10 min ；
打开真空泵，将磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超纯水中清洗30s后移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分别在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中变性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,关闭真空泵,将磁珠释放入96孔测序板中，该板中预先加入测序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;
将96孔测序板置80 °C温箱2 min,冷却至室温后进行焦磷酸测序反应，设定程序，碱基的加入为ATCG 6-10个重复，根据程序给定剂量(该剂量根据样本数的多少而定，由仪器程序自动给出)，在试剂舱中加入酶混合物、底物混合物以及四种dNTP，将试剂舱和96孔测序板放入机箱中进行反应。
[0033]焦磷酸测序结果见图6。
[0034]测序结果为TTTATTAGGAGTGTGTGGGATGAATTATTTGCTCACTACCC，表明维他型豆奶粉.含有大豆过敏原成分。
【权利要求】
1.一种焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分的引物，其特征在于: 正向引物序列为SEQ ID NO I ； 反向引物序列为SEQ ID NO 2 ； 测序引物序列为SEQ ID NO 3。
2.一种焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分的方法，其特征在于，包括下列步骤: 首先依据大豆GlymBd 30K基因设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸(DNA)，然后分别以GlymBd 30K基因的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为188bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有过敏原；大豆过敏原GlymBd 30K基因PCR及测序引物为: 正向引物序列为SEQ ID NO I ； 反向引物序列为SEQ ID NO 2 ;5’进行生物素标记； 测序引物序列为SEQ ID NO 3 ； 大豆过敏原GlymBd 30K基因的目标序列为SEQ ID NO 4 ;扩增片段长度为188bp ； 具体包括下列步骤: (一)DNA模板的制备 样品处理:取大豆等试验 材料，用灭菌洁净研钵或合适的粉碎装置将样品充分研磨混勾备用； DNA模板的提取:取200 mg样品于50 mL离心管中，加入5 mL CTAB提取缓冲液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混匀；65 °C振荡过夜后，13 000 g离心20 min，转移上清液700 μ L至新的离心管中；加入700 μ L三氯甲烧后用力振荡，13 000 g离心5 min,将上清转移到新的2 mL印pendorf离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温静置，60 min, 13 000 g离心5 min,弃去上清；加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮,再加Λ 350 μ L三氯甲烷，涡旋振荡进行混匀，13 000 g离心10 min ;转移上清到新的2 mL印pendorf离心管中后加入0.8倍体积的异丙醇，室温放置60 min, 13 000 g离心10min，弃去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存备用； (二)PCR扩增 PCR反应体系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素标记上游引物和下游引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加无菌去离子水至50 μ L ;扩增反应参数:94°C预变性5 min，94°C变性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50个循环，72 °C延伸5 min, 4 °C保温；取反应产物5 μ L上样，2%琼脂糖凝胶电泳观察结果，其余扩增产物用于焦磷酸测序； (三)焦磷酸测序 将PCR产物转移至96孔PCR板中，在产物中分别加入Sepharose beads 3 μ L和Binding Buffer 47 μ L,常温混匀 10 min ； 打开真空泵，将磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超纯水中清洗30s后移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分别在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中变性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,关闭真空泵,将磁珠释放入96孔测序板中，该板中预先加入测序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;将96孔测序板置80 °C温箱2 min,冷却至室温后进行焦磷酸测序反应，设定程序，碱基的加入为ATCG 6-10个重复，根据程序给定剂量(该剂量根据样本数的多少而定，由仪器程序自动给出)，在试剂舱中加入酶混合物、底物混合物以及四种dNTP，将试剂舱和96孔测序板放入机箱 中进行反应。
【文档编号】C12Q1/68GK103468821SQ201310452643
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】房保海, 金莹, 贾俊涛, 姜英辉, 孙涛, 谭乐义, 王妍婷, 雷质文 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心