一种β-琼胶酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种β-琼胶酶及其应用，即一种能够降解琼脂糖产生单一的新琼2糖的β-琼胶酶，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1。本发明的β-琼胶酶能够降解琼脂糖产生单一的新琼2糖，因此可以用于纯的新琼2糖的制备。本发明的大肠杆菌重组株，pETC/BL21所表达的重组琼胶酶占总蛋白的30%，表达水平高，易于纯化，且连续传代后表达量未有所降低。所以可以通过本发明大量制备重组β-琼胶酶和新琼2糖。
【专利说明】—种β-琼胶酶及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于功能基因筛选【技术领域】，具体涉及一种β-琼胶酶及其应用。
【背景技术】
[0002]研究发现海洋红藻细胞壁由两种不同的组份一琼脂糖和琼脂胶组成。其中琼脂糖是两种单糖的聚合物，是由L-3，6-脱水半乳糖(AHG)和D-半乳糖(D-Gal )，以交替的1，3糖苷键和1，4糖苷键连接形成的。新琼寡糖作为琼胶酶水解琼脂胶或者琼脂糖的产物，拥有多种的生物功能，在食品化妆品和医药工业方面具有潜在的应用价值。琼胶酶是降解琼脂胶为寡糖的水解酶，依据水解位点的不同，琼胶酶被分α -琼胶酶(E.C.3.2.1.158)和β -琼胶酶(E.C.3.2.1.81)，α -琼胶酶(E.C.3.2.1.158)断裂α -1, 3键来产生琼寡糖；β -琼胶酶(E.C.3.2.1.81)断裂β -1, 4键产生新琼寡糖。但至今为止大部分的β _琼胶酶，都只能产生新琼寡糖的系列产物，不能产生单一聚合度的寡糖，因此，筛选出一种能够产生单一聚合度寡糖的β-琼胶酶就具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种β -琼胶酶及其应用，即一种能够降解琼脂糖产生单一的新琼2糖的琼胶酶，从而弥补现有技术的不足。
[0004]本发明的β -琼胶酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1 ;
[0005]用于编码上述β -琼胶酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2 ；
[0006]本发明还提供一种重组表达载体，用于表达上述的β -琼胶酶；
[0007]本发明的β -琼胶酶用于降解琼胶制备新琼2糖。
[0008]本发明的β -琼胶酶能够降解琼脂糖产生单一的新琼2糖，因此可以用于纯的新琼2糖的制备。本发明的β-琼胶酶具有良好的生物催化活性，相对其它已知的大部分β -琼胶酶其特点为在反应过程中从始至终均只有单一的新琼2糖产生，这使得其产物中掺杂其他聚合度的新琼寡糖的量非常少，其产物新琼2糖纯度>90%，产率为约为60%。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1:本发明的β -琼胶酶亲和层系后的纯酶SDS-PAGE电泳图，M为Marker。
[0010]图2:本发明的琼胶酶，温度变化对相对酶活的影响(数据均为最少三次重复取平均值)，?代表热稳定性，代表最适温度。
[0011]图3:本发明的β-琼胶酶,pH变化对相对酶活的影响(数据均为最少三次重复取平均值)
[0012]图4:本发明的β -琼胶酶,酶解产物的质谱图，
[0013]图5:本发明的β -琼胶酶，酶解产物的碳谱核磁图。
【具体实施方式】[0014]下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实施例中所用到的实验条件可以根据已有技术进行选择。对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
[0015]对于本发明所涉及的术语解释如下:
[0016]1、β -琼胶酶:糖苷水解酶，一类水解琼脂糖β -1, 4键产生新琼寡糖。
[0017]2、新琼2糖:两种单糖L-3，6-脱水半乳糖(AHG)和D-半乳糖(D-Gal) α-1，3键连接形成的二糖。
[0018]实施例1 β -琼胶酶基 因agWH50C的克隆
[0019]用简并引物PCR以及巢式PCR克隆淡黄色噬琼胶菌WH0801 (NRRLB-59247 (T)或CGMCC1.10131 (T))中的β -琼胶酶基因agWH50C。具体操作:在2216E海水培养基中培养淡黄色噬琼胶菌WH0801直到对数末期，提取DNA基因组。利用简并引物(5’_HTRCCNAAYCAYHTRTAYHTRGGN-3’；5’-VACRAARCCVACRTTRTARTITTC-3’)，以基因组为模板，条件为:94°C 5分钟，然后94°C 30秒，550C 30秒，72°C 3分钟3个步骤进行30个循环，进行PCR，得到了产物为β -琼胶酶基因的片段，再以片段末端序列设计引物，进行一次三轮的巢式PCR回收其中大小在500Kb-2000Kb的PCR产物片段(利用takara公司染色体步移试剂盒)。其中各步骤中的PCR产物均连接T-A克隆载体后转化DH5a挑去单克隆测序。最后拼接最初的片段和巢式PCR所得基因片段，得到β-琼胶酶基因的全长序列。测序表明基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。全长序列以全长序列上游引物和下游引物 5’ -CGAGCTCATGGAGCCAGCAAAT-3’ ； 5’ -CCCTCGAGAACACGAAAGCGITT-3’)鉴定，结果表明获得的序列没有发生拼接错误。基因agWH50C和NCBI中已知基因相比对，和来源于Vibrio sp.EJY3全基因组测序的某琼胶酶基因相似性为64%。说明在序列上agWH50C为一个全新的基因。
[0020]实施例2含β -琼胶酶基因agWH50C表达质粒pETC的构建
[0021]根据已经得到的琼胶酶基因的全长序列设计基因的上游引物和下游引物(见实施例1)，以淡黄色噬琼胶菌WH0801的基因组为模板，利用PCR扩增得到β -琼胶酶基因的全长序列。条件为94°C 2分钟，然后94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 3分钟，30个循环最后72°C延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳显示在2.Skb的位置有明显单一条带，将单一条带切胶回收，测序结果表明实施例1拼接获得的序列没有错误。将回收的条带用Xhol和Sacl双酶切，将表达载体pET21a也用Xhol和Sacl双酶切，然后PCR产物和酶切载体都利用试剂盒进行DNA纯化。然后进行DNA连接反应。连接结束后，按照标准的氯化钙法热激转化将重组质粒转入DH5ci，筛选具有氨苄青霉素抗性的阳性转化子。用标准碱裂解法提取质粒，将质粒用Xhol和Sacl双酶切，凝胶电泳条带显示为2.8Kb和5.3Kb两条清晰条带和β -琼胶酶基因全长和质粒长度相对应。证明琼胶酶基因全长序列已经克隆到表达载体中，将此重组质粒命名为pETC。
[0022]实施例3高效表达β -琼胶酶基因agWH50C的工程菌pETC/BL21的构建
[0023]将表达载体质粒pETC按照标准氯化钙热激转化转入BL21(DE3)中，筛选具有氨苄青霉素抗性的阳性转化子。用标准碱裂解法提取质粒，将质粒用Xhol和Sacl双酶切，凝胶电泳条带显示为2.8Kb和5.3Kb两条清晰条带和β -琼胶酶基因全长和质粒长度相对应。证明含有β_琼胶酶基因的表达载体质粒pETC已经转入BL21 (DE3)。[0024]实施例4利用大肠杆菌工程菌pETC/BL21制备重组β -琼胶酶
[0025]挑取大肠杆菌重组株pETC/BL21单克隆接种在5ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C，230RPM培养12小时。按1: 100转接入100ml含有氨苄青霉素的液体LB培养基。37°C培养OD值600到0.6，加入IPTG至终浓度为ImM，继续培养8小时，4°C，8000g离心10分钟，细胞重悬于20mM pH=8.0Tirs-盐酸缓冲液，将菌悬液置于冰上，超声破碎15分钟，12000gl5分钟除去不可溶成分,上清过0.22um滤膜,上亲和层析柱fastflow his*6(GE)，然后用冲洗缓冲液lml+lml和洗脱缓冲液0.5ml*4冲洗柱子6次，将得到的溶液分别SDS-PAGE检测，合并含有单一目的条带的洗脱液(图1)。用Lowry法测定蛋白浓度。终浓度约为0.3mg/mL.[0026]实施例5测定重组β -琼胶酶的最适反应条件
[0027]反应条件为:测定最适pH时，30度时，在5.0-9.0的pH范围内进行反应。测定最适温度时，pH=6.0时在20-50度反应。反应条件为，90uL 0.2%琼脂糖加入IOuL纯酶，反应I小时，沸水浴2分钟灭活，用DNS法测定。结果如图2，图3所示，重组β-琼胶酶的相对活性在30度和ρΗ=6时达到峰值，在40度和ρΗ=7时骤然下降，可以确定最适反应温度为30度，最适pH值为6。以此结果来确定重组β -琼胶酶的最适反应条件。
[0028]实施例6利用重组β -琼胶酶生产新琼2糖
[0029]利用实施例4制备的重组β -琼胶酶制备新琼寡糖，将琼脂糖溶于ρΗ=6.0的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.05M/ml)，配置成0.1-0.5%的溶液。按重量比0.1-1:100加入重组琼胶酶溶液。混合均匀后在30°C温浴12-48小时。浓缩至小于IOml加入3倍体积乙醇，除去未分解琼脂糖，溶液冻干，为新琼2糖。利用质谱(图4)和核磁共振(图5)进行鉴定.本发明的β_琼胶酶具有良好的生物催化活性，相对其他已知的大部分β_琼胶酶其特点为在反应过程中从始至终均只有单一的新琼2糖产生，这使得其产物中掺杂其他聚合度的新琼寡糖的量非常少，其产物新琼2糖纯度>90%，产率为约为60%。本发明的β -琼胶酶其最适反应温度为30°C，最适pH为6.0，反应条件温和，对环境污染少，这些特点使得本发明筛选的β_琼胶酶具有生产新琼2糖的工业应用潜力。
【权利要求】
1.一种β-琼胶酶，所述的β-琼胶酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种基因，所述的基因用于编码权利要求1所述的β -琼胶酶。
3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列为SEQID Ν0:2。
4.一种重组表达载体，所述的重组表达载体用于表达权利要求1所述的琼胶酶。
5.一种转化体，所述的转化体携带有权利要求4所述的重组表达载体。
6.权利要求1所述的琼胶酶在降解琼胶制备新琼2糖中的应用。
【文档编号】C12P19/12GK103540579SQ201310464445
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】毛相朝, 刘楠, 杨孟, 魏东芝 申请人:中国海洋大学