AGAMOUS基因的cRNA原位杂交探针及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了AGAMOUS基因的cRNA原位杂交探针及其应用。本发明公开的AGAMOUS基因的cRNA原位杂交探针含有SEQ?ID?No.2所示的核苷酸序列。本发明通过地高辛标记的AGAMOUS基因的cRNA探针与大豆顶芽中的AG基因的mRNA发生特异性结合，方便准确地观察到了AG基因的mRNA，可以得出AG基因在mRNA水平上的时空变化。本发明为明确AG等控制拟南芥等模式植物花序发育的基因在大豆中的功能以及进一步通过分子育种手段改良大豆的株型性状奠定了基础。
【专利说明】AGAMOUS基因的cRNA原位杂交探针及其应用【技术领域】
[0001]本发明涉及AGAMOUS基因的cRNA原位杂交探针及其应用。
【背景技术】
[0002]在花器官形态建成的“AB⑶E”模型中，C功能基因AGAMOUS (AG)在花器官发育中扮演着重要的角色，对果实和种子的形成也至关重要。AG基因是最早被克隆的花发育调控基因，AG表达的时空性保证了花器官属性、花器官数量和模式的正确性。
[0003]在形态学研究方面，关于AG基因在大豆中的RNA水平的检测尚属空白。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种AGAMOUS基因的cRNA原位杂交探针及其应用。
[0005]本发明提供的一种AGAMOUS基因的cRNA原位杂交探针含有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0006]一种AGAMOUS基因的cRNA原位杂交探针也属于本发明的保护范围，该探针的序列如 SEQ ID N0.2 所示。
[0007]上述cRNA原位杂交探针的制备方法也属于本发明的保护范围，该方法包括如下步骤:将SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列插入到载体PSPT18的EcoR I和Hind III位点间，得到反向插入的重组质粒；用EcoR I限制性内切酶酶切重组质粒，得到线性质粒；以线性质粒为模板，利用SP6RNA聚合酶对探针进行体外转录同时进行地高辛标记，得到的标记序列即为AG基因的cRNA原位杂交探针。
[0008]上述cRNA原位杂交探针在利用原位杂交方法检测植物组织中AGAMOUS基因的mRNA水平中的应用也属于本发明的保护范围。
[0009]上述应用中，所述植物为大豆；或，所述植物组织为大豆顶芽。
[0010]上述探针在检测植物AGAMOUS基因的mRNA水平中的应用也属于本发明的保护范围。
[0011]上述探针在检测植物AGAMOUS基因的功能中的应用也属于本发明的保护范围。
[0012]上述任一所述的应用中，所述植物为大豆。
[0013]本发明通过地高辛标记的AG基因的cRNA探针与大豆顶芽中的AG基因的mRNA发生特异性结合，方便准确地观察到了 AG基因的mRNA，可以得出AG基因在mRNA水平上的时空变化。本发明为明确AG等控制拟南芥等模式植物花序发育的基因在大豆中的功能以及进一步通过分子育种手段改良大豆的株型性状奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为AG基因的反义探针在大豆顶芽的原位表达。
[0015]图2为AG基因的正义探针在大豆顶芽的原位表达。【具体实施方式】
[0016]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0017]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0018]TIANGEN胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，货号为DP214-02 ；
[0019]具有T7，SP6启动子的转录载体pSPT18购自invitrogen公司，货号为K466001 ；
[0020]EcoR I限制性内切酶购自Takara公司，货号为D1040A ；
[0021]Hind III限制性内切酶购自Takara公司，货号为D1060A ;
[0022]湿盒液:将甲酰胺溶解于0.3M NaCl的水溶液中，最终甲酰胺在湿盒液中的体积百分含量为50% ；
[0023]tRNA 购自 Sigma 公司，货号为 R8759 ；
[0024]Tween_20 购自 Sigma 公司，货号为 P9416 ;
[0025]Ant1-Digoxigenin-AP 购自 Roche 公司，货号为 11093274910 ；
[0026]DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7)购自 Roche 公司，货号为 11175025910 ；
[0027]NBT/BCIP 显色液购自 Roche 公司，货号为 11681451001 ；
[0028]DEPC (diethyl pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)-H2O:将 DEPC 溶于水，使其在DEPC-H2O中的体积百分含量为0.1%，高温高压灭菌；
[0029]实施例中杂交之前的所有步骤所用的水均为DEPC-H2O ；
[0030]蛋白酶K:购自Sigma公司，货号为P6556 ;
[0031]蛋白酶K 缓冲液:20ml 的 lmol/L 的 ρΗ7.5 的 Tris-HCl 溶液，20ml 的 0.5mmol/L的ρΗ8.0的EDTA溶液和200ml的ρΗ7.5的DEPC-H2O混合而成；
[0032]FAA固定液:福尔马林(38%甲醛)5ml、冰醋酸5ml和体积百分含量为70%的酒精90ml混合而成；
[0033]乙酰化溶液:IOmM三乙醇胺溶于100ml DEPC-H2O中，用HCl调成pH8.0，放置5分钟后，加入乙酸酐使其在乙酰化溶液中的体积百分含量为0.25% ；
[0034]Blocking Reagent 购自 Roche 公司，产品目录号为 11096176001 ；
[0035]IOXBlocking solution溶液:2g Blocking Reagent溶于 10ml MABT溶液配制而成；
[0036]Blocking solution 溶液:10 XBlocking solution 溶液用 MABT 溶液稀释 10 倍配制而成；
[0037]0.5%Blocking solution 溶液:Blocking solution 溶液用 MABT 溶液稀释 2OO 倍配制而成；
[0038]MABT 溶液:5.8g 的 Maleic Acid 和 4.1g 的 NaCl 溶于 100ml ddH20 中，用 NaOH 调ρΗ7.5 后，加入 5ml 的 Tween-20，用 ddH20 定容到 500ml ；
[0039]poly A购自上海凯博生物科技有限公司，产品目录号为Z0185 ；
[0040]50%硫酸葡聚糖溶液:5g硫酸葡聚糖加IOmlDEPC-H2O,不断搅动使之完全溶解；
[0041]5mol/L NaCl溶液:5mol氯化钠加IL DEPC-H2O,不断搅动使之完全溶解；
[0042]A液:5ml去离子甲酰胺，lml50%硫酸葡聚糖溶液，ImllOXblocking solution,600 μ I 浓度为 5mol/L 的 NaCl 溶液，100 μ I 浓度为 lmol/L 的 ρΗ7.5 的 Tris-HCl 溶液，20 μ 10.5mol/L 的 ρΗ7.5 的 EDTA 溶液组成；[0043]B 液:3.75 μ I 浓度为 20 μ g/ μ L 的 poly A, 2.25 μ I 浓度为 10mg/ml 的 tRNA,28.2 μ I含有0.6 μ g/ml制备得到的探针的DEPC-H2O混合而成；
[0044]杂交液:由A液和B液组成(B液与A液混合前，B液要在80°C水浴锅中温育5分钟，再冰浴冷却)；
[0045]10XPBT:由 5.80g Na2HPO4.12H20,0.60g NaH2PO4.2Η20，15.20g NaCl，0.04g KCl,2mlTween-20，用 ddH20 定容至 200ml ；
[0046]TNM50:0.58g NaCl, 1.0165g MgCl2.6Η20，1.211g Tris 用 ddH20 定容至 100ml，用盐酸调pH至9.5 ;
[0047]10XTE 溶液:100ml 的 lmol/L pH8 的 Tris-HCl 溶液和 40ml 的 0.5mol/L pH8 的EDTA溶液混合溶于IL ddH20中配制而成。
[0048]实施例1、质粒的构建及探针的制备
[0049]一、重组质粒的构建
[0050](一)根据Genebank中大豆EST序列,设计如下引物:
[0051]上游引物:5’-GGAATTCTGCGACAGCAAATACAGATG-3，；
[0052]下游引物:5’ -CCCAAGCTTGTAAACAGTTCCACCGTCCA-3，。
[0053](下划线所示序列为限制性内切酶识别位点)
[0054](二)以大豆cDNA文库或者顶端花芽的RNA反转录成的cDNA为模板，用步骤(一)中设计的AG的特定引物进行PCR扩增。PCR扩增出的360bp的片段作为大豆中AG基因特异的探针序列，如SEQ ID N0.1所示。
[0055](三)将PCR扩增产物抽提纯化后，用EcoRI和Hind III限制性内切酶进行双酶切，得到探针序列；EcoR I和Hind III双酶切具有SP6、T7启动子的转录载体pSPT18，得到载体大片段；将探针序列与载体大片段连接，得到重组质粒后测序，并确认探针序列插入载体的顺序是反向的。
[0056]二、探针的制备
[0057](一)用EcoRI限制性内切酶酶切重组质粒，得到线性化质粒并用TIANGEN胶回收试剂盒进行回收纯化，用DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7)试剂盒，经SP6RNA聚合酶和地高辛标记的dNTP等对探针进行体外转录和标记，将得到的标记序列作为AG基因的cRNA反义探针，cRNA反义探针的序列如SEQ ID N0.2所示。
[0058](二)用Hind III限制性内切酶酶切重组质粒，得到线性化质粒并用TIANGEN胶回收试剂盒进行回收回收纯化，用DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒，经T7RNA聚合酶和地高辛标记的dNTP等对探针进行体外转录和标记，将得到的标记序列作为AG基因的cRNA正义探针。
[0059]实施例2、cRNA探针的原位杂交
[0060]一、材料的固定
[0061](一)用解剖针将 大豆(豆科大豆属)顶芽部分取出，只留2-3个苞片。
[0062](二)取材后，将其放入FAA固定液中真空抽气15分钟，固定16小时。
[0063](三)将固定好的材料分别经过体积百分含量为50%乙醇的水溶液、70%乙醇的水溶液、80%乙醇的水溶液、90%乙醇的水溶液、95%乙醇的水溶液和100%乙醇逐级脱水，每级2-3次处理,每次脱水30分钟。[0064](四)将脱水的材料分别经过体积比为25:75的二甲苯和乙醇溶液、体积比为50:50的二甲苯和乙醇溶液、体积比为75:25的二甲苯和乙醇溶液和纯二甲苯进行透明处理，每级2-3次，每次透明30分钟。
[0065](五)将透明处理过的材料浸入体积比为50:50的二甲苯和石蜡溶液中，先放置在42°C保温箱至蜡融化后再调至60°C，4-16小时后，将材料浸入纯石蜡中，保温2天，期间更换4次纯石蜡。
[0066](六)浸蜡后，将材料包埋入纯石蜡中，4°C保存。
[0067]二、组织切片的制备
[0068](一)用手摇切片机将步骤一得到的材料切成8μπι厚的蜡带，置于载玻片的DEPC-H2O 上，42 °C 展片。
[0069](二)展片后，将载玻片放于42°C温箱中粘片24小时。
[0070](三)将粘好材料的载玻片(切片)先经过100%二甲苯(2次，每次15分钟)，再依次经过体积比为2:1的二甲苯和乙醇溶液、体积比为1:2的二甲苯和乙醇溶液、体积百分含量为100%乙醇、100%乙醇、90%乙醇的水溶液、70%乙醇的水溶液、50%乙醇的水溶液、30%乙醇的水溶液、10%乙醇的水溶液、DEPC-H2O和DEPC-H2O进行复水处理，每级复水2分钟。
[0071](四)将切片用37°C预热的含1-5μ g/ml蛋白酶K的蛋白酶K缓冲液中，37°C处理30分钟，再用DEPC-H2O洗涤2-3次。
[0072](五)将切片放入 现用现配的乙酰化溶液，温育5分钟。
[0073](六)用DEPC-H2O将20X SSC稀释成2 X SSC，将上述清洗过的切片用2 X SSC处理15分钟。
[0074](七)将切片依次经过体积百分含量为10%乙醇的水溶液、30%乙醇的水溶液、50%乙醇的水溶液、70%乙醇的水溶液、90%乙醇的水溶液、100%乙醇和100%乙醇进行脱水处理，每级处理2分钟。
[0075](A)将切片风干后置_20°C下保存备用。
[0076]三、原位杂交
[0077](一)将两张切片置于42°C温箱中晾片I小时。
[0078](二)分别在切片上加AG基因的cRNA反义探针或AG基因的cRNA正义探针的杂交液75-150 μ 1，覆盖上parafilm膜，置于放有湿盒液饱和吸水纸的湿盒中在48°C杂交16-20小时。
[0079](三)用DEPC-H2O将20X SSC稀释成4 X SSC，用4 X SSC洗涤各切片，室温下洗涤4次，每次5-10分钟。
[0080](四)将切片置于37°C预热的含25μ g/ml RNase A的RNase缓冲液中，37°C消化30分钟。
[0081](五)用不含RNaseA的RNase缓冲液37°C洗涤各切片2次，每次15分钟。
[0082](六)用2X SSC室温漂洗各切片2次，每次30分钟。
[0083](七)用(1(1!120稀释20\55(:得到的0.1 X SSC洗涤各切片，57°C，漂洗2次，每次30分钟。
[0084](八)用ddH20稀释10XPBT制成1XPBT，用IXPBT平衡各切片5分钟。
[0085](九)用0.5%Blocking solution,封闭各切片 30-60 分钟。[0086](十)用IXPBT平衡各切片I分钟。
[0087]^一)显色检测
[0088]1、在 135μ1 的 IXPBT 溶液中加入 15yll0mg/ml BSA 和0.5 μ lAnt1-Digoxigenin-AP,制成抗体浓度为 2.5U/ml 的 Ant1-Digoxigenin-AP 溶液，将Ant1-Digoxigenin-AP抗体溶液加到各切片上，将切片在湿室中放置30-120分钟。
[0089]2、用I XPBT室温漂洗各切片2次，每次20分钟。
[0090]3、用I XTW50室温平衡各切片5分钟。
[0091]4、在各切片上加NBT-BCIP反应液显色液，室温暗中显色30分钟-24小时，此过程观察切片呈色强度。
[0092]5、显色完成后，用pH8.0TE溶液终止反应(TE溶液为用ddH20稀释10XTE制成)。
[0093]6、采用Olympus体视显微镜(型号为BHS)进行观察和显微照相。
[0094]AG基因的cRNA反义探针在大豆顶芽的原位杂交结果如图1所示。
[0095]AG基因的cRNA正义探针在大豆顶芽的原位杂交结果如图2所示。
[0096]图1表明采用AG基因的cRNA反义探针能方便准确地观察到组织中的AG基因的mRNA水平，图2表明作为对照的AG基因的cRNA正义探针则不能与组织中的AG基因的mRNA杂交，证明了 AG基因的cRNA反义探针的可用性。
【权利要求】
1.一种AGAMOUS基因的cRNA原位杂交探针，该探针含有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
2.—种AGAMOUS基因的cRNA原位杂交探针，该探针的序列如SEQ ID N0.2所示。
3.权利要求1或2所述的cRNA原位杂交探针的制备方法，包括如下步骤:将SEQIDN0.1所示的核苷酸序列插入到载体pSPT18的EcoR I和Hind III位点间，得到反向插入的重组质粒；用EcoR I限制性内切酶酶切重组质粒，得到线性质粒；以线性质粒为模板，利用SP6RNA聚合酶对探针进行体外转录同时进行地高辛标记，得到的标记序列即为AG基因的cRNA原位杂交探针。
4.权利要求1或2所述的cRNA原位杂交探针在利用原位杂交方法检测植物组织中AGAMOUS基因的mRNA水平中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述植物为大豆；或，所述植物组织为大豆顶芽。
6.权利要求1或2所述的探针在检测植物AGAMOUS基因的mRNA水平中的应用。
7.权利要求1或2所述的探针在检测植物AGAMOUS基因的功能中的应用。
8.根据权利要求6或 7所述的应用，其特征在于:所述植物为大豆。
【文档编号】C12Q1/68GK103525811SQ201310464117
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】姜妍, 胡珀, 韩天富, 吴存祥, 侯文胜 申请人:中国农业科学院作物科学研究所