分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法

分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法。该方法包括将接种物接种于动物细胞培养基中进行原代培养，再将原代培养得到的细胞进行传代培养，得到动物间充质干细胞；其中所述接种物为对长骨破碎液进行离心得到的沉淀，所述长骨破碎液是将离体的动物长骨于缓冲溶液中破碎至0.5-2立方毫米颗粒得到的混合物；所述方法不包括用胶原酶消化的步骤，所述方法不除去所述动物长骨的骨髓。本发明充分利用了骨髓及骨片，处理简单、短时间内可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，是一种方便、快捷、高效的MSC分离培养方法。
【专利说明】分罔培养动物骨髓间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。MSC具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。MSC主要来源于骨髓，但在骨髓中，MSC的含量很少，每IO4-1O5 个单核细胞大约含 I 个MSC(Morikawa S，Mabuchi Y, Kubota Y, et al.Prospectiveidentification, isolation,and systemic transplantation of multipotentmesenchymal stem cells in murine bone marrow.J Exp Med.2009.206.2483-2496)。目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的(SoleimanijM.，&Nadri，S.A protocol for isolation and culture of mesenchymalstem cells from mouse bone marrow.Nat.Protoc.2009.4.102-106 ；Sun S，GuoZ，Xiao X，et al.1solation of mouse marrow mesenchymal progenitors by a noveland reliable method.Stem Cells.2003.21.527-535)。然而该方法获得的 MSC 往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化(Zhu，H.，Guoj Z.K.，Jiang, X.X.，et al..A protocol forisolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.Nat.Protoc.2010.5.550-560 ;Guo，Z.Li，H.，Li，X.，et al.1n vitro characteristicsand in vivo immunosuppressive activity of compact bone-derived murinemesenchymal progenitor cells.Stem Cells2006.24.992-1000)。虽然该方法获得的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化(Houlihan，D.D.，Mabuchij Y.，Morikawaj S.，et al.1solation of mousemesenchymal stem cells on the basis of expression of Sca-1and PDGFR- a.Nat.Protoc.2012.7.2103-2111 ；Baddoo Mj Hill Kj Wilkinson R，et al.Characterization ofmesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection.J Cell Biochem.2003.89.1235-1249)。虽然这两种方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性。而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这两种方法的广泛应用。因此需要建立一种从骨髓中分离培养MSC的高效方法。
【发明内容】

[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种获得高纯度和高单位数量(每根长骨得到的MSC)分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法，该方法还具有MSC出现时间早、不需除去骨髓、不需消化、操作简便和快捷的优点。
[0004]本发明所提供的分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法，包括将接种物接种于动物细胞培养基中进行原代培养，再将原代培养得到的细胞进行传代培养，得到动物骨髓间充质干细胞；其中，所述接种物为对长骨破碎液进行离心得到的沉淀，所述长骨破碎液是将离体的动物长骨于缓冲溶液中破碎至0.5-1.5立方毫米颗粒(如I立方毫米颗粒)得到的混合物；
[0005]所述方法不包括用胶原酶消化的步骤，所述方法不除去所述动物长骨的骨髓。
[0006]上述方法中，所述长骨由骨干和骨骺两部分组成，表面覆有骨膜和关节软骨，内部为骨髓腔，其中充满骨髓。
[0007]上述方法中，所述动物可为脊椎动物。所述脊椎动物可为哺乳动物，如小鼠。
[0008]上述方法中，所述长骨为股骨或/和胫骨或/和来源于前肢骨的长骨。
[0009]上述方法中，所述离心可为300g_500g离心5-10，如400g离心5分钟。
[0010]所述缓冲溶液可为使动物细胞保持活性的液体，如0.01M、pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液。
[0011]上述方法中，所述动物细胞培养基可为用于贴壁细胞培养的哺乳动物细胞培养基，如MEM培养基、DMEM培养基。在本发明的一个实施例中，所述动物细胞培养基为a-MEM完全培养液。
[0012]上述方法中，所述传代培养可为进行至少2次传代培养，如进行2次传代培养。
[0013]本发明还提供了制备上述用于分离培养动物骨髓间充质干细胞的接种物的方法。
[0014]本发明所提供的制备用于分离培养动物骨髓间充质干细胞的接种物的方法，包括:
[0015]1)将离体的动物长骨于缓冲溶液中破碎至0.5-1.5立方毫米颗粒(如I立方毫米颗粒)得到长骨破碎液；
[0016]2)将步骤I)得到的长骨破碎液进行离心，取沉淀，该沉淀即为用于分离培养动物骨髓间充质干细胞的接种物。
[0017]该制备上述用于分离培养动物骨髓间充质干细胞的接种物的方法中，所述动物可为脊椎动物。所述脊椎动物可为哺乳动物，如小鼠。所述长骨可为股骨或/和胫骨或/和来源于前肢骨的长骨。
[0018]所述离心可为300g_500g离心5-10，如400g离心5分钟。
[0019]所述缓冲溶液可为使动物细胞保持活性的液体，如0.01M、pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液。
[0020]实验证明，本发明获得的所述动物骨髓间充质干细胞为梭形细胞，表达Seal，⑶44，⑶29，不表达内皮细胞标志⑶31及造血细胞标志⑶45。本发明获得的所述动物骨髓间充质干细胞在成骨和成脂诱导体系中培养能分化为成骨细胞和脂肪细胞。本申请通过比较全骨髓贴壁法、骨片消化法及本发明的骨髓加骨片法，发现本发明的骨髓加骨片法是一种方便、快捷和有效的分离培养MSC的方法。本申请的实验结果显示，本发明的骨髓加骨片法出现的MSC克隆时间最早，克隆数量最多，第四天克隆数为20±4个/根股骨；骨片消化法为11.5 ±2.5个/根股骨；全骨髓贴壁法最少，为9.5± 1.5个/根股骨；到第三代时，本发明的骨髓加骨片法获得细胞数量最多，是全骨髓贴壁法和骨片消化法的两倍。
[0021]本发明的骨髓加骨片法将股骨和/或胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消化，直接剪碎，缓冲液洗后重悬于哺乳动物细胞培养基中直接接种。相比全骨髓贴壁法及骨片消化法，骨髓加骨片法出现小鼠MSC克隆的时间早，数量多。虽然第一代消化细胞仍有少量⑶45阳性细胞，但到第三代，MSC纯度可达95%以上，而且获得的MSC总数要高于全骨髓贴壁法及骨片消化法。与其他方法获得的MSC相似，本发明的骨髓加骨片法获得的MSC高表达Seal,⑶44，⑶29等，不表达内皮细胞标志⑶31及造血细胞标志⑶45。该方法获得的MSC在成骨和成脂诱导体系中培养能分化为成骨细胞和脂肪细胞。综上所述，本发明的骨髓加骨片法充分利用了骨髓及骨片，处理简单、短时间内可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，是一种方便、快捷、高效的MSC分离培养方法。
【专利附图】

【附图说明】
[0022]图1为MSC的原代培养。
[0023]A为接种于6孔板72h的细胞形态。
[0024]B为接种第4天的细胞数量。
[0025]C为原代培养5天⑶45阳性细胞比例。
[0026]图2为传代后的细胞形态和细胞数。
[0027]A为第三代细胞的形态。
[0028]B为第二代细胞和第三代细胞的细胞数。
[0029]图3为分别全骨髓组(BM)、骨片消化组(Bone)及骨髓加骨片组(BM+Bone)的第三代细胞表型鉴定。
[0030]图4为骨髓加骨片组(BM+Bone)的第三代细胞的分化能力。
[0031]A、骨髓加骨片组(BM+Bone)的第三代细胞经HG-DMEM培养液(含10%胎牛血清)培养I周后的ALP染色结果。
[0032]B、骨髓加骨片组(BM+Bone)的第三代细胞经成骨诱导分化完全培养液培养I周后的ALP染色结果。
[0033]C、骨髓加骨片组(BM+Bone)的第三代细胞经HG-DMEM培养液(含10%胎牛血清)培养2周后Von Kossa染色结果。
[0034]D、骨髓加骨片组(BM+Bone)的第三代细胞经成骨诱导分化完全培养液培养2周后Von Kossa染色结果。
[0035]E为骨髓加骨片组(BM+Bone)的第三代细胞经HG-DMEM培养液(含10%胎牛血清)培养I周后油红O染色结果。
[0036]F为骨髓加 骨片组(BM+Bone)的第三代细胞经成脂诱导分化完全培养液培养I周后油红O染色结果。
【具体实施方式】
[0037]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038]下述实施例中的主要试剂与仪器如下:
[0039]a -MEM 培养液(Gibco 公司，cat.n0.12000-022)，DMEM-HG 培养液(Gibco 公司，cat.n0.10566-024)，胎牛血清(上海依科赛生物制品有限公司产品cat.n0.FSP500)；
0.01M、pH7.2-7.4的PBS，地塞米松，磷酸化维生素C，β -磷酸甘油，II型胶原酶，胰酶，油红O染液,碱性磷酸酶试剂盒为Sigma公司产品；检测MSC表型相关抗体:FITC ant1-mouseCD45、APC ant1-mouse 1-A/I_E、PerCP ant1-mouse/human CD44、PE ant1-mouse CD31、APCant1-mouse/rat CD29>PerCP ant1-mouse Ly_6A/E(Sca_l)均为 BD 公司产品；25cm2、75cm2培养瓶(costar)，6孔/48孔培养板(Falcon，nunc);流式细胞仪(美国BD公司)，细胞培养箱(Thermo Forma),生物净化工作台(北京中化生物技术研究所/伟达净化技术研究所合制，X90-3),倒置显微镜(日本Olympus公司),低速离心机(中佳SC-3610)。
[0040]实施例1、分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法
[0041]本实施采用了三种分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法，分别为全骨髓贴壁法(简称BM)、骨片消化法(简称Bone)和骨髓加骨片法(简称BM+Bone)。这三种方法的接种物均来源于同一只C57BL/6小鼠的股骨。全骨髓贴壁法的接 种物是离体的小鼠股骨的骨髓，骨片消化法的接种物是小鼠股骨的骨片，骨片按照如下方法制备:将全骨髓贴壁法中除去骨髓后剩余的股骨(将完整的股骨的骨髓去除后剩余的那部分)于0.01M、pH7.2-7.4的PBS剪碎至I立方毫米颗粒，加入0.1% II型胶原酶后，放置于37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中孵育lh，得到的骨片即为接种物。骨髓加骨片法的接种物为对股骨破碎液进行离心得到的沉淀，所述股骨破碎液是将同一只C57BL/6小鼠离体的另一根股骨(是完整的股骨，不除去骨髓)于缓冲液中破碎至I立方毫米颗粒得到的混合物。
[0042]本实施例比较了三种分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法MSC克隆出现时间、大小及数量；流式细胞术检测细胞免疫表型；并进行成骨、成脂分化鉴定。结果表明骨髓加骨片法出现的MSC克隆时间最早，克隆数量最多，第四天克隆数为20±4个/根股骨；骨片消化法为11.5 ±2.5个/根股骨；全骨髓贴壁法最少，为9.5± 1.5个/根股骨。到第三代时，骨髓加骨片法获得细胞数量最多，是全骨髓贴壁法和骨片消化法的两倍。骨髓加骨片法获得的第三代细胞为梭形细胞。流式结果显示，骨髓加骨片法获得的第三代细胞高表达干细胞标志之一 Sca-1，高表达⑶44、⑶29，不表达白细胞表面抗原⑶45和内皮细胞标志⑶31等；髓加骨片法获得的第三代细胞在成骨诱导体系和成脂诱导体系中能分别向成骨细胞和脂肪细胞分化，具典型的MSC特性。
[0043]具体实验方法和实验结果如下:
[0044]I材料和方法
[0045]1.1实验动物
[0046]健康C57BL/6小鼠，3~4周龄，雌雄不限，由军事医学科学院动物中心提供。
[0047]1.2MSC的分离培养
[0048]实验重复三次，每次重复取I只颈髓离断处死C57BL/6小鼠，75%乙醇浸泡5min，无菌条件下取小鼠双侧股骨，无菌剪钝性剥离肌肉，将肌肉分离干净的股骨(完整股骨)放入0.01M、pH7.2-7.4的PBS (磷酸盐缓冲液)中。取一侧股骨剪开股骨干骺端，暴露骨髓腔，用Iml注射器吸取0.01M、pH7.2-7.4的PBS反复冲洗该一侧股骨骨髓腔，冲出的骨髓全部放于一只1.5mlEP管中，用枪尖轻轻吹打制成单细胞悬液，将该EP管以400g离心5min，弃上清液，沉淀即为全骨髓贴壁法(简称BM)的接种物，取全部沉淀用Imla-MEM完全培养液(在a-MEM培养液中加入胎牛血清、青霉素和链霉素，至胎牛血清的体积百分浓度为10%胎牛血清、青霉素的浓度为10万单位每升、链霉素的浓度为10万单位每升得到的液体)重悬细胞种于6孔板中的一个孔中为全骨髓组(ΒΜ)。将该冲出骨髓后剩余的股骨(将完整的股骨的骨髓去除后剩余的那部分)全部在装有0.01Μ、ρΗ7.2-7.4的PBS的1.5mlEP管中剪碎至I立方毫米颗粒，加入Iml0.1% II型胶原酶后，放置于37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中孵育Ih得到骨片，该骨片即为骨片消化法(简称Bone)的接种物，然后用0.01M、PH7.2-7.4的PBS洗涤全部骨片三遍后，将全部骨片用上述Iml a -MEM完全培养液重悬后种于6孔板中的第二个孔中，为骨片消化组(Bone);将该同一只小鼠的另一侧股骨(完整股骨，不除去骨髓)在装有0.01Μ、ρΗ7.2-7.4的PBS的1.5mlEP管中全部剪碎至I立方毫米颗粒，将该EP管以400g离心5min，吸出上清，沉淀即为骨髓加骨片法(简称BM+Bone)的接种物，将全部沉淀用上述Iml a -MEM完全培养液重悬后种于该6孔板的第3个孔中，为骨髓加骨片组(BM+Bone)。同种方法各做三个复孔，于37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养。48h后半量换液(用上述a-MEM完全培养液进行换液)，72h后全量换液(用上述a-MEM完全培养液进行换液)，以后每2-3天换液一次(用上述a -MEM完全培养液进行换液),在倒置显微镜下逐日观察细胞生长情况，当细胞生长铺满板底80~90%时使用0.25%胰蛋白酶(含0.0296EDTA)对细胞(原代细胞，第一代细胞)进行消化计数，按1:2比例接种于新的6孔板中进行第一次传代。第一次传代的细胞于37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养。48h后半量换液(用上述a -MEM完全培养液进行换液)，72h后全量换液(用上述a -MEM完全培养液进行换液)，以后每2-3天换液一次(用上述a -MEM完全培养液进行换液),在倒置显微镜下逐日观察细胞生长情况，当细胞生长铺满板底80~90%时使用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)对细胞(第二代细胞)进行消化计数，按1:2比例接种于新的6孔板中进行第二次传代。第二次传代的细胞于37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养。48h后半量换液(用上述a -MEM完全培养液进行换液)，72h后全量换液(用上述a -MEM完全培养液进行换液)，以后每2-3天换液一次(用上述a -`MEM完全培养液进行换液),在倒置显微镜下逐日观察细胞生长情况，当细胞生长铺满板底80~90%时，得到第三代细胞。
[0049]1.3MSC形态学观察
[0050]在倒置显微镜上逐日观察细胞的生长状况和形态变化特点，在第一次传代之前数集落数并拍照，以后传代之前也拍照记录。
[0051]1.4MSC的免疫表型鉴定
[0052]取生长状态良好消化后的第3代细胞，PBS洗一遍后悬成IxlO6个/ml单细胞悬液，200μ1/ΕΡ 管，分别加入突光标记抗体:FITC ant1-mouse CD45、APC ant1-mouse 1-A/1-E、PerCP ant1-mouse/human CD44APC ant1-mouse/rat CD29 和 PerCP ant1-mouse Ly-6A/E(Sca-1)0 4°C孵育30min后PBS洗去未标记抗体，应用流式细胞仪分析样品中相应标记抗原的阳性表达率。
[0053]1.5MSC的体外成骨分化诱导
[0054]取第三代细胞接种至48孔板中，每孔细胞数为2 X IO4个，每组都设3复孔，每孔加入400 μ I上述a -MEM完全培养液，放入37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养。细胞过夜贴壁后，吸去培养液，加入400 μ I/孔的成骨诱导分化完全培养液(HG-DMEM培养液含10%胎牛血清及10_7M地塞米松，IOmMβ -磷酸甘油，50 μ M磷酸化维生素C)。对照组用HG-DMEM培养液(含10%胎牛血清)。每3天换液，I周后，进行ALP (碱性磷酸酶)染色，2周后，进行Von Kossa染色。
[0055]1.6MSC的体外成脂分化诱导
[0056]取第三代细胞接种至48孔板中，每孔细胞数为2 X IO4个，每组都设3复孔，每孔加入400 μ I上述a -MEM完全培养液，放入37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养。细胞过夜贴壁后，吸去培养液，加入400 μ I/孔的成脂诱导分化完全培养液(HG-DMEM培养液含10%胎牛血清及IO-6M地塞米松，10ng/ml胰岛素，0.5 μ M ΙΒΜΧ)。对照组用HG-DMEM培养液(含10%胎牛血清)。每3天换液，I周后，进行油红O染色。
[0057]1.7统计学方法
[0058]使用SPSS16.0软件，数据采用均数土标准差(T 土 S )表示，组间比较采用t检验，以P〈0.05为差异有统计学意义。
[0059]2 结果
[0060]2.1MSC的分尚培养
[0061]全骨髓组(BM)骨髓细胞接种于6孔板48h在培养液中以悬浮圆形细胞为主，混有大量更为细小圆形的造血系细胞；骨片消化组(Bone)骨片接种于6孔板中48h未见细胞悬浮；骨髓加骨片组(BM+Bone)接种于6孔板48h在培养液中以悬浮圆形细胞为主，混有大量更为细小圆形的造血系细胞。48h半量`换液后可见三组均有少量细胞贴壁,呈集落状,细胞形态不规则，有长梭形，有多角形等，全骨髓组(BM)和骨髓加骨片组(BM+Bone)还可见一些圆形贴壁细胞，而全骨髓组(BM)中圆形贴壁细胞尤为多。接种于6孔板72h (第一次换液后24h)可见每组贴壁细胞集落数均有增加，但是骨髓加骨片组(BM+Bone)增加更为显著(图1中A);统计每组集落数，全骨髓组(BM)、骨片消化组(Bone)、骨髓加骨片组(BM+Bone)分别为9.5± 1.5个/根股骨、11.5±2.5个/根股骨、20±4个/根股骨(图1中B)。原代培养5天(接种5天)，骨髓加骨片组(BM+Bone)细胞可达80%-90%融合，骨片消化组(Bone)次之，全骨髓组(BM)最少，这时细胞主要呈长条状纺锤形，整体排列趋于规律呈漩涡状。消化细胞并取相同细胞量检测CD45表达水平，发现全骨髓组(BM)中CD45阳性细胞最多，达78.6%，骨髓加骨片组(BM+Bone)次之为10.6%，而骨片消化组(Bone)最少，仅2.66%(图1中C)。随着细胞传代次数增多，细胞由培养早期的混合性细胞群，逐渐变为形态相对均一的梭形细胞(图2中A)，收集细胞并计数，骨髓加骨片组(BM+Bone)收获细胞数最多(图2中B)。第二代细胞(P2)和第三代细胞(P3)中，骨髓加骨片组(BM+Bone)的细胞数量是全骨髓组(BM)和骨片消化组(Bone)的两倍，骨髓加骨片组(BM+Bone)的第二代细胞数是5.3±0.14个/根股骨，骨髓加骨片组(BM+Bone)的第三代细胞数是12.5±3.5个/根股骨。
[0062]2.2MSC的表型鉴定
[0063]分别收集全骨髓组(BM)、骨片消化组(Bone)及骨髓加骨片组(BM+Bone)的第三代细胞进行表型鉴定。流式结果显示(图3)，各组细胞高表达干细胞标志之一 Sca-Ι，高表达粘附分子⑶44和⑶29 ;不表达MHC II类分子IA/IE，及内皮标志之一⑶31。骨片消化组(Bone)及骨髓加骨片组(BM+Bone)的第三代细胞不表达造血细胞标志之一⑶45，而全骨髓组(BM)的第三代细胞仍有5%的⑶45阳性细胞。
[0064]2.3MSC的成骨及成脂功能鉴定
[0065]收集骨髓加骨片组(BM+Bone)的第三代细胞进行成骨及成脂分化鉴定，如图4显示，在成骨诱导体系诱导一周后，碱性磷酸酶染色阳性(图4中B)，诱导两周后VonKossa染色阳性(图4中D)，说明骨髓加骨片组(BM+Bone)的第三代细胞分化为成骨细胞；在成脂诱导体系诱导一周后，细胞呈油红O染色阳性(图4中F)，说明骨髓加骨片组(BM+Bone)的第三代细胞分化为脂肪细胞；它们的对照组即未加诱导剂的染色为阴性(图4中A，C，E)。
[0066]本实施例的实验证明髓加骨片组(BM+Bone)的第三代细胞为间充质干细胞。
[0067]实施例2、分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法
[0068]本实施采用了三种分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法，分别为全骨髓贴壁法、骨片消化法和骨髓加骨片法。这三种方法的接种物均来源于同一只C57BL/6小鼠的胫骨。这三种方法的实验方法除将股骨替换为胫骨外，其它均与实施例1同。这三种方法的实验结果均与实施例1无显著 差异。
【权利要求】
1.分离培养动物间充质干细胞的方法，包括将接种物接种于动物细胞培养基中进行原代培养，再将原代培养得到的细胞进行传代培养，得到动物间充质干细胞；其特征在于:所述接种物为对长骨破碎液进行离心得到的沉淀，所述长骨破碎液是将离体的动物长骨于缓冲溶液中破碎至0.5-2立方毫米颗粒得到的混合物； 所述方法不包括用胶原酶消化的步骤，所述方法不除去所述动物长骨的骨髓。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述动物为脊椎动物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述脊椎动物为哺乳动物。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述接种物为按照权利要求5-8中任一所述的方法制备的用于分离培养动物间充质干细胞的接种物。
5.制备用于分离培养动物间充质干细胞的接种物的方法，包括: 1)将离体的 动物长骨于缓冲溶液中破碎至0.5-2立方毫米颗粒得到长骨破碎液； 2)将步骤I)得到的长骨破碎液进行离心，取沉淀，该沉淀即为用于分离培养动物间充质干细胞的接种物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述动物为脊椎动物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述脊椎动物为哺乳动物。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述长骨为股骨或/和胫骨。
9.由权利要求5-8中任一所述的方法制备的用于分离培养动物间充质干细胞的接种物。
【文档编号】C12N5/0775GK103525761SQ201310464090
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】江小霞, 毛宁, 杨燕美, 李红, 党瑞杰, 张雷, 李萍, 刘元林 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所